關鍵詞煙草培養(yǎng)基；津巴布韋煙葉；宏基因組；優(yōu)勢微生物群落

中圖分類號 文獻標識碼A

文章編號 0517-6611（2025）08-0001-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.08.001

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

AbstractIndetetrentifytedominantmrorganssonthelaesofZmbabweantbacctobcoompoentsaoctatios （volume fractions） of 0 % 2 . 5 % 5 . 0 % and 1 0 . 0 % were added to simulate the microbial growth environment on the surface of tobacco leaves ， toscreentheoncetratooftbaccoeavessitableficoialgowthtoexploesiableobacocuemedmpreparatioodiiost analyzetheesipooffbctcatistatedf cificmicrorgansms.Thesultssowedthatorespeificmicrobalcommunitiescouldbeisolatedenthetbaccoleafculturemedimwas adjusted to at concentrations of 2 . 5 % and 5 . 0 % after sterilization.Metagenomic sequencing technology was used to determine the communitydistributionofmicrorgansmsontesufaceof tobaccoleavesin Zimbabwe.ItwasfoundtatBacilusadaighrelativeabundancin the culture medium at concentrations of 0 % ， 2 . 5 % and 5 . 0 % ，and after the addition of tobacco to the culture medium，Terribacillus became the dominant species.The genera with higher relative abundance on tobacco culture medium at concentrations of 2 . 5 % and 5 . 0 % included Piscibaillu，Amplsiohd，sofateof were identified，such as Bacillus species of the genus Bacillus，Bacillus veleis and Bacillus subtilis.

Key wordsTobacco-containing medium； Zimbabwean tobacco；Metagenomics；Dominant microbial community

煙草發(fā)酵是提升煙草品質的重要過程，未發(fā)酵的煙葉具有刺激性氣味，而發(fā)酵會改善煙葉的香氣和口感，利于制成煙草產品[1]。微生物在煙葉發(fā)酵過程中對于形成獨特香味具有至關重要的作用。煙草發(fā)酵過程中的微生物種類較豐富，優(yōu)勢微生物有細菌、霉菌和放線菌，細菌數量最多，霉菌數量次之[2-3]。許多研究表明，微生物在煙葉表面的生長加速了煙葉的發(fā)酵，并關聯著發(fā)酵的強度和質量[4-6]。此外，不同產地的煙葉往往有不同的香氣，可能也是煙葉微生物種群間的交聯作用使得煙葉產生特殊增香氣味[7-9]。目前推測微生物促進煙葉發(fā)酵的方式有： ① 微生物通過代謝煙葉中的致香物質來改善煙葉香氣； ② 微生物自身合成分泌的酶可發(fā)酵分解煙葉中的大分子物質； ③ 微生物的代謝產物激活了煙葉內的酶系統，進而使煙葉中的物質組成發(fā)生變化[10-12]

津巴布韋煙葉是中式卷煙不可或缺的重要原料之一，具有油分足、香氣獨特飄逸、刺激性小等特點[13-14]。若能分離、鑒定、培養(yǎng)出特殊的增香微生物并將其添加于其他煙葉發(fā)酵過程，可顯著提高其他煙葉的增香效果，提升煙草的經濟價值。目前，煙葉表面微生物的培養(yǎng)主要依賴于多種常規(guī)培養(yǎng)基，包括Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基[15]、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基[16-17]、營養(yǎng)肉湯（NB）培養(yǎng)基[18]、營養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基[19等，這些培養(yǎng)基雖然能夠提供微生物生長所需的基本營養(yǎng)物質，如碳、氮、微量元素、無機鹽和水分等，但其營養(yǎng)成分和理化性質與煙葉表面的實際環(huán)境存在明顯差異。這種差異可能導致煙葉原始微生物群落的生長受到抑制，進而影響微生物分離的特異性和代表性。為更好地模擬煙葉表面的微生態(tài)環(huán)境，研究者開發(fā)了基于煙末浸提液的培養(yǎng)基[10，20-22]，但這種液態(tài)培養(yǎng)方式與煙草實際生產中的固態(tài)發(fā)酵過程仍存在較大差異，難以完全再現自然狀態(tài)下的微生物生長環(huán)境。該研究通過在LB固體培養(yǎng)基中加入破碎的煙草勻漿改良培養(yǎng)基配方，比較不同濃度煙草培養(yǎng)基及煙草培養(yǎng)基配制流程對微生物生長的影響，更好地模擬煙草表面微生物生長環(huán)境，分離獲得更為接近煙葉自然狀態(tài)中存在的微生物組分。此外，該試驗還利用宏基因組測序技術，分析添加煙葉成分的培養(yǎng)基與未添加煙葉成分的培養(yǎng)基在微生物群落結構上的差異，并通過分離鑒定獲得了優(yōu)勢菌株，為進一步的增香種鑒定和增香物質篩選提供數據支撐和材料。

