IdentificationofPathogensofPolygonatummultiflorumLeaf SpotDiseaseandTheirInhibitionbyAntagonistic Bacteria HUXiu-hong1，HEJaZHANGTing-ietal（1.SholofLifeandHealthSience，KailiUniversityKailiGuzou556；.Qiandongnan Food and Drug Inspection and Testing center，Kaili，Guizhou ）

AbstractUsigplantswithtypicalsymptomsofPlygonatummultfomlafspotdiseaseasrawmaterials，tepatogenicfungiwereisolatedfromthediseasedleavesusingtisueisolationmetodMorphologicalobservationandequenceanalysisofribosoalDA-（nteal transcribedspacer）regionwereusedtoasifyandidentifeathogenicfungi.eibitoryectsoftheantagonisticacteiaGlu conobactereeliH-cillssubilisdcilsgm-ntpagefuieedulsot themainpathogenscausingteleafspotdiseaseofPlygoatumultiformreEicocmsorhumandPestalotiopsismicospaute searchhafondattetagosticacteuofBcilussubtilisH-3dsrogiibitoetoothransofpatogsii tion rates of 91. 37% and 98.21% ，respectively；Bacillus magnetrium B-2 also had a strong inhibitory effect with inhibition rates of 44.98% and 95.49% ，respectively；whileGluconobacternepheli H-1onthetwopathogenicfungi mentionedabove wasrelativelyweak，withinibition rates of 31.89% and 50.41% ，respectively.In summary，Bacillus subtilis has the best antibacterial effect and can provide a basis for the research and development of biopesticides in the later stage.

KeywordsPlygoatummuliforu；eafspotdisease；PathognicfungiSeparationandidentification；Antagonisticbacterabioy effect

多花黃精（PolygonatumcyrtonemaHua.）又名姜形黃精、野生姜、黃精姜等，為百合科（Liliaceae）黃精屬（Polygona-tum）多年生宿根草本植物，屬于傳統(tǒng)的中藥材，是藥食同源植物[1-2]。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，黃精具有補(bǔ)腎益精、滋陰潤(rùn)燥之功效，長(zhǎng)期用于治療腎虛虧損、脾胃虛弱、肺虛燥咳、體倦乏力等癥[3-4]。黃精共分為3種，即黃精（P.sibiricumRed）、滇黃精（P.kingianumColl.etHemsl）和多花黃精（P.cyrtonemaHua）[5-6] O

黃精是貴州省草本類中藥材主要品種之一。目前貴州省9個(gè)市州均有黃精種植。2019年黃精被列為貴州省農(nóng)村產(chǎn)業(yè)革命中藥材7個(gè)重點(diǎn)品種之一。多花黃精，多數(shù)來(lái)源于野生采集，隨著市場(chǎng)對(duì)多花黃精需求的增加和野生資源的急劇減少，野生多花黃精數(shù)量越來(lái)越少[6]。近年來(lái)，人工栽培的黃精規(guī)模逐漸擴(kuò)大。研究發(fā)現(xiàn)，黃精在非適生區(qū)進(jìn)行種植或在黃精生長(zhǎng)過(guò)程中管理不到位，易造成黃精病蟲(chóng)害發(fā)生[7-9]。目前，黃精病害主要有葉斑病、黑斑病、枯萎病、灰霉病、根腐病、炭疽病等，其中黃精葉斑病、根腐病危害較嚴(yán)重[10-15]。筆者以黔東南鎮(zhèn)遠(yuǎn)縣黃精種植基地的多花黃精葉斑病為切入點(diǎn)，開(kāi)展多花黃精葉斑病病原菌的分離與鑒定及拮抗菌對(duì)其抑制作用研究，以期為后期多花黃精病害的防治提供參考，同時(shí)在保證多花黃精的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)方面具有重要的實(shí)踐意義。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑與原料。瓊脂粉、次氯酸鈉，成都市科龍化工試劑廠；PDA（馬鈴薯葡萄糖）培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；乳酸棉染液，珠海貝索生物技術(shù)有限公司。多花黃精葉斑病病株采集于鎮(zhèn)遠(yuǎn)縣多花黃精種植基地。

1.1.2菌種。拮抗細(xì)菌：枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis，編號(hào)H-1）、葡糖桿菌（Gluconobacternephelii，編號(hào)H-3）從黃精塊莖中分離；巨大芽孢桿菌（Bacillusmagaterium，B-2）從大葉韭菜根中分離。

