銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa，Pa）可引起人類和畜禽感染，給人體健康及養(yǎng)殖業(yè)造成較大危害[1-2]。 通過升高泵出系統(tǒng)活躍度、產(chǎn)生抗菌活性酶等多種機制增強耐藥性，導致抗生素治療效果不明顯[3-4]。疫苗可高效、特異防治致病菌感染，且不會造成腸道菌群失調(diào)[5]。目前研發(fā)的Pa鞭毛疫苗、脂多糖疫苗、滅活疫苗和減毒疫苗等在保護范圍和副作用方面有一定缺陷[]。 外膜蛋白I（Outer mem-braneprotein 1，0pr ）可引起多種類型免疫應答，可交叉免疫保護，是良好的疫苗研制靶向蛋白[7]。重組載體疫苗是研究的熱點和趨勢，常用載體包括痘病毒、沙門菌、卡介苗等[8]目前已研制出OprI蛋白重組沙門氏菌疫苗等。但減毒傷寒沙門氏菌載體，對老年人、兒童和免疫缺陷者應用存在著一定風險[1o]。乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）是食品級微生物，對人和動物無致病性[11]。L.lactis易于構(gòu)建基因表達載體，具有轉(zhuǎn)化率高，不持續(xù)刺激免疫系統(tǒng)，可作為免疫佐劑等優(yōu)點，目前已成功表達多種蛋白、細胞因子[12-13]。筆者旨在構(gòu)建表達 外膜蛋白I的重組L.lactis載體疫苗，評價構(gòu)建的載體疫苗免疫效果，以期為研發(fā)可防治Pa感染的疫苗奠定基礎。

1材料與方法

1.1試劑、實驗動物和菌株溶菌酶，購自美國Ameresco公司；限制性內(nèi)切酶、高效連接酶、KODPlus購自東洋紡（上海）生物科技有限公司；DNA基因組、質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化、膠回收試劑盒購自OMEGABio-Tek公司；HRP標記羊抗鼠IgG和IgE購自SouthernBiotech公司； 2× ESTaqMastermix購自北京康為世紀生物科技有限公司；其他試劑市售所得，均為AR級。ICR品系清潔級小白鼠，雌性， 14～16g ，中國醫(yī)學細菌保藏管理中心銅綠假單胞菌專業(yè)實驗室自繁自養(yǎng)。L.lactisMG1363菌株，購自寶生物工程（大連）有限公司；大腸桿菌 菌株、pMG36c質(zhì)粒 抗原，為中國醫(yī)學細菌保藏管理中心銅綠假單胞菌專業(yè)實驗室保存。試驗于2022年9月—2024年4月在中國醫(yī)學細菌保藏管理中心銅綠假單胞菌專業(yè)實驗室進行。

1.2主要儀器T100型梯度PCR儀、550型酶標儀、1652100型電轉(zhuǎn)化儀，美國Bio-Rad公司生產(chǎn)；DYCZ-24FN型電泳儀、WD-9413BX型凝膠成像分析系統(tǒng)，北京市六一儀器廠生產(chǎn)；TGL-16GB型高速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠生產(chǎn)；VCX1500型超聲波破碎儀，美國Sonics公司生產(chǎn)。

1.3 重組質(zhì)粒構(gòu)建

1.3.1DHa菌株氯霉素（ Cm） 敏感試驗。濃度梯度：液體 LB 培養(yǎng)基為 2.0，4.0，6.0，8.0，10.0up/mL ；固體LB 培養(yǎng)基 為6.0，8.0，10.0，12.0，14.0up/mL將DHa菌株以 2% 接 種量接入LB液體和固體培養(yǎng)基，每組設置3個平行， 恒溫靜置培養(yǎng) 16h。