1材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1試材。供試煙草品種為2019年的陳化津巴布韋煙葉#60L10，由廣東中煙工業(yè)有限公司提供

1.1.2主要試劑。胰蛋白肺（賽默飛，LP0042）；酵母提取物（賽默飛， ）；瓊脂粉（生工生物，A505255）；氯化鈉（生工生物，A501218）；十二烷基硫酸鈉（生工生物，A500228）。1.1.3主要儀器。Westinghouse西屋牌破壁料理機（WFB-A617）；恒溫培養(yǎng)箱（力辰科技公司，LICHENHHSH-L800）；恒溫搖床（艾本德，AGI26）；PCR儀（賽默飛，LIFETechnolo-giesVeritiFast96）。

1.2 試驗方法

1.2.1不同比例煙葉培養(yǎng)基的制備。除去陳化煙葉的莖脈組織，稱取相應質量的煙葉，加入對應體積的蒸餾水，用破壁機均勻破碎，按比例加入LB固體培養(yǎng)基其他成分，混勻后進行滅菌，滅菌前或者滅菌后調節(jié) 至7.0左右，搖勻，倒置平板。

1.2.2煙葉表面微生物的洗脫及培養(yǎng)。稱取 煙葉，用滅菌剪刀將其剪碎之后，置于 無菌蒸餾水中，加入0 . 1 % （即 ）的十二烷基硫酸鈉（SDS）均勻混合，于 的搖床中搖勻 ，得到菌原液[20]。采用平板涂布法進行涂板，取菌原液 ，分3次（30、30、 ）均勻涂布，將培養(yǎng)皿置于 培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng) 統計各組的細菌菌落數量及種類。

1.2.3微生物基因組DNA的提取及宏基因組測序。收集培養(yǎng) 的各組菌落平板各9個，其中每3個平板富集的菌落為一個重復，每組各設置3個重復。微生物基因組提取、PCR擴增、文庫構建、上機測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，簡要過程如下：稱取 菌粉，用E.Z.N. Mag-BindSoilDNAKit提取試劑盒（OMEGA）進行DNA提取，檢測DNA的濃度并進行電泳檢測DNA質量。進一步利用Hieff NGS @MaxUp II DNA Library Prep Kit for Illumi-na試劑盒構建二代測序文庫，并在華大DNBSEQ-T7平臺上完成測序分析。

1.2.4宏基因組數據分析。宏基因組數據分析由生工生物工程（上海）股份有限公司負責。使用 vegan進行基因組多樣性分析。使用DIAMOND將基因集蛋白序列與Nr數據庫進行蛋白同源性比對，得到功能注釋和同源物種信息，篩選條件為 。同時根據NCBI的微生物分類學信息數據庫，獲得基因的物種分類注釋信息，并在界（Kingdom）、門（Phylum）、綱（Class）、目（Order）、科（Fami-ly）、屬（Genus）、種（Species）各個分類學水平上統計物種的相對豐度。使用DIAMOND將基因集蛋白序列與KEGG數據庫進行比對，得到序列對應的KEGGORTHOLOGY（KO）號，根據KO與Pathway數據庫和Module數據庫的聯系得到序列的注釋信息。

