Screening and fermentation characteristics of biocontrol bacterium BM-O3 antagonistic to Fusariumsolani

LI Xiang1HAO Haohao1WU Junlin1XU Xiaojing1ZHAO Jiajia1SUNHuizhong2 （1Zhumadian Branch of Henan Provincial Tobacco Company，Zhumadian 463ooo， China； 2College of Agriculture，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471OO3， China）

AbstractUsing plate isolation and antagonism assay techniques，a strain （designated as BM-O3）antagonistic to Fusarium solani （causalagent of tobacco root blackrot）was isolated fromtobacco rhizosphere soil.Its biocontrol effcacy wasvalidatedthrough potexperiments，and its fermentationcharacteristics weredetermined.ResultsshowedthatBM-03 exhibited an inhibition rate of 52.78% against F .solani in plate antagonism tests，while pot experiments demonstrated a biocontrol efficacy of 78.03% against root black rot. Further fermentation characterization revealed that inorganic salts had minimal impact onBM-O3’s fermentation，whereas soluble starch，yeast extract powder，and soybean meal were identified as optimal nutrients for itsgrowthand fermentation.The optimized fermentation medium wereas follws： soluble starch 30g ， soybean meal 6 g， yeast extract powder 4 g， NaCl 0.5g MgSO ·7H 2 0 0.5 g， FeSO ： ，finally adjusted to 1L with pH 8.0， 7% inoculation volume， 100mL medium per flask，and cultivation at This study provides foundational data forthe development and application of BM-O3 asa biocontrol agent.

Keywordstobacco；biocontrol bacteria； screening； control efciency；fermentation characteristics

煙草根黑腐病是一種煙草真菌病害，在煙草種植區(qū)域發(fā)生較普遍，且發(fā)生程度不一。因其具有土壤傳播特性，該病害的侵染源較為復(fù)雜，導(dǎo)致其防治相對(duì)困難。尤其是隨著各種植煙區(qū)煙糧間作套種模式的推廣應(yīng)用，使得煙草真菌病害的防治面臨更加復(fù)雜的情況。

在煙草原料生產(chǎn)領(lǐng)域，生態(tài)煙草和綠色煙草的生產(chǎn)理念被普遍認(rèn)同并付諸實(shí)踐。生產(chǎn)上，根黑腐病等煙草真菌病害的防治已從化學(xué)防治轉(zhuǎn)變?yōu)橐陨锓乐螢橹鲗?dǎo)的防治模式。生物防治因其環(huán)境友好和安全性而具有明顯優(yōu)勢(shì)，然而，其防治效果的緩慢性、實(shí)施條件的嚴(yán)格性以及功能菌株防效的衰減性，是當(dāng)前普遍面臨的現(xiàn)實(shí)問題。如宋玉娟等研究發(fā)現(xiàn)，在溫室盆栽試驗(yàn)條件下，棘孢木霉T-6對(duì)煙草根黑腐病的防治效果達(dá) 75.14% ；易龍等研究表明，木霉菌TB72菌株對(duì)煙草根黑腐病病原菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)抑制效果顯著，其在實(shí)驗(yàn)室條件下的防效達(dá) 84.5% 。因此，生物防治煙草根黑腐病在理論和實(shí)踐上均具備可行性。持續(xù)開展煙草根黑腐病防治研究仍具有重要現(xiàn)實(shí)意義，尤其是針對(duì)生防微生物資源的篩選更新和生防菌功能條件的優(yōu)化，這方面研究對(duì)生防菌劑的開發(fā)和田間應(yīng)用指導(dǎo)起著關(guān)鍵作用。本研究從煙草根際土壤中篩選出一株煙草根黑腐病生防菌BM-03，并對(duì)其防效和發(fā)酵特性進(jìn)行研究，為煙草根黑腐病生防菌劑的開發(fā)提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

菌株分離土壤樣品采自省確山縣植煙區(qū)煙田；煙草根黑腐病病原菌茄鐮孢菌（Fusariumsolani）由科技大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院提供；供試煙草品種為云煙87。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1菌株篩選 土壤樣品按照常規(guī)平板稀釋法進(jìn)行平板培養(yǎng)，于 條件下恒溫培養(yǎng)6d，3次重復(fù)，觀察記錄菌落生長(zhǎng)情況，并純化保藏；采用平板對(duì)崎法進(jìn)行生防菌篩選[3]。

1.2.2煙草根黑腐病的盆栽防效驗(yàn)證試驗(yàn) 設(shè)兩個(gè)處理組：對(duì)照組（CK）僅接種茄鐮孢菌；實(shí)驗(yàn)組接種茄鐮孢菌孢子懸浮液后，在煙草根莖部均勻接種 的驗(yàn)證菌株發(fā)酵液。每組處理均設(shè)置3次重復(fù)。接種40d后，依據(jù)文獻(xiàn)[4-5]所述方法，統(tǒng)計(jì)分析病情指數(shù)及防治效果。