1.1.3儀器與設(shè)備。FA2004型電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；SW-CJ-2D 型雙人凈化工作臺(tái)，上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司；ZWY-CZ11D型恒溫?fù)u床培養(yǎng)振蕩器，上海智誠(chéng)分析儀器有限公司；BGZ-246型電熱鼓風(fēng)干燥箱、SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LDZX-50kbs型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2 方法

1.2.1癥狀的觀察和描述。觀察并描述多花黃精葉片病變部位的病斑形態(tài)、顏色和發(fā)病部位及危害程度等，同時(shí)對(duì)發(fā)病部位進(jìn)行拍照。

1.2.2病原菌的分離純化與鑒定。采用組織培養(yǎng)法對(duì)多花黃精病葉進(jìn)行組織分離，即取病健交界處的組織3小塊，放在 75% 乙醇中浸泡 10s ，用無(wú)菌濾紙吸取遺留在組織上的乙醇，隨后將組織放到 1% 次氯酸鈉溶液中 30s ，然后用無(wú)菌水沖洗3次，無(wú)菌濾紙吸干表面殘留的水，最后轉(zhuǎn)移到PDA培養(yǎng)基上， 培養(yǎng) 3～5d. 。用接種針對(duì)長(zhǎng)成的菌落進(jìn)行平板2次純化，直至獲得純培養(yǎng)為止。挑取菌落中央部分的菌絲置于載玻片上，滴入一滴乳酸棉染液，加蓋玻片于顯微鏡下觀察病原菌孢子大小與菌絲形態(tài)。

按SK8259試劑盒操作提取真菌基因組DNA，采用通用引物ITS1/ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增：ITS1（ -TCCGTAGGTGAAC-CTGCGG- ）和ITS4（ -TCCTCCGCTTATTGATATGC - ）。擴(kuò)增體系為 25uL，其中 10×PCR Buffer5.0uL，50mmol/LMgSO45.0uL，10mmol/L＼ d NTP2.0uL，5U/uLTaqDNA 酶0.5uL，正反向引物（10uLITS1和ITS4）各1.0uLDNA模板1.0uL，9.5uLPCR反應(yīng)程序： 預(yù)變性 5min，94℃變性 復(fù)性 延伸 90s，30 個(gè)循環(huán)；后 延伸 10min 。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò) 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將PCR反應(yīng)產(chǎn)物純化后送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果采用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)MEGA5.0軟件中Neighbor-join-ing法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察對(duì)致病菌進(jìn)行分類鑒定[16]

按照Ezup柱式真菌基因組DNA提取試劑盒方法（生工）分離純化菌株基因組DNA。根據(jù)原核生物16SrRNA保守序列通用引物[7]：27F（ GTT TGA TCC TGG CTC 和 1492r （ -TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T- ），以AW1-18的基因組DNA為模板，對(duì)該菌株的16SrRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用 50℃反應(yīng)體系，反應(yīng)條件： 個(gè)循環(huán)； 10min 。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI用Blast軟件與GenBank中已知的相關(guān)屬種的16SrRNA序列進(jìn)行同源性分析，采用ClustalX1.83軟件進(jìn)行多序列比對(duì)8，用MEGA5.0軟件包中Kimura 2-ParameterDistance模型進(jìn)行多序列匹配排列[9]，用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[0]

1.2.3病原菌回接。取健康新鮮的黃精葉片，用 75% 乙醇擦拭表面進(jìn)行消毒。參照文獻(xiàn)[進(jìn)行病原真菌孢子懸液的制備，采用針刺法和噴霧法給表面消毒后的黃精葉片進(jìn)行菌懸液接種，以接種無(wú)菌水為對(duì)照。待葉片產(chǎn)生典型病斑后，依據(jù)柯赫氏法則，再通過(guò)組織分離法對(duì)病斑進(jìn)行病原菌的分離純化和形態(tài)鑒定。