1.2.5煙葉表面微生物的分離純化。挑取煙草培養(yǎng)基平板上具有不同形態(tài)特征（如菌落大小、顏色、邊緣清晰度、菌落是否黏稠等）的單菌落進行平板劃線并培養(yǎng) ，觀察單菌落大小。

1.2.616SrDNA測序鑒定菌株。挑取針尖大小的單菌落于PCR 管中，加入 裂解液，利用PCR儀進行裂解，程序為 。裂解完成后，進行16SrRNA片段的PCR擴增，引物為16S-27F（ - AGAGTTTGATCCTG-GCTCAG - ）和16S-1492R（ -TACGGCTACCTTGT-TACGACTT- ）。PCR反應體系： T a q 酶（ ） 上下游引物（ 各 （ 模板（ ） 、 （ ）） ，單一條帶的PCR產物由生工生物工程（上海）股份有限公司進行Sanger測序。

1.2.7菌株的序列分析與保種。對分離得到菌株的測序結果與NCBI Basic Local Alignment Search Tool數據庫中的16SrDNA基因信息進行比對，確定其物種種類。對鑒定后的菌株進行保種，選取各菌株加至 LB培養(yǎng)液中，在 搖床中培養(yǎng) 左右，將菌種置于甘油管中，于 冰箱中保存。

1.3數據處理采用Microsoft Excel和GraphPad Prism軟件對試驗數據進行分析，包括不同濃度煙草培養(yǎng)基的菌落生長狀況的對比、不同 調節(jié)情況下培養(yǎng)基菌落生長狀況的對比、不同濃度煙草培養(yǎng)基的菌種富集情況對比。繪圖采用GraphPadPrism軟件以及Chiplot在線繪圖工具（https：//www.chiplot.online/）。

2 結果與分析

2.1不同濃度煙草培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果為評估不同濃度煙草培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果，該研究通過菌落計數法對培養(yǎng)基表面微生物的生長情況進行定量分析。每個濃度的平板在滅菌后調pH至7.0左右，然后涂布等體積的煙葉菌原液，在相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng) 。結果顯示（圖1和表1），對照組培養(yǎng)基（ 0 % 煙草培養(yǎng)基）的菌落數量最高，達到 。隨著培養(yǎng)基中煙葉成分的增加，菌落數量明顯下降， 2 . 5 % 煙草培養(yǎng)基的菌落數量為50CFU， 5 . 0 % 煙草培養(yǎng)基的菌落數量進一步減少至 。而當煙草培養(yǎng)基濃度達到 1 0 . 0 % 時，培養(yǎng)基表面未觀察到無肉眼可見的菌落形成。這一現象可能歸因于以下2個因素： ① 高濃度煙草成分可能對微生物生長產生抑制作用； ② 隨著煙草添加量的增加，煙葉破碎程度不足導致培養(yǎng)基表面形貌粗糙化，影響菌液的均勻涂布?；谏鲜鲈囼灲Y果， 2 . 5 % 和 5 . 0 % 煙草培養(yǎng)基在保持良好表面形貌（有利于菌液均勻涂布）和適宜菌落數量（便于觀察和統計）方面表現出最佳平衡，因此被選定為后續(xù)試驗的培養(yǎng)條件。

