摘""要：橡膠樹次生體胚循環(huán)增殖技術實現(xiàn)了橡膠樹體胚苗（自根幼態(tài)無性系）規(guī)模化繁育。該技術需要將子葉胚切成2"mm×2"mm的胚塊，傷口部位會產生大量的乙烯及活性氧，培養(yǎng)過程中也會形成較多乙烯和活性氧，乙烯及活性氧對橡膠樹體胚發(fā)生產生不利影響。硝酸銀（AgNO3）是乙烯抑制劑，同時影響酶的活性。本文研究了不同硝酸銀濃度（0、2.5、5.0、10.0、15.0"mg/L）處理不同時間（7、14、21、28"d）對橡膠樹胚塊褐化及次生體胚發(fā)生的影響，并評估了再生植株的表型及倍性。結果表明：AgNO3可明顯減輕胚塊褐化情況，減少胚塊活性氧的產生，5.0～15.0"mg/L"AgNO3處理較2.5"mg/L效果更好，AgNO3處理21"d較其他3個處理時間效果好；2.5～15.0"mg/L"AgNO3處理7～28"d未顯著增加出胚胚塊數，但5.0"mg/L"AgNO3處理21、28"d，10.0"mg/L"AgNO3處理21"d，15.0"mg/L"AgNO3處理7～21"d子葉胚數顯著高于對照；出胚胚塊數與褐化呈負相關，但未達顯著水平，子葉胚數與褐化呈顯著負相關；AgNO3處理的再生植株表型與對照無明顯差異，染色體倍性與對照相同。本研究結果為提高橡膠樹次生體胚發(fā)生效率提供技術支撐。

關鍵詞：橡膠樹；硝酸銀；褐化；乙烯；體胚誘導中圖分類號：S576""""""文獻標志碼：A

Effect"of"AgNO3"on"Secondary"Somatic"Embryogenesis"in"Hevea"brasiliensis

TIAN"Wen1，2，3，"ZHANG"Ziyu6，"XU"Zhengwei3，4，5，"WANG"Xiaoyi3，4，5，"ZHOU"Quannan3，"JI"Xin6，"WU"Rizhi3，"XIA"Wei1，2*，"HUANG"Tiandai3，4，5*

1."Sanya"Nanfan"Research"Institute，"Hainan"University，"Sanya，"Hainan"572024，nbsp;China;"2."School"of"Tropical"Agriculture"and"Forestry，"Hainan"University，"Haikou，"Hainan"570228，"China;"3."Rubber"Research"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"Haikou"Key"Laboratory"of"Tropical"Plant"Seedling"Innovation"/"Key"Laboratory"of"Rubber"Tree"Biology"and"Genetic"Resources"Utilization，"Ministry"of"Agriculture"and"Rural"Areas"/"Hainan"Provincial"Key"Laboratory"of"Tropical"Crop"Cultivation"Physiology"/"Cultivation"Base"of"State"Key"Laboratory"Jointly"Built"by"Province"and"Ministry，"Haikou，"Hainan"571101，"China;"4."Sanya"Research"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences，"Sanya，"Hainan"572025，"China;"5."National"Key"Laboratory"for"Tropical"Crop"Breeding，"Sanya，"Hainan"572025，"China;"6."College"of"Tropical"Crops，"Yunnan"Agricultural"University，"Pu’er，"Yunnan"665099，"China

