摘""要：白木香果實中含有一類四環(huán)三萜化合物葫蘆素，其具有抗炎、保肝和抗腫瘤等活性。細胞色素P450酶（cytochrome"P450，"CYP）是葫蘆素生物合成途徑中的關鍵酶。白木香中參與葫蘆素合成的P450基因尚未得到深入研究，本研究基于白木香轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，克隆了1個P450基因（AsCYP131）。該基因的開放閱讀框（ORF）長度為1491"bp，編碼496個氨基酸，蛋白分子質(zhì)量為55.39"kDa，理論等電點（pI）為7.65，親水性平均系數(shù)為–0.053，不穩(wěn)定系數(shù)為47.16，屬于不穩(wěn)定蛋白，包含40個潛在磷酸化位點，二級結構以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主。多重序列比對和系統(tǒng)進化樹分析結果顯示，AsCYP131基因編碼的蛋白與已報道參與葫蘆素生物合成的CsCYP、CmCYP和ClCYP聚為一支，C端的功能結構域序列表現(xiàn)出顯著的一致性。通過實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測AsCYP131在白木香不同組織中的表達水平，結果表明，AsCYP131在根、莖、葉、花、果實、種子中的表達水平存在差異，在果實中的相對表達量最高。本研究為進一步揭示AsCYP131基因在葫蘆素生物合成中的功能提供參考依據(jù)。

關鍵詞：白木香；P450酶；AsCYP131；生物信息學；表達分析中圖分類號：S567.19""""""文獻標志碼：A

Cloning"and"Expression"Analysis"of"the"Gene"AsCYP131"in"Aquilaria"sinensis

HUANG"Xing1，2，"MEI"Wenli2，"WANG"Hao2，"HUANG"Shengzhuo2，"CHEN"Xin2，"LIU"Shoubai1*，"DAI"Haofu2*

1."School"of"Tropical"Agriculture"and"Forestry，"Hainan"University"/"Key"Laboratory"of"Genetics"and"Germplasm"Innovation"of"Tropical"Special"Forest"Trees"and"Ornamental"Plants，"Ministry"of"Education，"Haikou，"Hainan"570228，"China;"2."Institute"of"Tropical"Bioscience"and"Biotechnology，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"Key"Laboratory"of"Natural"Products"Research"and"Development"of"Li"Folk"Medicine"of"Hainan"Province"/"Hainan"Engineering"Research"Center"of"Agarwood"/"International"Joint"Research"Center"of"Agarwood，"Haikou，"Hainan"571101，"China

Abstract："The"fruit"of"Aquilaria"sinensis"contains"a"class"of"tetracyclic"triterpenoids"known"as"cucurbitacins，"which"exhibit"anti-inflammatory，"hepatoprotective，"and"antitumor"activities."Cytochrome"P450s"（CYP）"are"key"enzymes"in"the"biosynthesis"pathway"of"cucurbitacins."The"P450"genes"for"cucurbitacin"synthesis"in"A."sinensis"have"not"been"extensively"studied."In"this"study，"a"P450"gene"（AsCYP131）"was"cloned"based"on"A."sinensis"transcriptome"data."The"complete"open"reading"frame"（ORF）"of"AsCYP131"gene"was"1491"bp，"encoding"a"protein"of"496"amino"acids"with"a"molecular"weight"of"55.39"kDa."The"theoretical"isoelectric"point"（pI）"of"the"protein"was"7.65，"with"an"average"hydrophilicity"coefficient"of"–0.053，"and"an"instability"index"of"47.16，"classifying"it"as"an"unstable"protein."The"protein"contained"40"potential"phosphorylation"sites，"and"its"secondary"structure"was"predominantly"composed"of"α-helix"and"random"coil."The"results"of"multiple"sequence"alignment"and"phylogenetic"tree"analysis"showed"that"the"protein"encoded"by"the"AsCYP131"gene"clustered"into"a"single"unit"with"CsCYP，"CmCYP，"and"ClCYP，"which"have"been"reported"to"be"involved"in"the"biosynthesis"of"cucurbitacins."The"sequence"of"the"functional"structural"domains"at"the"C-terminal"showed"high"consistency."At"the"same"time，"the"expression"levels"of"AsCYP131"in"different"tissues"of"A."sinensis"detected"by"real-time"fluorescence"quantitative"PCR"（RT-qPCR）."The"results"indicated"differential"expression"levels"of"AsCYP131"across"various"tissues，"including"roots，"stems，"leaves，"flowers，"fruits，"and"seeds，"with"the"highest"relative"expression"observed"in"fruits."This"study"would""serve"as"a"valuable"reference"for"the"subsequent"validation"of"the"functional"role"of"the"AsCYP131"gene"in"cucurbitacin"biosynthesis.