1.2.4拮抗菌對(duì)優(yōu)勢(shì)病原菌的抑制作用。采用平板對(duì)峙法考察拮抗細(xì)菌對(duì)病原菌的抑制作用。無(wú)菌操作下，挑取1環(huán)拮抗細(xì)菌放入 100mL 牛肉膏蛋白陳液體培養(yǎng)基中，于180min30℃下?lián)u床培養(yǎng) 18～24h ，無(wú)菌水稀釋使菌液濃度為 。取 0.2mL 上述括抗細(xì)菌菌懸液進(jìn)行平板涂布，涂布均勻后再在平板正中央接種一塊 6mm 大小的病原真菌菌餅。以不涂布接種拮抗菌只接種病原真菌的培養(yǎng)皿為對(duì)照組，平行3次試驗(yàn)，將各組培養(yǎng)血放人 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3～7d ，待對(duì)照組真菌菌落長(zhǎng)至平皿直徑（ 90mm， 的4/5時(shí)，測(cè)定對(duì)照組和試驗(yàn)組中的菌落直徑，并計(jì)算抑菌率。

對(duì)照組菌落直徑-試驗(yàn)組菌落直徑抑制率 ×100% 對(duì)照組菌落直徑

2 結(jié)果與分析

2.1癥狀的觀察和描述多花黃精葉斑病發(fā)病初期，先在葉片頂端形成病斑，后不斷擴(kuò)大，逐漸轉(zhuǎn)變成不規(guī)則或橢圓形的水浸狀病斑，葉片邊緣變黃褐色至深褐色，最終整棵植株葉片枯死，病葉枯死后，不脫落，懸掛于莖稈（圖1）。

2.2病原菌的分離純化與鑒定通過(guò)組織培養(yǎng)法和平板接種法從葉斑病致病植株中分離純化出5株真菌單菌落。經(jīng)過(guò)多次傳代培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)該5株真菌長(zhǎng)勢(shì)良好，其菌落形態(tài)穩(wěn)定，編號(hào)分別為 （圖2）。

經(jīng)測(cè)序，菌株 和HJ-5的序列長(zhǎng)度分別為 541，562，562，561，486bp 。將各菌株序列在 NC-BI網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì)，利用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖3＼～5。由圖3可知，HJ-1的基因序列與Epicoccumsorghinum同在一個(gè)分支上，親緣關(guān)系最近，序列相似性為 90% 。由圖4可知， HJ-2，HJ-3，HJ-4 為同一菌屬，其基因序列與Irpexlacteus同在一個(gè)分支上，親緣關(guān)系最近，序列相似度為 99% 。由圖5可知 HJ-5與Pestalontiopsosmicrosporisolate同在一個(gè)分支上，親緣關(guān)系最近，序列相似度為 84% 。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，可初步判斷HJ-1可能為Epicoccum sorghi- 為同一菌屬IrpexlIacteus，HJ-5為Pestalontiopsos microspor isolate。

2.3病原菌回接依照柯赫氏法則，采用針刺法和噴霧法給表面消毒后的黃精葉片進(jìn)行孢子菌懸液接種（圖6）。10d左右，HJ-1和HJ-5致病組的黃精葉在不同程度上發(fā)生了枯萎及病斑，這與初始多花黃精病狀基本一致。而HJ-2、HJ-

3、HJ-4致病組黃精葉片無(wú)變化。

采用組織分離法分離病變組織上的病原菌并進(jìn)行顯微鑒定，發(fā)現(xiàn)再次分離的菌株與原接種病原菌形態(tài)基本相同，這說(shuō)明Epicoccum sorghinum HJ-1和PestalontiopsosmicrosporisolateHJ-5是主要致病菌。HJ-1的菌落特征：培養(yǎng)初期為白色，后期菌落中心呈橘粉色及灰綠色（圖7A），背面為橘紅色（圖7B）；菌絲有隔膜與分支，產(chǎn)生厚垣孢子，厚垣孢子串生或單生（圖7C）。HJ-5的菌落特征：菌落白色，圓形，具有同心輪紋（圖7D），背面為淺棕色（圖7E）；菌絲無(wú)隔膜與分支，產(chǎn)生分生孢子，分生孢子呈卵圓形（圖7F）。

Fig.6Symptoms of pathogenicbacteria returning to the leaves of Polygonatummultiflorum