Abstract："The"technology"of"secondary"somatic"embryo"cyclic"multiplication"has"realized"the"large-scale"propagation"of"somatic"embryo"plantlets"（self-rooted"juvenile"clones）"of"Hevea"brasiliensis."This"technology"needs"to"cut"the"cotyledon"embryo"into"2"mm×2"mm"pieces."A"large"amount"of"ethylene"and"reactive"oxygen"species"（ROS）"will"be"produced"at"the"wound"site，"and"much"ethylene"and"ROS"will"also"formed"during"culture"process."Ethylene"and"ROS"have"adverse"effects"on"somatic"embryogenesis"of"H."brasiliensis."Silver"nitrate"（AgNO3）"is"an"ethylene"inhibitor"and"also"affects"enzyme"activity."In"this"paper，"the"effects"of"different"AgNO3"concentrations"（0，"2.5，"5.0，"10.0，"15.0"mg/L）"and"different"time"（7，"14，"21，"28"days）"on"the"embryo"block"browning"and"secondary"somatic"embryogenesis"of"H."brasiliensis"were"studied，"and"the"phenotype"and"ploidy"of"regenerated"plantlets"were"evaluated."AgNO3"significantly"reduced"the"browning"of"embryo"blocks"and"the"production"of"ROS."The"effect"of"5-15"mg/L"was"better"than"that"of"2.5"mg/L，"and"the"effect"of"21"days"treatment"was"better"than"that"of"the"other"three"treatments."2.5-15.0"mg/L"AgNO3"treated"7-28"days"did"not"significantly"increase"the"number"of"embryonic"blocks，"but"the"number"of"cotyledon"embryos"in"5.0"mg/L"AgNO3"treated"for"21"and"28"days，"10.0"mg/L"AgNO3"treated"for"21"days，"and"15.0"mg/L"AgNO3"treated"for"7-21"days"were"significantly"higher"than"those"in"the"control."The"number"of"embryonic"blocks"was"negatively"correlated"with"browning，"but"not"significantly，"the"number"of"cotyledon"embryos"was"significantly"negatively"correlated"with"browning."The"phenotype"of"regenerated"plantlets"from"AgNO3"treatments"had"no"obvious"difference"compared"with"the"control，"and"the"chromosome"ploidy"was"the"same"as"the"control."The"results"would"provide"technical"support"for"improving"the"efficiency"of"secondary"somatic"embryogenesis"in"H."brasiliensis.

Keywords："Hevea"brasiliensis;"AgNO3;"browning;"ethylene;"somatic"embryogenesis

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.05.009

巴西橡膠樹（Hevea"brasiliensis）亦稱“三葉橡膠”，為大戟科常綠喬木，原產于巴西亞馬遜森林，是輪胎、絕緣材料、減震材料等的重要工業(yè)原料。橡膠樹的生長周期長達35"a以上，因此種苗質量至關重要。體胚苗（自根幼態(tài)無性系）具有速生、高產等優(yōu)異特性，是第三代新型種苗[1]。HUA等[1]建立了橡膠樹次生體胚循環(huán)增殖技術，實現(xiàn)了橡膠樹體胚苗規(guī)?；庇Ｔ摷夹g以初（次）生胚狀體為外植體，將其切成2"mm×2"mm的胚塊，這些胚塊經過體胚發(fā)生，產生新的胚狀體，即完成胚狀體的增殖。然而切胚產生傷口，造成的細胞膜降解使得原本分離開的酚類物質與多酚氧化酶（polyphenol"oxidase，"PPO）結合，被氧化成褐色的醌類物質[2-3]。此外，傷口部位的細胞同時產生大量的乙烯[4]及活性氧[5]。培養(yǎng)過程中添加的各類生長調節(jié)劑、蔗糖等成分也會對培養(yǎng)物造成非生物脅迫，進而促進乙烯的合成和活性氧的形成[6]。

乙烯是植物的五大類激素之一，幾乎所有的高等植物都能合成微量乙烯。乙烯對再生的影響因物種、基因型及外植體、培養(yǎng)階段而異[6]。在白云杉和胡蘿卜的非胚性愈傷組織中乙烯的含量比胚性愈傷組織高[7]。乙烯促進鐵皮石斛胚性愈傷體積增大，但抑制體胚發(fā)生，抑制效果與濃度呈正相關，高濃度乙烯（5.6"mg/L）的體胚數比對照下降93.33%，幾乎無法誘導體胚發(fā)生[8]。在苜蓿愈傷組織繼代培養(yǎng)時，加入多胺生物合成抑制劑甲基乙二醛雙脒基腙[methylglyoxal"bis"（guanylhydrazone），"MGBG]促進乙烯的生成，抑制了愈傷組織及懸浮系的生長及體胚形成，在體胚誘導階段加入影響更大，加入184"mg/L"MGBG的體胚數為對照的60%（該濃度下乙烯釋放量比對照增加21.1%），而368"mg/L"MGBG則無法誘導體胚發(fā)生（該濃度乙烯釋放量比對照增加36.8%）[9]。苜蓿無色松軟的胚性愈傷組織轉入將愈傷繼代培養(yǎng)基[TDZ（thidiazuron）代替KT（kinetin）]，發(fā)現(xiàn)愈傷組織變綠變硬，出現(xiàn)管狀物和芽原基的分化，其體胚發(fā)生能力喪失，且乙烯合成量升高[10]。但部分植物體胚發(fā)生率與乙烯合成呈正相關，如大豆體胚數隨著乙烯前體ACC（1-aminocyclopro pane-1-carboxylic"acid）增加而增加，隨ACC合成抑制劑AVG（aminoethoxyviny lglycine）增加而下降[6]。