Keywords："Aquilaria"sinensis;"P450;"AsCYP131;"bioinformatics;"expression"analysis

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.05.006

白木香[Aquilaria"sinensis"（Lour.）"Spreng.]又稱土沉香、女兒香，為瑞香科（Thymelaeaceae）沉香屬（Aquilaria）植物，分布于廣東、海南和廣西等熱帶、亞熱帶地區(qū)[1]。白木香在受到自然因素（雷劈、風折、蟲蛀等）或人為因素（砍傷、打洞、接菌等）脅迫后會產(chǎn)生沉香[2-4]。沉香是中國、日本、印度等國家的傳統(tǒng)名貴藥材，具有“藥中黃金”的美譽，具行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘等功效[5]。目前的研究主要集中于沉香，而對白木香果實等部位的研究相對較少，因此，探索果實等非藥用部位的化學成分及其藥用價值，將有效提高白木香整株資源的利用。白木香植物的主要化學成分包括三萜、二萜、木脂素類、甾體類、生物堿類、苯丙素類、色酮類和簡單酚類等[6]。葫蘆素是一類四環(huán)三萜化合物，主要分布于葫蘆科等植物中，具有廣泛的藥理活性，包括抗炎[7]、保肝[8]和抗腫瘤活性[9-11]等。民間利用含葫蘆素類化合物的植物資源，用于清熱解毒和利濕退黃等[12]。目前，葫蘆素已被開發(fā)為藥物，以葫蘆素片的形式廣泛使用。臨床上，葫蘆素片常用于慢性肝炎以及原發(fā)性肝癌的輔助治療[13]。本研究團隊早期首次發(fā)現(xiàn)白木香的果實中含有葫蘆素[14]，白木香可能成為生產(chǎn)葫蘆素的新興植物資源。

細胞色素P450酶（cytochrome"P450，"CYP）是一類分布廣泛的含血紅色素的單加氧酶，可參與羥基化、環(huán)氧化、脫鹵素等反應[15]。在葫蘆素的合成途徑中，2，3-環(huán)氧角鯊烯經(jīng)過葫蘆二烯醇合酶催化形成葫蘆二烯醇，之后多個步驟需要P450酶的催化反應完成，羥基化是其中最典型的催化反應，如P450酶參與C-2、C-20和C-25處的羥基化[16]。黃瓜全基因組序列揭示了1條參與葫蘆素生物合成相關的苦味（Bi）基因簇[17]，并鑒定出7個參與葫蘆素C生物合成的P450基因[18]。在甜瓜和西瓜基因組中也發(fā)現(xiàn)了Bi基因簇，分別鑒定出6個和8個可能參與葫蘆素B和葫蘆素E生物合成的P450基因。分布在Bi基因簇上編碼C-25或2β羥化酶的P450基因在葫蘆科不同物種中均存在共線關系，甚至在不同物種的轉(zhuǎn)錄排列和方向上表現(xiàn)為相同的順序[16]，表明Bi基因簇上的P450基因在植物進化的過程中可能高度保守。本研究團隊前期在白木香基因組中定位了一條Bi基因簇，在該基因簇中初步鑒定出5個P450基因，與葫蘆科物種中參與葫蘆素生物合成的關鍵P450基因之間存在共線關系[19]。此前的研究主要集中在葫蘆科物種上，而能夠產(chǎn)生葫蘆素的其他物種中的P450基因尚未深入研究。因此，挖掘和驗證白木香中與葫蘆素生物合成相關的P450基因，有助于深入研究各類葫蘆素的生物合成途徑，為葫蘆素的生產(chǎn)提供重要的遺傳資源或種質(zhì)資源。