1.2.3發(fā)酵特性分析 種子液的制備參考文獻(xiàn)[6]所述方法，挑取菌餅接入液體培養(yǎng)基，制成種子液，備用。1.2.3.1單因素剔除試驗(yàn) 在微生物代謝過程中，不同碳源和氮源的利用效率存在差異。為探究不同碳源和氮源對(duì)產(chǎn)物產(chǎn)量的影響，設(shè)計(jì)單因素排除試驗(yàn)，分別配制排除單一碳源（可溶性淀粉）、氮源（ 和無(wú)機(jī)鹽 和 的發(fā)酵培養(yǎng)基，其他培養(yǎng)條件保持不變7。

1.2.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化 （1）碳源優(yōu)化。分別以相同質(zhì)量的果糖、蔗糖、甘露醇、麥芽糖和葡萄糖替代可溶性淀粉，配制不同碳源的培養(yǎng)基，其他條件保持不變，于28℃、150r/min條件下振蕩培養(yǎng) 7d 隨后測(cè)定菌體質(zhì)量濃度及抑菌活性。菌體質(zhì)量濃度用質(zhì)量/體積分?jǐn)?shù)表示[8-9]。抑菌活性的測(cè)定采用牛津杯法進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)[10]。（2）氮源優(yōu)化。分別以相同質(zhì)量的蛋白陳、酵母粉、黃豆粉、尿素、 和 替代 配制培養(yǎng)基，其他條件保持不變。（3）氮源比例優(yōu)化。將黃豆粉和酵母粉按 4：1，3：2 、2：3和 的比例配制培養(yǎng)基，其他條件保持不變。（4）正交試驗(yàn)。利用正交法[8-10設(shè)計(jì)以碳源、氮源及濃度梯度二因素四水平正交試驗(yàn)。1.2.3.3發(fā)酵條件優(yōu)化（1）接種量。分別按3%.5%.7%.9%.11%.13%.15% 的接種量接入優(yōu)化培養(yǎng)基，其他條件保持不變，確定最適接種量。（2）搖床轉(zhuǎn)速。設(shè)置搖床轉(zhuǎn)速為 120，140，160，180，200 220r/min ，其他條件保持不變，確定最佳培養(yǎng)轉(zhuǎn)速。 優(yōu)化。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至 4.0，5.0，6.0，7.0，8.0 和9.0，其他條件保持不變，確定最適 pH（4） 發(fā)酵溫度。將發(fā)酵溫度調(diào)節(jié)至 22、25、28、31、34、37℃，其他條件保持不變，確定最佳發(fā)酵溫度。（5）發(fā)酵時(shí)間。分別培養(yǎng) ，其他條件保持不變，確定最佳發(fā)酵時(shí)間。（6）裝液量。在 250mL 三角瓶中分別裝入 發(fā)酵液，其他條件保持不變，確定最適裝液量。以上處理均設(shè)3次重復(fù)。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用Excel軟件作圖。

2結(jié)果與分析

2.1煙草根黑腐病生防菌株的篩選

采用稀釋涂布和平板對(duì)崎試驗(yàn)，從煙草根際土壤中分離得到1株拮抗煙草根黑腐病病原菌的菌株，編號(hào)BM-03。其抑菌圈直徑為 13.3mm ，抑菌率為52.78% 。抑菌效果如圖1所示。

2.2 菌株BM-03的生防效果

將煙株進(jìn)行盆栽培養(yǎng)20d后，先用煙草根黑腐病病原菌孢子懸浮液灌根處理， 24h 后再用BM-03菌懸液處理。煙株生長(zhǎng)40d后進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果顯示，接種BM-03菌株的煙株根系白嫩，根須發(fā)達(dá)，分支數(shù)量較多，地上生物量明顯增加，整體生長(zhǎng)狀況良好，對(duì)根黑腐病的防治效果達(dá) 78.03% ；而未接種BM-03菌株的對(duì)照組煙株則表現(xiàn)出較嚴(yán)重的根黑腐病癥狀（圖2）。

（A）煙株地上情況（上排為接種BM-03的防治煙株；下排為未接種BM-03的對(duì)照煙株）；（B）煙株根部癥狀（左側(cè)為未接種BM-03的對(duì)照株根系；右側(cè)為接種BM-03的防治株根系）。

2.3菌株BM-03的發(fā)酵特性

2.3.1剔除試驗(yàn) 單因素剔除試驗(yàn)結(jié)果表明，剔除氮源 和碳源（可溶性淀粉）對(duì)菌株BM-03的菌濃度和抑菌帶寬的影響較大，而單因素剔除無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌株BM-03菌濃度和抑菌帶寬的影響較?。▓D3）。