2.2培養(yǎng)基滅菌前后調節(jié) 對煙草培養(yǎng)基培養(yǎng)效果的影響在培養(yǎng)基優(yōu)化過程中，該研究考察了 調節(jié)時機（滅菌前或滅菌后）對培養(yǎng)效果的影響。為控制試驗變量，采用0 % 煙草培養(yǎng)基作為對照，并在調節(jié)煙草培養(yǎng)基 的同時向培養(yǎng)基中加入等體積無菌水以排除操作干擾。培養(yǎng) 后，菌落計數結果顯示（圖2），在 0 % 煙草培養(yǎng)基中，滅菌前調節(jié) 組和滅菌后調節(jié) 組的菌落數量分別為99和105CFU，兩組間無顯著差異（ ）。但在含煙草成分的培養(yǎng)基中觀察到顯著差異， 2 . 5 % 煙草培養(yǎng)基滅菌前和滅菌后調節(jié)pH組的菌落數量分別為 $3 3 . 4 6 ～ ＼mathrm { C F U } ； 5 . 0 ＼%$ 煙草培養(yǎng)基中，滅菌前和滅菌后調節(jié) 組的菌落數量分別為25和36CFU。統計分析表明， 2 . 5 % 和 5 . 0 % 煙草培養(yǎng)基中，滅菌前后調節(jié) 對菌落數量的影響均具有統計學顯著性（ ）。上述結果表明，滅菌后調節(jié) 至7.0更有利于煙草表面微生物的生長繁殖，可獲得更優(yōu)的培養(yǎng)效果?；诖?，后續(xù)試驗均采用滅菌后調節(jié) 至7.0的培養(yǎng)條件。

Fig.1Growth statusand morphologyof bacterial colonies onthesurface of diferentconcentration tobacco culture media

注： 0

2.3煙草表面微生物在屬和種水平上的豐度分析為整合各組重復間的所有菌落基因信息，將3次重復的測序結果整合，總共分為3組 （ 0 % ， 2 . 5 % ， 5 . 0 % ）。對測序所得原始數據進行過濾，過濾后數據占樣本所有數據比例超過 9 9 % ，堿基質量在Q20以上的比例超過 9 8 % ，堿基質量在Q30以上的比例超過 94 % ，說明數據可靠，可用于后續(xù)分析?？傮w來看，3種培養(yǎng)基平板上生長的微生物基本為細菌，真菌的豐度很低，基本可以忽略不計，因此推測增香種大概率為細菌。該研究選取屬水平和種水平對不同濃度煙草培養(yǎng)基表面細菌微生物進行分析。

圖3A展示了基于屬水平分類的各組培養(yǎng)基微生物群落相對豐度分布。通過比較3種不同濃度煙草培養(yǎng)基的微生物組成，可以觀察到明顯的群落結構差異。從整體群落組成來看，芽孢桿菌屬（Bacilus）在3種煙草培養(yǎng)基中均表現出最高的相對豐度，表明該屬微生物對培養(yǎng)基環(huán)境具有廣泛的適應性。值得注意的是，對照組（ 0 % 煙草培養(yǎng)基）中相對豐度次高的類群為普里斯特氏菌屬（Priestia），而在 2 . 5 % 和 5 . 0 % 煙草培養(yǎng)基組中，土地芽孢桿菌屬（Terribacillus）取代普里斯特氏菌屬成為第二優(yōu)勢菌群。不同培養(yǎng)基上相對豐度第二高的屬的差異也說明煙草培養(yǎng)基具有較好的篩選作用，在一定程度上抑制了普里斯特氏菌屬菌種的生長，更利于土地芽孢桿菌屬菌種的繁殖，因此土地芽孢桿菌屬中極大可能包含著增香種。而芽孢桿菌屬作為相對豐度最高的優(yōu)勢菌群，即使添加了煙草成分依舊不會影響其生長，其中必然存在著與煙草發(fā)酵密切相關的菌種，因此也可能從中找到增香種