本研究基于白木香轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[20]，從前期篩選出的5個P450基因中克隆了AsCYP131基因，并對其編碼的蛋白進行基本理化性質(zhì)、磷酸化位點、蛋白結構特征等生物信息學分析。同時，采用RT-qPCR技術對AsCYP131基因進行組織差異表達分析，為進一步研究AsCYP131基因在白木香中葫蘆素的生物合成途徑中的作用提供理論支持。

1""材料與方法

1.1""材料

1.1.1""植物材料""本研究所用白木香（A."sinensis）種植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術研究所試驗基地。分別于不同時期采集3年生白木香植株的根、莖、葉、花、果實、種子等組織樣品，液氮速凍后立即提取RNA，用于基因克隆及基因表達分析。

1.1.2""主要試劑""Plant"Total"RNA"Isolation"Kit、General"Plasmid"Mini"Kit購自成都福際生物技術有限公司；FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成試劑盒、2×Taq"PCR"MasterMix"Ⅱ、DNA純化回收試劑盒、氨芐青霉素鈉鹽、SuperReal熒光定量預混試劑購自天根生化科技（北京）有限公司；PrimeSTAR"Max"Premix高保真酶購自寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司；DNA"Marker"Ⅶ購自中科瑞泰（北京）生物科技有限公司；LB培養(yǎng)基按常規(guī)配方配制。

1.2""方法

1.2.1""總RNA提取與cDNA合成""分別取白木香的根、莖、葉、花、果實、種子樣品各100"mg加入液氮迅速研磨成粉，使用Plant"Total"RNA"Isolation"Kit（FOREGENE）RNA提取試劑盒提取RNA，通過1%普通瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性、使用生物核酸定量檢測儀Nanodrop"One"TM（Thermo"Scientific，"Wilmington，"DE，"USA）檢測濃度。使用FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，–20"℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2""基因克隆""基于白木香轉(zhuǎn)錄組注釋拼接的AsCYP131基因序列，使用Integated"DNA"Technologies"IDT（idtdna.com）在線軟件設計高特異性引物（表1），以特異性引物AsCYP131-F/R進行PCR擴增得到目的基因片段。擴增反應體系（20"μL）：2×Taq"PCR"Master"Mix"10"μL，上、下游引物各1"μL，cDNA模板1"μL，ddH2O補足至20"μL。反應程序為：95"℃預變性5"min；95"℃變性40"s，60"℃退火40"s，72"℃延伸2"min，共35個循環(huán)；最后72"℃延伸5"min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，回收符合目的條帶大小且明亮的單一片段，連接于pMD19-T載體，將其轉(zhuǎn)入DH5a感受態(tài)細胞中，并涂至含氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，篩選陽性單克隆，進行Sanger一代測序以確定其核苷酸序列，測序正確的菌液以1∶100的比例擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)16"h后進行質(zhì)粒提取，質(zhì)粒保存于–20"℃。

1.2.3""生物信息學分析""在NCBI"Reference"proteins和Ensembl"Genome"Browser數(shù)據(jù)庫中BLAST搜索與AsCYP131同源的P450氨基酸序列；使用MEGA11通過鄰位相連法（neighbor-"joining，"NT）構建進化樹。使用DNAMAN"8.0軟件進行氨基酸序列分析；使用Expasy"ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam）在線軟件預測AsCYP131的相對分子量、等電點和氨基酸數(shù)量等基本性質(zhì)；使用NetPhos-3.1（https：//services."healthtech.dtu."dk/services/NetPhos-3.1/）在線軟件進行蛋白磷酸化位點分析；分別采用WOLF"SOPMA（https：//"npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_"automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）和AlphaFold"Protein"Structure"Database（https：//"alphafold.ebi.ac.uk/）在線軟件進行蛋白二級結構預測及蛋白三級結構模型構建。