1.3.2DH5a感受態(tài)細胞制備及pMG36c質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化。DH5a菌株接種 LB 液體培養(yǎng)基， 振蕩培養(yǎng)至 OD600=0.5；培養(yǎng)物冰浴20min，7100g，4℃離心 10min ，分別用預冷滅菌 和 10% 甘油洗滌菌體，離心；預冷甘油懸浮菌體， 保存；感受態(tài)細胞冰上融化，加入0.5upuLMG36cDNA，混勻；混合物吸入預冷電轉(zhuǎn)化杯底部，電激，程序為2.5kV、200；向電轉(zhuǎn)化杯中加入920uL LB 培養(yǎng)基，移至離心管中， 37℃振蕩培養(yǎng) 0.5～1.0h ；涂布含 Cm 的LB固體培養(yǎng)基， 培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子。

1.3.3 pMG36c 質(zhì)粒提取及酶切驗證。轉(zhuǎn)化子在含 Cm 的LB液體培養(yǎng)基中活化，鏡檢，提取質(zhì)粒；將質(zhì)粒單酶切和雙酶切驗證，反應體系見表1。

1.3.4MG1363菌株 Cm 敏感性試驗。濃度梯度：GM17液體和固體培養(yǎng)基均為 2.0，4.0，6.0，8.0，10.0g/mL。 2% 接種量接入培養(yǎng)基中，每組設置3個平行， 30% 靜置培養(yǎng) 36～48h 。1.3.5MG1363菌株感受態(tài)細胞制備及電轉(zhuǎn)方法。參考王洋等[14]的方法，并進行優(yōu)化，即細胞生長狀態(tài)（ 、0.5，0.7，0.9，1.2） ，復壯時間 （1、3、5、7、9h） ，質(zhì)粒添加量（ 60，80，100，120，140ng） 和轉(zhuǎn)化電壓（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0kV ）為單因素。計算電轉(zhuǎn)化效率：

電轉(zhuǎn)化效率（CFU＼DNA}）=菌落總數(shù) （CFU DNA1.3.6重組質(zhì)粒 pMG36c-OprI 構(gòu)建。試劑盒提取 Pa27853 菌株基因組DNA；根據(jù)GenBank中 的OprI基因序列和pMG36c載體特點設計引物（表2），其中P32-F根據(jù)pMG36c載體上的P32啟動子序列進行設計。

以 Pa DNA為模板，PCR擴增 基因，反應體系見表3。擴增條件 共30個循環(huán)，最后 延伸 5min 。取5～LPCR產(chǎn)物用于 瓊脂糖凝膠電泳。

重組質(zhì)粒構(gòu)建：無縫連接試劑盒連接，總體系20uL，其中高效連接酶10.0uLpMG36c 質(zhì)粒 3.5upL，I基因片段6.5uL搖勻， 水浴 30min 。

1.4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化MG1363菌株

1.4.1重組質(zhì)粒。 5uL與80uL感受態(tài)細胞混勻，加入mathrm預冷電轉(zhuǎn)化杯，電激，程序為 2.5kV，200，25u， 。向電轉(zhuǎn)化杯中加入920uL LB 培養(yǎng)基，移至離心管中 靜置培養(yǎng) 0.5～1.0h 。濃縮菌液，涂布含 Cm 的LB固體培養(yǎng)基， 培養(yǎng)，篩選轉(zhuǎn)化子。

1.4.2轉(zhuǎn)化子驗證。菌落PCR反應體系： 2×Es Taq Master-mix菌液 8uL，OPRI-F和OPRI-R（ 10pmoluL}）均1uL擴增條件 90s ，共30個循環(huán)，最后 延伸 5min 。

1.4.3轉(zhuǎn)化子重組質(zhì)粒提取與酶切驗證。方法同\"1.3.3”。

1.4.4轉(zhuǎn)化子重組質(zhì)粒測序驗證。以P32-F為測序引物，對提取得到的重組質(zhì)粒進行測序驗證。測序結(jié)果由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司提供，利用Snapgene軟件進行序列對比。

1.5重組菌株OprI蛋白表達檢測重組菌株和MG1363菌株菌體超聲破碎后SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測，分離膠 15% 、濃縮膠 5% ；染色，凝膠脫色。