圖3B是以種為分類單位展示了3種煙草培養(yǎng)基上各微生物的相對豐度。其中，沙福芽孢桿菌（Bacillussafensis）在0 % 煙草培養(yǎng)基中相對豐度最高，但隨著煙草成分的增加，其相對豐度不斷下降，在 5 . 0 % 煙草培養(yǎng)基中相對豐度已很少，說明煙草成分的加入反而使其生長受到抑制。在培養(yǎng)基中添加煙草成分后相對豐度下降的菌種還有巨大普里斯特氏菌（Priestiamegaterium）短小芽孢桿菌（Bacilluspumilus）。未分類的芽孢桿菌（unclassifiedBacillusspecies）在各個培養(yǎng)基中的相對豐度則基本相同，說明煙草成分的加入不會影響它的生長。而枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）、貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezensis）解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamylolique-faciens）和嗜鹽土地芽孢桿菌（Terribacillushalophilus）在煙草培養(yǎng)基上的相對豐度有明顯提升，說明它們更適應煙草培養(yǎng)基環(huán)境。

除此之外，在 2 . 5 % 和 5 . 0 % 煙草培養(yǎng)基中，毛竹林土地芽孢桿菌（Terribacillusgoriensis）嗜糖土地芽孢桿菌（Terribacil-lussaccharophilus）、特基拉芽孢桿菌（Bacillustequilensis）、

7520-G土地芽孢桿菌（Terribacillussp.7520-G）得到了富集，相對豐度都有一定的上升，也是潛在的可培育優(yōu)勢種，其中可能也包含著使津巴布韋煙葉具有特殊香氣的增香種。

2.4煙草培養(yǎng)基特有微生物在屬和種水平上的數量分析通過宏基因組測序可探究煙草表面微生物的群落分布特征，發(fā)現并鑒定出其中相對豐度較高的微生物種類，并且可通過橫向比較不同濃度煙草培養(yǎng)基上微生物的群落分布狀況和優(yōu)勢種差異，為增香種的分離純化提供理論依據。如表2所示，宏基因組測序結果發(fā)現部分微生物種屬只存在于2 . 5 % 和 5 . 0 % 煙草培養(yǎng)基，說明煙草培養(yǎng)基篩選培育出了部分不能在LB固體培養(yǎng)基上生存的津巴布韋煙葉表面微生物。其中在 2 . 5 % 和 5 . 0 % 煙草培養(yǎng)基上相對豐度較高的屬有魚芽孢桿菌屬（Piscibacillus）雙芽孢桿菌屬（Amphibacillus）、Margalitia等。并且 2 . 5 % 和 5 . 0 % 煙草培養(yǎng)基分別存在特有的微生物種屬。相比 2 . 5 % 煙草培養(yǎng)基， 5 . 0 % 煙草培養(yǎng)基特有的菌種更多。 2 . 5 % 煙草培養(yǎng)基中特有的微生物在屬水平上的個數為4個，而 5 . 0 % 煙草培養(yǎng)基特有菌種在屬水平上的個數可達44個（圖4）。但這些煙草培養(yǎng)基中特有菌種的相對豐度往往較低， 5 . 0 % 煙草培養(yǎng)基是否具有更高的群落多樣性仍需要更進一步的數據分析。

進一步對 2 . 5 % 煙草培養(yǎng)基（ 2 . 5 % 組和 5 . 0 % 煙草培養(yǎng)基（ 5 . 0 % 組）特有與對照組（ 0 % 煙草培養(yǎng)基）的菌種進行分析。如表2所示， 2 . 5 % 組和 5 . 0 % 組共同特有的菌種包括Ba-cillaceae bacterium SAS-127 、Cohnella abietis、Oceanobacillus sp.Castelsardo等共57種。 2 . 5 % 組中特有的菌種有某種未分類的嗜鹽芽孢桿菌（unclassified Halobacillus species）泛酸枝芽胞桿菌（Virgibacilluspantothenticus）Alkalihalobacillusalcalo-philus等共33種。 5 . 0 % 組中特有的相對豐度較高的菌種有PenicilliumbrasilianumPenicilliumsubrubescensPenicilliumde-cumbens等共231種。因此，種水平上的結果與屬水平上的相似，同樣是 5 . 0 % 組存在更多特有菌種。但各組獨有的種相對豐度依舊不高，在 0 . 1 % 左右。