硝酸銀（AgNO3）是乙烯抑制劑，一定濃度一定處理時間對于體胚分化具有促進作用。15"mg/L硝酸銀處理后的蘆薈防褐化率高達90%；培養(yǎng)2周時，未發(fā)生褐化的外植體逐漸誘導出顆粒狀的愈傷組織[11]。在花生幼葉芽再生[12]、油菜花梗植株再生[13]、石榴不定芽再生[14]中也表現(xiàn)出明顯效果。而在有些物種中，與乙烯促進體胚發(fā)生效果相反。AgNO3在顯著降低水曲柳外植體褐化指數和褐化率的同時也顯著降低了體胚發(fā)生率[15]。

切胚產生的活性氧爆發(fā)及組培脅迫過程產生的活性氧也抑制體胚發(fā)生。AgNO3對許多酶的活性有影響。2"mg/L"AgNO3降低了鳳丹牡丹愈傷的褐化程度，進一步研究表明，該處理降低了PPO、過氧化氫酶（CAT）活性，增加了過氧化物酶（POD）的活性[16]。

本文研究AgNO3濃度及處理時間對橡膠樹次生體胚胚塊褐化及體胚發(fā)生的影響，并評估再生植株的表型及倍性，以期進一步提高橡膠樹次生體胚發(fā)生效率。

1""材料與方法

1.1""材料

選擇處于成熟子葉胚階段的熱研73397次生體胚，由位于海南省儋州市的海南天然橡膠新型種植材料創(chuàng)新基地提供。切除子葉胚子葉外圍卷曲、偏薄部位，剩余較厚的子葉在超凈工作臺用無菌手術刀切成2～3"mm的胚塊作為外植體，分別將其均勻接種在添加不同濃度AgNO3的愈傷誘導培養(yǎng)基中，每皿接種12塊外植體。

1.2""方法

1.2.1""試驗設計""共設置AgNO3濃度（0、2.5、5.0、10.0、15.0"mg/L）、AgNO3處理時間（7、14、21、28"d）2個影響因素20個處理。將胚塊接種于添加不同濃度（0、2.5、5.0、10.0、15.0"mg/L）AgNO3的M1[1]培養(yǎng)基中，室溫培養(yǎng)不同時間（7、14、21、28"d），AgNO3處理結束后轉入不添加AgNO3的M1培養(yǎng)基，室溫繼續(xù)培養(yǎng)至28"d后轉入體胚誘導培養(yǎng)基M2[1]，跟蹤不同處理胚塊體細胞胚形成及植株再生情況。每個處理4皿，每皿12個外植體。

1.2.2""橡膠樹胚塊褐化的觀察及統(tǒng)計""每7"d對

經不同AgNO3濃度處理后的胚塊在培養(yǎng)基中的褐化情況進行觀察，直至28"d。

1.2.3""活性氧（ROS）測定""對經不同AgNO3濃度及培養(yǎng)時間處理后的胚塊隨機取樣進行二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，"DAB）染色，觀察并統(tǒng)計其顯色情況，重復2次。

1.2.4""橡膠樹次生體胚的誘導""對轉入M2培養(yǎng)基，60"d后統(tǒng)計子葉胚數、出胚胚塊數。

1.2.5""倍性分析""每個處理取3株再生植株的葉片混合、切碎、解離，采用流式細胞儀進行倍性分析。

1.3""數據處理

試驗數據采用Excel"2023和IBM"SPSS"Statistics"20軟件進行整理、統(tǒng)計和分析。

2""結果與分析

2.1""AgNO3對橡膠樹體細胞胚胚塊組織ROS的影響

橡膠樹次生體胚切胚后部分胚塊切口褐化，部分對培養(yǎng)基反應敏感的胚塊褐化不明顯（圖1A）。DAB在過氧化氫酶的催化下，可與過氧化氫（活性氧的一種）反應并迅速在組織表面形成棕紅色化合物，進而確定活性氧含量。DAB染色明顯看到對照（0"mg/L"AgNO3）胚塊比添加AgNO3的胚塊染色深；2.5"mg/L"AgNO3處理胚塊較5.0～15.0"mg/L"AgNO3處理同樣時間的胚塊染色深；AgNO3處理21"d的胚塊較其他3個處理時間染色淺（圖1B）。染色越深表明活性氧含量越高?？梢姡珹gNO3可明顯減少胚塊培養(yǎng)中活性氧的產生，5.0～15.0"mg/L較2.5"mg/L效果好，處理21"d較其他3個處理時間效果好。