2.3.2碳源篩選 不同碳源培養(yǎng)基中，可溶性淀粉最有利于菌株BM-03的生長(zhǎng)（表1），顯著高于其他處理（ 。因此，綜合考慮選用可溶性淀粉作為最佳碳源。

2.3.3氮源篩選 不同氮源處理中，酵母粉和黃豆粉更適合菌株BM-03的發(fā)酵，菌體濃度分別為78.52和 71.06g/L ，抑菌帶寬分別為15.77和 15.29mm （表2），顯著高于其他處理 Plt;0.05） 。綜合考慮，選用酵母粉和黃豆粉作為菌株BM-03發(fā)酵培養(yǎng)的氮源組合。

2.3.4不同氮源比例篩選 由表3可知，菌株BM-03在黃豆粉和酵母粉比例為2：3和3：2時(shí)發(fā)酵獲得的菌體較多，分別為83.17和 81.07g/L ，抑菌帶寬分別為15.86和 16.45mm 。其中，3：2比例組合的菌濃度和抑菌帶寬優(yōu)于其他組合 （Plt;0.05） 。綜合考慮，選用黃豆粉和酵母粉比例3：2作為氮源組合進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3.5正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果 綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)定正交試驗(yàn)因素水平（表4）。正交試驗(yàn)結(jié)果顯示（表5），編號(hào) 組合的菌濃度較高和抑菌帶最大，分別為 115.37g/L 和 17.01mm ，較優(yōu)化前提高 134.59% ，說明菌株生長(zhǎng)良好。最終確定最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方（1L）：可溶性淀粉30g，黃豆粉6g，酵母粉

2.3.6培養(yǎng)基發(fā)酵條件優(yōu)化 在發(fā)酵初期，接種量和轉(zhuǎn)速對(duì)菌株BM-03菌體生長(zhǎng)和抑菌帶寬的影響不同，當(dāng)接種量為 7% 時(shí)，菌濃度和抑菌帶寬最大，分別為 104.57g/L 和 17.50mm （圖4A）；當(dāng)轉(zhuǎn)速為 160r/min 時(shí)，菌濃度和抑菌帶寬最大，分別為 109.00g/L 和 17.90mm （圖4B）；當(dāng) pH在 4.0～ 9.0時(shí)，菌株均能生長(zhǎng)且有抑菌活性，當(dāng)pH為8.0時(shí)，菌濃度較高且抑菌帶寬最大，分別為115.01g/L 和 17.74mm （圖4C）。當(dāng)培養(yǎng)溫度在 時(shí)，菌株BM-03生長(zhǎng)最好，當(dāng)溫度低于 或大于37℃時(shí)，菌體生長(zhǎng)受到抑制（圖4D）。菌株在發(fā)酵第2～8天時(shí)菌體呈持續(xù)生長(zhǎng)趨勢(shì)，至第8天菌體生長(zhǎng)量和抑菌帶寬均達(dá)到最大，為124.28g/L 和 18.76mm ，第10天開始下降（圖4E）。在 250mL 的三角瓶中，裝液量為 時(shí)菌濃度和抑菌帶寬達(dá)到最大，分別為 115.00g/L 和18.50mm （圖4F）。

3結(jié)論與討論

煙草作為一種特色經(jīng)濟(jì)作物，對(duì)植煙區(qū)煙農(nóng)及地方經(jīng)濟(jì)具有較大影響。煙草病害的防治是提升煙草栽培管理質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是影響煙草原料產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素之一。在煙草生產(chǎn)中，生物防治煙草病害被廣泛接受并付諸實(shí)踐[11-12]。煙草根黑腐病作為一種土傳病害，其發(fā)生及為害程度受多種因素影響，其致病病原菌種類繁多，其中茄鐮孢菌（Fusariumsolani）是較為常見的一種病原菌，其分布廣且危害性大。在實(shí)際生產(chǎn)中，常采用生物防治配合栽培措施的方法來控制煙草根黑腐病，目前該病害的生防菌資源尚顯單—[13-14]。本研究篩選得到的BM-03菌株對(duì)該病害具有較好的防治效果，盆栽驗(yàn)證試驗(yàn)條件下生防效果達(dá) 78.03% ，開發(fā)與應(yīng)用潛力較大。功能菌發(fā)酵特性的研究是微生物資源開發(fā)與利用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[15-16]。通過發(fā)酵特性測(cè)定，無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌株BM-03發(fā)酵特性的影響較小，而可溶性淀粉、酵母粉和黃豆粉是該菌株生長(zhǎng)發(fā)酵的適宜營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。優(yōu)化后的最佳發(fā)酵條件為可溶性淀粉 30g 黃豆粉6g酵母粉 ，總體積定容至1L，并將pH調(diào)節(jié)至8.0，接種量 7% 、裝液量 ，于 恒溫條件下進(jìn)行培養(yǎng)。本研究對(duì)BM-03生防菌劑的開發(fā)及田間應(yīng)用具有一定指導(dǎo)意義。

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