2.4拮抗菌對(duì)病原菌的抑制作用通過(guò)平板對(duì)峙法初步考察了3株拮抗細(xì)菌對(duì)黃精葉斑病致病菌EpicoccumsorghinumHJ-1、Pestalontiopsosmicrospor isolateHJ-5的抑制作用，結(jié)果見(jiàn)圖8、9。拮抗菌 Bacillus subtilis 對(duì) Epicoccum sorghinumHJ-1和Pestalontiopsosmicrospor isolateHJ-5 均有很強(qiáng)的抑制作用，抑菌率分別為！ 91.37%.98.21% ；拮抗菌Gluconobacternephelii 對(duì)Epicoccum sorghinumHJ-1 和Pestalontiopsosmicros-porisolate 有一定的抑制作用，但抑制作用較弱，抑菌率分別為 31.89%.50.41% ；拮抗菌 Bacillus magaterium 對(duì) Epic-occum sorghinum HJ-1和 Pestalontiopsos microspor isolate HJ-5具有較強(qiáng)的抑制作用，抑菌率分別為 44.98% 和 95.49% （表1）。

注；A.HJ-1菌落正面，B.HJ-1菌落背面，C.HJ-1菌絲與厚垣孢子，D.HJ-5菌落正面，E.HJ-5菌落背面，F(xiàn).HJ-5菌絲與分生孢子。Note：A.HJ-olofrot.-bck，C.H-dhladoses；D.-frot，E.-5olobck，F(xiàn).-dconidia.

注：CK1為scHnum HJ-1的平板對(duì)崎結(jié)果。

Fig.8 The inhibitory effect of three antagonistic bacteria on Epicoccussorghinum HJ

3結(jié)論與討論

該試驗(yàn)從患有葉斑病的多花黃精葉片內(nèi)分離獲得了5株真菌菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定，初步確定1株為高粱附球菌（Epicoccumsorghinum），3株為白囊耙齒菌（Irpexlacteus），1株為小孢擬盤(pán)多毛孢（Pestalotiopsismicrospora）。進(jìn)一步通過(guò)致病性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)Pestalotiopsismicrospora與Epicoccumsorghinum能導(dǎo)致多花黃精葉片患上葉斑病，是主要的致病性真菌。研究表明，小孢擬盤(pán)多毛孢是子囊菌門(mén)的一個(gè)無(wú)性型內(nèi)生真菌屬，是著名的植物病原體品種，可引起多種植物發(fā)生葉斑病病害[17]；高粱附球菌也是常見(jiàn)的植物病原菌[16，18-19]。目前，有關(guān)黃精病害的病原菌主要為鐮刀菌、小孢擬盤(pán)多毛孢、假單胞菌[10-15]。其中，已報(bào)道的黃精葉斑病致病菌有葉點(diǎn)霉屬、小孢擬盤(pán)多毛孢、假尾孢屬等，未見(jiàn)報(bào)道有高梁附球菌。

芽孢桿菌是一個(gè)多樣性的微生物類群，分布廣泛，能夠抑制多種植物病害。該研究通過(guò)拮抗菌的平板對(duì)峙試驗(yàn)，獲得了一種拮抗菌：Bacillussubtilis 對(duì) Epicoccum sorghinum HJ-1和Pestalontiopsosmicrospor isolateHJ-5均有很強(qiáng)的抑制作用，抑菌率高于 91% ，最高可達(dá) 98% ，這為后期生物農(nóng)藥的研 究與開(kāi)發(fā)提供了依據(jù)。

注：CKeeontiopsos microspor isolateHJ-5 的平板對(duì)峙結(jié)果。

Fig. 9 The inhibitory effect of three antagonistic bacteria on Pestalontiopsosmicrospor isolate HJ-5

表13種黃精內(nèi)生細(xì)菌對(duì)2種病原菌的抑菌率

參考文獻(xiàn)

[1]崔闊澍，肖特，李慧萍，等.我國(guó)黃精種質(zhì)資源研究進(jìn)展[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，49（11）：35-39.

[2]鄭玲艷，馬小龍，孫藝琦.藥食同源黃精的資源分布與開(kāi)發(fā)應(yīng)用現(xiàn)狀[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2022，63（8）：1679-1684.

[3]李彥力，蘇藝，袁晚晴，等.黃精主要活性成分、功能及其作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代食品科技，2023，39（12）：354-363.

[4]張嬌，王元忠，楊維澤，等.黃精屬植物化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志，2019，44（10）：1989-2008.

[5]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：2015年版一部[S].北京：中