Fig.4Venn diagram of species number on diferent concentration tobaco media at genus （A）and species （B）levels

2.5煙草表面相對豐度較高微生物的分離鑒定通過宏基 因組數據分析發(fā)現，部分菌種在添加了煙葉成分的煙草培養(yǎng)

基中有更好的生長狀況，而這些被煙草培養(yǎng)基成功富集的菌種也可能是潛在的增香種。盡管不是每種被富集的菌種都可以被培養(yǎng)，但是相對豐度高的富集菌種中也大概率存在增香種。為了進一步鑒定具體的菌落種屬，從煙草培養(yǎng)基中挑取并分離純化出單菌落，再對單菌落進行16SrDNA序列擴增和測序分析。

表3顯示的是目前已分離純化并且鑒定出的菌種，一共有15種。其中包括了多種在3種培養(yǎng)基中都有較高相對豐度的菌種，如芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等。同時，也鑒定出了部分在煙草培養(yǎng)基中生長狀態(tài)良好、相對豐度較 0 % 組有所增加的細菌，如解淀粉芽孢桿菌和嗜鹽土地芽孢桿菌。而土地芽孢桿菌屬在煙草培養(yǎng)基上微生物群落中的相對豐度有明顯上升，也成功挑取鑒定出了4種土地芽孢桿菌屬的菌種。

3討論

上述研究表明，培養(yǎng)基中煙草成分的添加量在 2 . 5 % 和5 . 0 % 會有較好的培養(yǎng)效果，而添加量達到 1 0 . 0 % 時，在表面無法形成菌落；其原因可能是添加煙草成分會降低培養(yǎng)基pH（煙草的 普遍在 ，普通的LB 固體培養(yǎng)基 為7.0左右），最終導致 過低而不適宜微生物生長。在滅菌后將培養(yǎng)基的 統一調至 7 . 0 ， 1 0 . 0 % 煙草培養(yǎng)基可能也會因煙葉破碎釋放出的有毒物質濃度過高，從而抑制微生物的生長，表現出很不理想的菌落生長效果。此外， 1 0 . 0 % 煙草培養(yǎng)基因加入煙草量過多，不能很好地將煙葉破壁成細小的顆粒，導致培養(yǎng)基表面凹凸不平，不利于菌液的涂布和菌落的生長?？偠灾?，培養(yǎng)基中煙葉添加量在 2 . 5 % 和 5 . 0 % 是有較好的培養(yǎng)效果，但煙草濃度為 5 % ～ 1 0 % 的煙草培養(yǎng)基是否能培育出具有更高的多樣性群落還需進一步的試驗驗證。對于培養(yǎng)基配制過程中因 調節(jié)操作在滅菌前還是滅菌后的順序產生的培養(yǎng)效果差異，可能是煙葉中的某些成分在高壓蒸汽滅菌過程中發(fā)生了反應變化，導致原本調節(jié)至 的培養(yǎng)基pH又產生了變化，使得培養(yǎng)效果下降；另一種可能是預先將pH調至7.0，可能為煙草中某些成分的反應提供了條件，在高溫作用下發(fā)生反應，使得部分營養(yǎng)物質被消耗，最終的煙草培養(yǎng)基成分發(fā)生改變。而具體的原因需要進一步的試驗證明。