1.6重組載體疫苗安全性、異常毒性試驗

1.6.1疫苗制備。重組菌株按 1% V/V比例接種含 cm 的GM17液體培養(yǎng)基， 30% 培養(yǎng) 至1.0，離心收集菌體，PBS溶液洗滌2次，制成濃度 （20 CFU/mL 菌懸液， 保存。

1.6.2疫苗安全性、異常毒性試驗。20只清潔級小鼠，隨機分成4組：對照組、灌胃組、皮下注射組和鼻腔噴霧組，每組5只。對照組不給予疫苗；灌胃組每天灌胃 0.2mL 疫苗1次；皮下注射組每天皮下注射 0.25mL 疫苗1次；鼻腔噴霧組每天鼻腔噴霧 0.05mL 疫苗1次。正常飼喂7d，觀察小鼠健康情況，7d后稱重。

1.7重組載體疫苗保護力試驗

1.7.1 PaO1 菌株最小致死量（MLD）測定。 PaO1 菌株于 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng) 12～16h ，生理鹽水稀釋成 3.2× "＼mL等濃度梯度菌懸液，分別腹腔注射5只小鼠，每只 0.5mL ，觀察3d，摸索使小鼠全部死亡的MLD。

1.7.2免疫試驗。60只小鼠平均分成2組，免疫1組用MG1363菌懸液灌胃免疫，免疫2組用重組載體疫苗灌胃免疫。濃度均為 ，每7d3次，每次 0.1mL ，共免疫21d，第22＼～28天用 PaO1 菌株新鮮菌懸液攻毒。

1.7.3攻毒試驗。首免后22＼～28天，免疫組每只小鼠腹腔注射1MLD的 PaO1 菌株新鮮菌懸液 0.5mL ；15只同批飼養(yǎng)的小鼠平均分成3組作對照，分別于腹腔注射2MLD、1MLD及 1/2MLD 的 PaO1 菌株新鮮菌懸液 0.5mL 。觀察3d，結(jié)果判定：對照組小鼠感染2MLD及1MLD者應全部死亡，感染 1/2MLD 者應有部分死亡，計算免疫組小鼠保護率。

1.8小鼠血清抗體變化測定試驗從2個免疫組小鼠中各隨機抽選5只，標記，免疫前和首免后28d，尾靜脈取血分離血清，ELISA法檢測，方法參考文獻[15]。統(tǒng)計學分析軟件為SPSS20.0軟件， Plt;0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1重組質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果

2.1.1DH5a菌株 Cm 敏感試驗結(jié)果。由表4可知，篩選DH5a菌株轉(zhuǎn)化子的 Cm 濃度，LB液體培養(yǎng)基為 6.0ug/mL LB 固體培養(yǎng)基為12.0ug/mL"。

2.1.2質(zhì)粒pMG36c提取及酶切驗證結(jié)果。質(zhì)粒pMG36c大小為 3833bp ，被 S a cI，K p nI，S a lI，X b aI，H i n d Ⅲ5種限制性內(nèi)切酶酶切后，電泳條帶與目標條帶大小相符，可確定提取的質(zhì)粒 pMG36c 具有上述所有酶切位點（圖1）。采用 I和HindII2種酶雙酶切，得到線性pMG36C質(zhì)粒，電泳條帶清晰單一，大小正確，可用于后續(xù)連接（圖2）。

注：M.Marker；1.pMG36c質(zhì)粒；2＼～6.SacI、KpnI、SalI、XbaI、HindⅢ酶切質(zhì)粒。

Note：M.Marker；1.pMG36cplasmid；2-6.SacI，KpnI，SalI，XbaI， Hind I enzyme digestion plasmids.