2.2""AgNO3處理對橡膠樹次生體胚發(fā)生的影響

不同AgNO3濃度處理7"d的橡膠樹出胚胚塊數與對照組無顯著差異；2.5～10.0"mg/L"AgNO3處理的子葉型胚狀體數低于對照，15.0"mg/L"AgNO3處理的子葉型胚狀體數高于對照，但均未達顯著水平，15.0"mg/L"AgNO3處理的子葉型胚狀體數顯著高于其他濃度；不同濃度間胚塊在體胚誘導階段褐化程度與對照無明顯差異，濃度間也無明顯差異（表1）。

處理14"d，不同AgNO3濃度處理后橡膠樹出胚胚塊數與對照組無顯著差異；15.0"mg/L"AgNO3處理的子葉型胚狀體數顯著高于對照及其他3個濃度，其他3個濃度處理的子葉型胚狀體數與對照無顯著差異；5.0～15.0"mg/L"AgNO3處理的胚塊在體胚誘導階段褐化程度明顯輕于2.5"mg/L"AgNO3及對照，而2.5"mg/L"AgNO3處理的褐化程度與對照相似（表1）。

處理21"d，5.0"mg/L"AgNO3處理的橡膠樹出胚胚塊數高于其他濃度，但未達顯著水平；而除2.5"mg/L"AgNO3處理的子葉型胚狀體數與對照無顯著差異外，其余AgNO3"濃度誘導的子葉型胚狀體數均顯著高于對照，其中5.0"mg/L"AgNO3誘導的子葉型胚狀體數量最多；2.5"mg/L"AgNO3處理的胚塊褐化程度與對照相似，其余AgNO3濃度處理的褐化程度均明顯低于對照（表1）。

處理28"d，AgNO3處理的橡膠樹次生體胚出胚胚塊數均高于對照，特別是2.5～10.0"mg/L，但未達顯著水平；5.0"mg/L"AgNO3處理的子葉型胚狀體數顯著高于對照及其他濃度，其他3個濃度處理的子葉型胚狀體數與對照無顯著差異；5.0、10.0"mg/L"AgNO3處理的胚塊褐化程度較輕，2.5、15.0"mg/L"AgNO3處理的胚塊褐化程度中等，與對照相似（表1）。

AgNO3處理對出胚胚塊數的影響不大，但對子葉型胚狀體數的影響較大（表1）。低濃度AgNO3需要處理較長時間才能顯著提升子葉胚數，2.5"mg/L"AgNO3處理28nbsp;d子葉胚數才開始上升，5"mg/L"AgNO3處理21"d達到峰值，28"d略有下降，但仍處于高值；而高濃度的AgNO3需要相對較短的處理時間就可顯著提升子葉胚誘導率，如15"mg/L"AgNO3處理的子葉胚誘導率的峰值出現(xiàn)在14～21"d，28"d開始顯著下降。

綜上所述，不同濃度AgNO3、不同處理時間未顯著增加出胚胚塊數，但5.0"mg/L"AgNO3處理21、28"d，10.0"mg/L"AgNO3處理21"d，15.0"mg/L"AgNO3處理7～21"d子葉胚數顯著高于對照（表1）。

2.3""次生體胚發(fā)生與褐化的相關性分析

相關性分析結果表明，出胚胚塊數與褐化呈負相關，相關系數為–0.342，但未達到顯著水平；子葉胚數與褐化呈負相關，相關系數為-0.552，達到極顯著水平。此外，出胚胚塊數與子葉胚數呈正相關，相關系數為0.439，達到極顯著水平（表2）。