1.2.4""AsCYP131基因的組織表達分析""采用RT-qPCR技術檢測AsCYP131基因在白木香的根、莖、葉、花、果實和種子中的表達水平。根據(jù)AsCYP131基因序列，以白木香GADPH為內(nèi)參基因，使用Integrated"DNA"Technologies軟件設計熒光定量特異性引物（表1）。使用MX3005P實時熒光定量PCR儀，采取SYBR"green嵌合熒光法檢測AsCYP131基因表達量。反應體系為：cDNA模板1"μL，上、下游引物各0.6"μL，2×Real"Universal"PreMix"10"μL，ddH2O"0.84"μL。反應程序為：95"℃預變性5"min；95"℃變性5"s，57"℃復性15"s，循環(huán)40次。每個反應3次重復，采用2–ΔΔCt法計算AsCYP131基因的相對表達量。

2""結果與分析

2.1""AsCYP131基因克隆

根據(jù)白木香的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，AsCYP131基因的ORF長度為1491"bp，編碼496個氨基酸?；谠摶虻腛RF設計特異性引物AsCYP131-F/R（表1），以白木香嫩葉的cDNA為模板，對該基因進行PCR擴增。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測得到長度約1491"bp大小的條帶（圖1），回收條帶并進行測序，測序結果與轉(zhuǎn)錄本序列一致。

2.2""AsCYP131序列同源比對及系統(tǒng)發(fā)育進化分析

將AsCYP131編碼的氨基酸序列與黃瓜（Cucumis"sativus）、甜瓜（Cu."melo）、西瓜（Citrullus"lanatus）、西葫蘆（Cucurbita"pepo）、南瓜（Cu."moschata）、筍瓜（Cu."maxima）、長果黃麻（Corchorus"olitorius）、可可（Theobroma"cacao）、陸地棉（Gossypium"hirsutum）等9種植物的P450同源氨基酸序列進行比對分析。結果顯示（圖2），這10個蛋白的C端氨基酸相對保守，均存在P450羥化酶特征性保守結構域heme-binding（PFGXGRRXCPG）以及其他保守結構域K-helix（EXLR）、I-helix（A/"GGXD/ETS/T）和PXRX（FXPERF），符合P450家族蛋白結構特征。將AsCYP131與其他植物中同源性較高的P450氨基酸序列進行系統(tǒng)發(fā)育樹構建，發(fā)現(xiàn)AsCYP131與已知具有羥基化功能的葫蘆科植物黃瓜CsCYP、甜瓜CmCYP和西瓜ClCYP聚為一類（圖3）。

2.3""AsCYP131蛋白理化性質(zhì)及磷酸化位點分析

通過Expanse"Prepare軟件預測表明AsCYP131蛋白的分子式為C1724H2611N473O539S14，氨基酸數(shù)量為496個，相對分子量為55.39"kDa；包含20種氨基酸，其中亮氨酸（Leu，"14.3%）含量最高，共52個帶負電殘基（Asp+Glu）和53個帶正電殘基（Arg+Lys）；蛋白的理論pI值為7.65，不穩(wěn)定系數(shù)為47.16，屬于不穩(wěn)定蛋白，脂肪酸系數(shù)為99.72，親水性系數(shù)為-0.053，預測為親水性蛋白（圖4A）。利用Net"Phos-3.1軟件預測分析其氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，其共有40個潛在的磷

酸化位點，其中蘇氨酸磷酸化位點11個，絲氨酸磷酸化位點26個，酪氨酸磷酸化位點3個（圖4B）。

2.4""AsCYP131蛋白結構預測

通過NCBI的CD-Search工具分析AsCYP131蛋白的保守結構域，結果顯示該蛋白具有P450酶特征性的heme-binding保守結構域（圖5A），并被預測為CYP81亞家族成員，歸類為CYP71家族[21]。通過SOPMA軟件預測AsCYP131的二級結構發(fā)現(xiàn)，該蛋白由39.52%的α-螺旋、13.31%的延伸鏈和47.18%的無規(guī)則卷曲組成（圖5B）。通過AlphaFold"Protein"Structure"Database軟件進行蛋白三級結構模型構建，獲得AsCYP131蛋白的預測模型（圖5C），預測結果與其蛋白二級結構預測保持一致，具有較多的α-螺旋和無規(guī)則卷曲。