Fig.1Verification results of single enzyme digestion of plasmid pMG36c

2.1.3MG1363菌株 Cm 敏感試驗結(jié)果。篩選MG1363菌株轉(zhuǎn)化子的 Cm 濃度，GM17液體培養(yǎng)基為 6.0g/mL，GM17固體培養(yǎng)基為8.0g/mL（表5）。

2.1.4MG1363感受態(tài)細胞制備及電轉(zhuǎn)優(yōu)化試驗結(jié)果。 ，質(zhì)粒量 100ng ，復壯時間 和轉(zhuǎn)化電壓 2.5kV 時，轉(zhuǎn)化效率可達到425CFUDNA（表6）。

2.1.5重組質(zhì)粒構(gòu)建試驗結(jié)果。提取的 基因組DNA見圖3。OprI基因片段大小為 252bp ，PCR擴增產(chǎn)物大小與目標條帶相符，擴增片段濃度較大，效果較好，可用于后續(xù)連接（圖4）。

OprI基因片段與線性質(zhì)粒連接后，電轉(zhuǎn)MG1363感受態(tài) 細胞。轉(zhuǎn)化子均可以擴增出相應的目的基因，大小正確，條帶清晰明亮，無雜帶，表明連接成功（圖5）。

注：M.Marker；1.pMG36c/SacI+HindI酶切質(zhì)粒。

Note：M.Marker；1.PMG36c/SacI+Hind II enzyme digested plasmid.

Note：↑↑↑↑↑indicatesthattherearemanybacterialcells； ↑↑↑↑ indicates multiple bacterial cells； ↑↑↑ indicates a higher number of bacterial cells； ↑↑ indicates that there are not many bacterial cells；↑ indicatesthat there areveryfewbacterial cells；√indicates no bacterial cells.

注：M.Marker；1.Pa27853菌株基因組 DNA Note：M.Marker；1.Genomic DNA of Pa27853 strain.

注：M.Marker；1.OprI基因PCR特異性產(chǎn)物。

Note：M.Marker；1.PCR specificproducts of Oprl gene.

對轉(zhuǎn)化子中提取的重組質(zhì)粒進行單酶切（ III和雙酶切（ ），雙酶切獲得2條DNA片段，

注：M.Marker；1＼～3.OPRI +pMG36c 轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物；4.無菌水 （OprI-F/OprI-R）PCR產(chǎn)物。

Note：M.Marker；1-3.PCR product of OPRI+pMG36c transformant； 4.PCR products of sterile water（OprI-F/Opri-R） .

其中1條為 3500bp 左右，與 pMG36c 空載體單酶切后條帶大小一致；另1條為 250bp 左右，與 基因大小一致，可判定重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功（圖6）。

轉(zhuǎn)化子重組質(zhì)粒測序結(jié)果與目的基因序列比對，二者 注：M.Marker；1.pMG36c；2.pMG36c/SacI；3.pMG36c/Hind II；4. 重組質(zhì)粒OprI-pMG36c；5.重組質(zhì)粒OprI-pMG36c/SacI；6.重 組質(zhì)粒OprI-pMG36c/Sac I+HindIII；7.OprI基因。

Note：M.Marker；1.pMG36c；2.pMG36c/SacI；3.pMG36c/Hind III； 4.Recombinantplasmid OprI-pMG36c；5.Recombinant plasmid OprI-pMG36c/SacI；6.Recombinant plasmid OprI-pMG367/Sac I+Hind III；7. OprI gene.

100% 等同，重組質(zhì)粒SacI和HindⅢ酶切位點及其各自前后3個特異性堿基序列均準確無誤，證實重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化入MG1363菌株感受態(tài)細胞（圖7）。

注：A.重組質(zhì)粒 在SacI位點處測序結(jié)果；B.重組質(zhì)粒OprI-pMG36c在HindI位點處測序結(jié)果。

2.2重組菌株OprI蛋白表達檢測結(jié)果OprI蛋白分子量約 8kD ，與對照組MG1363菌株相比，重組菌株的整體蛋白和菌體沉淀中均有約 8kD 大小的蛋白表達，與目的蛋白大小一致，表明表達 蛋白的重組菌株構(gòu)建成功（圖8）。2.3重組載體疫苗安全性、異常毒性試驗結(jié)果7d后，全部小鼠均健存且體重明顯增加，對照組與3個接種組體重增加平均值無顯著差異（ Pgt;0.05） ，表明所構(gòu)建的重組載體疫苗安全試驗、異常毒性試驗合格（表7）。