宏基因組測序分析結果顯示，在3種不同濃度煙草培養(yǎng)基中，芽孢桿菌屬（Bacillus）均為相對豐度最高的菌屬，這一發(fā)現與韓錦峰等[3和邱立友等[2的研究結果一致。然而，在次優(yōu)勢菌屬方面，該研究結果與先前研究存在差異，在該研究中， 2 . 5 % 和 5 . 0 % 煙草培養(yǎng)基的次優(yōu)勢菌屬為土地芽孢桿菌屬（Terribacillus）， 0 % 煙草培養(yǎng)基的次優(yōu)勢菌屬為普里斯特氏菌屬（Priestia）；相比之下，韓錦峰等[3]和邱立友等[24]的研究中次優(yōu)勢菌屬為梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium）或芽孢乳桿菌屬（Sporolactobacillus）。這種差異可能源于研究所用煙葉品種的不同，韓錦峰等使用的是河南省的NC89品種煙葉，邱立友使用的是來自不同產地的紅大、NC89和 也有研究表明，不同品種煙葉的表面微生物群落組成存在顯著差異[20，25]，這可能是導致研究結果不一致的主要原因。上述結果均證明，使用津巴布韋煙草培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，對于篩選煙葉表面特有微生物是可行的。此外，新型煙草培養(yǎng)基能夠篩選出某些在LB固體培養(yǎng)基上無法生存的菌種，但其相對豐度均不高。其中可能的原因有： ① 那些被篩選出的菌種在煙葉表面的含量較少，在煙葉發(fā)酵過程中作用較為有限；② 煙草培養(yǎng)基中煙葉成分的配比仍不夠理想，使得某些菌株在培養(yǎng)基上生長緩慢。值得注意的是， 5 . 0 % 組中前3個相對豐度較高的菌種皆為青霉菌屬的真菌，而不是細菌，且在界水平上 5 . 0 % 煙草培養(yǎng)基上生長有古菌，表現出 5 . 0 % 煙草培養(yǎng)基上微生物種類的廣度，其中涵蓋的微生物種類較大。

該試驗還對部分煙草表面微生物進行了分離純化和鑒定操作，最終鑒定得到15種菌株。其中涵蓋了大部分的優(yōu)勢種和煙草培養(yǎng)基中的富集種，也可能包含煙草增香種。參考殷爽等[20的研究結果，該試驗也分離得到了枯草芽孢桿菌，但大多數分離得到的菌種都不太相同，可能是因為煙葉種類不同。雖然趙銘欽[\"]的研究結果中分離得到不少芽孢桿菌屬的菌種，但與該試驗的分離結果相同的菌種也只有枯草芽孢桿菌。而使用同種津巴布韋煙葉且對煙葉表面微生物種進行分離和鑒定的研究仍較少，因此無法參考比較。此外該試驗篩選分離操作是在煙草培養(yǎng)基上進行的，也會對菌種分離鑒定結果造成一定影響。試驗結果中分離得到的菌種后續(xù)可繼續(xù)進行發(fā)酵檢測，進一步驗證其在煙葉物質轉變中的作用，后續(xù)也應分離出更多種類的煙葉表面微生物，并對其進行發(fā)酵檢測嘗試找出增香種?？傊?，該研究結合宏基因組測序和微生物分離得到的不同組別的菌群分布差異和優(yōu)勢菌種可為后續(xù)煙草增香種的分離純化試驗提供有力的數據支撐和理論依據。

4結論

在LB固體培養(yǎng)基中添加濃度為 2 . 5 % 和 5 . 0 % 的煙草成分具有較好的微生物培養(yǎng)效果，在擁有良好的表面形貌的同時，有較好的菌落生長狀況。將調節(jié) 步驟放至滅菌操作后制成的煙草培養(yǎng)基，比滅菌操作前調節(jié) 制成的煙草培養(yǎng)基有更好的培養(yǎng)效果。宏基因組測序結果也說明津巴布韋煙葉表面的微生物主要是細菌，優(yōu)勢屬為芽孢桿菌屬。此外，土地芽孢桿菌屬在煙草培養(yǎng)基上得到了富集。非煙草培養(yǎng)基和煙草培養(yǎng)基上菌群種類的差異說明煙草培養(yǎng)基具有一定的篩選作用，能篩選出部分LB固體培養(yǎng)基無法培養(yǎng)的菌種。進一步通過單菌落分離純化和16SrDNA測序，鑒定出15種煙葉表面優(yōu)勢微生物，如芽孢桿菌屬的芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等。

參考文獻

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