2.5""AsCYP131基因表達分析

RT-qPCR檢測結果顯示，AsCYP131基因在白木香不同組織中的表達呈現(xiàn)顯著的組織特異性。AsCYP131基因在果實中的相對表達量最高，是根部表達量的2.48倍，分別是葉、花和種子表達量的1.78、1.88和1.99倍；在莖中的表達量顯著低于其他組織，而葉和花中的表達量相對接近（圖6）。此基因表達模式與白木香果實中含有葫蘆素，而根、莖、葉、花和種子中未分離獲得葫蘆素[14]結果一致，推測AsCYP131基因在葫蘆素生物合成過程中發(fā)揮重要作用。

3""討論

P450作為植物代謝網(wǎng)絡中的關鍵酶，在植物的初生和次生代謝過程中發(fā)揮著重要作用[22]。然而，由于P450基因家族的龐大、物種間的同源性較低以及其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的定位，導致P450的篩選和功能研究成為植物次生代謝研究中的難點[23]。

藥用植物中具有良好活性的次生代謝產(chǎn)物多為結構復雜且修飾程度較高的天然產(chǎn)物，P450在這些化合物的結構修飾過程中發(fā)揮了關鍵作用，P450的氧化修飾主要包括引入羥基、酮基、羧基和環(huán)氧基團等，尤其是羥基的引入為其他基團的進一步修飾創(chuàng)造了條件[24]。ZHOU等[16]從黃瓜、甜瓜和西瓜中分別挖掘出與葫蘆素C、葫蘆素B和葫蘆素E合成相關的P450基因，其中黃瓜CsCYP參與了葫蘆素C合成途徑中C-25位的羥基化，甜瓜CmCYP和西瓜ClCYP則參與葫蘆素B、E合成途徑中C-2位的羥基化。為研究白木香中與葫蘆素合成相關的P450基因，本研究篩選并成功克隆了AsCYP131基因，該基因的核苷酸序列為1491"bp，編碼了496個氨基酸。通過氨基酸序列比對結果顯示，AsCYP131具有P450特征性保守結構域heme-binding（PFGXGRRXCPG），包括其他保守性較高的功能結構域K-helix（EXLR）、I-helix（A/GGXD/ETS/T）和PXRX（FXPERF），表明該蛋白可能具有較強的底物結合能力和催化活性。進一步的聚類分析發(fā)現(xiàn)，AsCYP131的氨基酸序列與已知參與葫蘆素合成的CsCYP、CmCYP和ClCYP聚類于同一分支，具有較高的同源性，推測AsCYP131可能具有類似的羥基化功能。

參與生物合成的基因在不同組織中的表達水平影響植物次生代謝產(chǎn)物的含量。TAN等[25]分析了獼猴桃不同組織中類黃酮含量差異的機制，發(fā)現(xiàn)所篩選的AaF3H-1、AaF3′5′H-1和其他9種基因在葉片和葉柄中的表達水平高于果實，其表達模式與山奈酚、異鼠李素和槲皮苷這3種主要類黃酮含量的變化一致，說明這11個基因參與類黃酮類化合物的生物合成。PEI等[26]的研究表明糖基化修飾基因SbUGAT4在根部的表達水平與黃芩苷在黃芩根部的含量成正相關。楊琳等[27]分析了五指毛桃不同組織中補骨脂素合成酶基因（PS）表達水平與補骨脂素含量的關系，結果表明PS基因在根與葉中的表達水平顯著高于莖和果實，其表達模式與補骨脂素含量的變化一致。本研究通過RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，AsCYP131在不同組織中的表達水平存在顯著差異，其中在果實中的表達量最高，至少是其他部位表達量的1.7倍。結合早期研究發(fā)現(xiàn)白木香果實中含有葫蘆素，而根、莖、葉、花和種子中未分離獲得葫蘆素[14]，AsCYP131基因在果實中的高表達，很可能為葫蘆素的生物合成提供了關鍵的酶催化途徑，為葫蘆素在果實中積累提供了分子基礎。此結果進一步增強了AsCYP131基因參與葫蘆素生物合成的可信性。

綜上所述，本研究完成了AsCYP131基因的克隆、生物信息學分析和表達模式分析，為后續(xù)對白木香葫蘆素類化合物合成的研究提供了1個候選基因。目前本研究尚缺乏足夠的實驗證據(jù)，后續(xù)將通過體外酶促反應和煙草瞬時轉(zhuǎn)染等方法，進一步驗證該基因的功能。

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