2.4重組載體疫苗保護力試驗

2.4.1 PaO1 菌株最小致死量測定結(jié)果。 PaO1 菌株濃度 CFU/mL，攻毒劑量 0.5mL ，是使小鼠全部死亡的最小濃度，因此， PaO1 菌株最小致死量為 CFU/mL（表8）。

2.4.2疫苗保護力試驗結(jié)果。 PaO1 菌株攻毒3d后，對照組小鼠感染2MLD和1MLD菌液者均全部死亡，感染1/2MLD菌液者有部分死亡，表明攻毒試驗合理可信；免疫1組注：M.Proteinmarker；1.重組菌株沉淀；2.重組菌株上清液；3.乳酸乳球菌MG1363；4.重組菌株整體蛋白。

Note：M.Protein marker；1.Recombinant strain precipitation；2.Recombinant bacterial strain supernatant；3. Lactococcus lactis MG1363；4.Recombinant strainwhole protein.

（MG1363菌株免疫）小鼠保護率為 6.67% ，免疫2組（疫苗免疫）小鼠保護率為 76.67% 。這表明重組載體疫苗具有較好的免疫保護效果（表9）。

2.5小鼠血清抗體變化測定結(jié)果免疫2組（疫苗免疫）28d 后， IgG 和IgE水平均明顯高于免疫1組（MG1363菌株免疫）（表10）。

3結(jié)論

該研究結(jié)果表明，構(gòu)建的表達銅綠假單胞菌OprI蛋白的乳酸乳球菌重組載體疫苗具有較好的安全性，無異常毒性；免疫后可使小鼠血清IgG和IgE抗體水平顯著升高，對銅綠假單胞菌 PaO1 菌株的攻擊具有較好的保護效果。該研究結(jié)果證實了前人所述的OprI蛋白具有較好的交叉免疫保護效果，是良好的疫苗研制靶向蛋白這一結(jié)論

4討論

銅綠假單胞菌OprI蛋白是一種良好的疫苗研制靶向蛋白，目前已經(jīng)研制出 蛋白疫苗、以沙門氏菌和雙歧桿菌為載體的OprI蛋白重組疫苗等。重組載體疫苗是當前疫苗研究的熱點和發(fā)展趨勢，但以減毒沙門氏菌為載體，可能對老年人、兒童和免疫缺陷者有一定風險。乳酸乳球菌作為基因表達載體有著天然的優(yōu)勢，首先，它是食品級微生物，安全無毒，不在動物腸道中定殖，不會持續(xù)刺激機體免疫系統(tǒng)；其次，具有易于操作、轉(zhuǎn)化率高的優(yōu)點，自身產(chǎn)生蛋白少，不降解表達的外源蛋白；第三，乳酸乳球菌可作為免疫佐劑，協(xié)同表達的外源蛋白激發(fā)機體免疫系統(tǒng)工作；最后，乳酸乳球菌作為表達載體技術(shù)非常成熟，目前已成功表達多種蛋白、細胞因子和酶。該研究構(gòu)建了表達 蛋白的重組乳酸乳球菌載體疫苗，通過灌胃、皮下注射和鼻腔噴霧接種小鼠方式證實了載體疫苗安全，無異常毒性；采用免疫攻毒試驗和小鼠血清抗體水平測定試驗評價載體疫苗的免疫效果，證實載體疫苗可有效提升小鼠血清IgG和IgE抗體水平，并對銅綠假單胞菌 PaO1 菌株的攻擊有較好的保護效果。OprI蛋白重組乳酸乳球菌載體疫苗的成功制備為研發(fā)可防治銅綠假單胞菌感染的疫苗奠定了堅實基礎。