2.4""AgNO3處理再生植株的表型及倍性分析

AgNO3處理的再生植株表型與對照植株相似（圖2）。倍性分析結果表明，AgNO3處理再生植株與對照一樣，均為二倍體，未產生倍性變異（圖3）。

3""討論

傷害會誘導乙烯大量合成[17]，培養(yǎng)過程中添加的各類生長調節(jié)劑、蔗糖等成分也會對培養(yǎng)物造成逆境，進而促進乙烯的合成[6]。乙烯抑制白菜型油菜（Brassica"campestris"L.）[18]、白菜[Brassica"pekinensis（Lour.）Rupr.][19]、美洲狼尾草（Pennisetum"glaucum）[20]、白云杉（Picea"glauca）[21]、胡蘿卜（Daucus"carota"L.）[22]、羅布斯塔咖啡（Coffea"canephora）[23-24]、擬南芥（Arabidopsis"thaliana）[25]、菠菜（Spinacia"oleracea）[26]、玉米（Zea"mays"L.）[27]、冰糖橙[28]等物種的體胚發(fā)生。AgNO3通過以銀離子取代乙烯結合必須的銅離子，從而阻斷乙烯信號傳導，使培養(yǎng)物無法感受乙烯信號[29]，達到抑制乙烯發(fā)揮作用的效果。添加AgNO3等乙烯抑制劑，可大幅提升體胚發(fā)生能力。如玉米幼胚胚性愈傷誘導率提高3～10倍，體胚發(fā)生能力提高3倍[27]；添加1.70"mg/L"AgNO3，每塊菠菜愈傷體胚數增加3倍[26]。

添加乙烯后，番茄體胚發(fā)育停留在球形胚階段[30]。橡膠樹體胚發(fā)生對乙烯也很敏感。內珠被培養(yǎng)需要將幼果切成薄片先誘導愈傷，再誘導體胚發(fā)生，此過程產生的乙烯會抑制胚性愈傷和體胚誘導[31]。橡膠樹內珠被培養(yǎng)過程中添加0.44、4.40"mg/L乙烯抑制劑AOA及1.00、0.01"mg/L"AgNO3均顯著提高胚性愈傷誘導率和體胚誘導率，而添加ACC（乙烯合成前體）則抑制胚性愈傷誘導率和體胚誘導率，在IRCA144和PB260兩個品種中趨勢相同。IRCA144在9.98"mg/L、PB260在0.1"mg/L"AgNO3處理分別獲得了60個和7個原胚，而對照則無法誘導出原胚[31]。繼代4"a以上胚性下降的橡膠樹花藥愈傷組織在體胚誘導第一個月添加5"mg/L"AgNO3顯著促進了體胚發(fā)生[32]。在其他物種中，如苜蓿[33-34]、大豆[35]、蘇格蘭松（Pinus"sylvestris"L.）[36]、夏雪片蓮（Leucojum"aestivum"L.）[37]中乙烯卻可以促進體胚發(fā)生。

在非脅迫環(huán)境中，細胞內的ROS主要由線粒體產生，ROS的產生和清除處于動態(tài)平衡，不會對細胞造成氧化損傷[38]。當生物體受到非生物脅迫時，呼吸作用加劇，釋放出大量ROS，超出ROS清除系統(tǒng)的清除能力，使ROS在細胞內積累，從而對細胞造成氧化損傷[39]。組培對植物材料是一個非生物脅迫過程，期間會產生過量ROS。過氧化物酶（peroxidase，"POD）脫除組織中的過氧化氫和超氧陰離子，保護細胞膜的通透性。研究表明，硝酸銀可提高牡丹[16，"40]、刺梨[41]愈傷組織POD的活性，減輕褐化。300"mg/L"AgNO3提高了黃瓜葉片POD（過氧化物酶）和SOD（超氧化物歧化酶）的活性[42]。本研究也發(fā)現(xiàn)，AgNO3通過減少胚塊組織中過氧化氫的積累，進而減少活性氧的含量，提高體胚發(fā)生率。

適宜濃度的AgNO3可提高正常胚狀體誘導率，但長時間和高濃度AgNO3處理容易導致體胚畸形。體胚誘導第一個月添加5"mg/L"AgNO3顯著促進橡膠樹花藥愈傷組織體胚發(fā)生，但濃度提高到10"mg/L處理1個月或5"mg/L處理2個月，畸形胚率增加[32]。大量乙烯導致紫花苜蓿（Medicago"sativa"L.）植株畸形[43]。本研究表明，5.0～"15.0"mg/L"AgNO3在愈傷誘導階段處理7～28"d提高了子葉胚誘導率，再生植株倍性正常，未發(fā)生變異。

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