關(guān)鍵詞槲皮素；TLR4/IRAK4/NF-κB信號(hào)通路；過敏性鼻炎；炎癥反應(yīng)；作用機(jī)制

過敏性鼻炎（allergicrhinitis，AR）屬于耳鼻喉科常見的免疫慢性炎癥疾病，臨床癥狀主要表現(xiàn)為鼻腔瘙癢、鼻塞、打噴嚏、流涕等，常伴隨鼻竇炎、鼻息肉、中耳炎、哮喘等疾病發(fā)生，嚴(yán)重影響患者正常生活，加之其發(fā)病率高且反復(fù)難愈，已成為世界公共的衛(wèi)生難題[1]。目前，AR患者主要通過服用鼻內(nèi)抗膽堿能藥、抗組胺（histamine，HIS）藥、糖皮質(zhì)激素等進(jìn)行治療，雖然服藥后病情可得到緩解，但長期服用副作用顯著[2]。因此，尋求安全的、療效顯著的新型治療AR的藥物至關(guān)重要。

槲皮素作為一種黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抗過敏等多種藥理作用，在治療變應(yīng)性疾病方面具有重要作用[3]。研究顯示，槲皮素可通過平衡輔助性T細(xì)胞1（helperTcells1，Th1）/Th2、Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatoryTcells，Treg）比例，降低血清中免疫球蛋白E（immunoglobulinE，IgE）、HIS及炎癥因子水平，從而減輕AR癥狀[4]。Toll樣受體4（Toll-likereceptor4，TLR4）/白細(xì)胞介素1（interleukin1，IL-1）受體相關(guān)激酶（IL-1receptor-associatedkinase，IRAK4）/核因子κB（nuclearfactorκB，NF-κB）信號(hào)通路作為經(jīng)典免疫炎癥相關(guān)通路，參與了AR的發(fā)生發(fā)展，抑制TLR4/IRAK4/NF-κB信號(hào)通路的激活可減少炎癥因子的釋放，抑制過敏性炎癥反應(yīng)，從而減輕AR癥狀[5]。但槲皮素能否通過調(diào)控TLR4/IRAK4/NF-κB信號(hào)通路來減輕AR大鼠的炎癥反應(yīng)尚不清楚。鑒于此，本研究從TLR4/IRAK4/NF-κB信號(hào)通路出發(fā)，初步探討槲皮素對AR大鼠炎癥反應(yīng)的影響及作用機(jī)制，以期為AR治療提供新思路。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有：SuPerMax3000FL型多功能酶標(biāo)儀（上海閃譜生物科技有限公司）、BX51型顯微鏡（日本Olympus公司）、ChemiDocXRS+型凝膠成像分析系統(tǒng)（美國ThermoFisherScientific公司）、BDFACSCalibur型流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用的主要藥品與試劑有：槲皮素對照品（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)Q463731，純度≥95%），TLR4激活劑脂多糖（lipopolysaccharide，LPS；北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)L8880，純度≥99%），卵白蛋白（ovalbumin，OVA；四川省維克奇生物科技有限公司），IgE、HIS酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定（ELISA）試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號(hào)分別為E-EL-R0517、E-EL-0032），白細(xì)胞介素17（interleukin-17，IL-17）、IL-10ELISA試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司，批號(hào)分別為SBJ-R0601、SBJ-R0095），TLR4抗體（南京萊富賽生物科技有限公司，批號(hào)35463），磷酸化IRAK4（p-IRAK4）、IRAK4抗體（深圳市豪地華拓生物科技有限公司，批號(hào)分別為PL0303692、PL0402581），磷酸化NF-κBp65（p-NF-κBp65）、NF-κBp65抗體（沈陽萬類生物科技有限公司，批號(hào)分別為WL02169、WL01980），辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司，批號(hào)8018021），CD3、CD4抗體（上海信裕生物科技有限公司，批號(hào)分別為bs-10498R、XY-02121），CD25、Foxp3、IL-17抗體[愛必信（上海）生物科技有限公司，批號(hào)分別為abs149147、abs118887、abs121447]，β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體（南京賽戈巍生物科技有限公司，批號(hào)48139）。

1.3 動(dòng)物

本研究所用動(dòng)物為健康SPF級(jí)SD成年雄性大鼠，共62只，體重（200±20）g，7～8周齡，購自湖北貝恩特生物科技有限公司[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（鄂）2021-0027]。將大鼠飼養(yǎng)在溫度（25±2）℃、濕度55%～65%、光照12h/黑暗12h的環(huán)境中，并給予充足食物與水。本研究已通過貝恩特生物中心動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（審批號(hào)：BNT-2023-0092）。

2 方法

2.1 AR大鼠模型構(gòu)建

所有大鼠先適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，然后將62只大鼠隨機(jī)分為對照組（Control組，n＝12）和造模組（n＝50）。造模組大鼠腹腔注射1mLOVA混懸液[0.3mgOVA、15mgAl（OH）3、1mL0.9%NaCl溶液]致敏，隔日注射1次，連續(xù)7次；實(shí)驗(yàn)第15天在造模大鼠雙側(cè)鼻腔中分別滴入0.05mLOVA混懸液繼續(xù)致敏，每天1次，連續(xù)7d[6]。對照組大鼠同步腹腔注射、滴鼻等體積生理鹽水。末次滴鼻后，觀察大鼠30min內(nèi)的撓鼻次數(shù)、噴嚏個(gè)數(shù)、流涕程度并進(jìn)行評(píng)分，總分≥5分表示造模成功[7]。最終共有48只大鼠造模成功。

2.2 分組與給藥

將48只造模成功的大鼠隨機(jī)分為AR組，槲皮素低、高劑量組（QUE-L、QUE-H組）和槲皮素高劑量+TLR4激活劑組（QUE-H+LPS組），每組12只。QUE-L組、QUE-H組大鼠分別灌胃17.5、35mg/kg槲皮素并尾靜脈注射10mL/kg生理鹽水[4]，QUE-H+LPS組大鼠灌胃35mg/kg槲皮素并尾靜脈注射0.4mg/kgLPS[8]，Control組和AR組大鼠灌胃10mL/kg生理鹽水并尾靜脈注射10mL/kg生理鹽水；每天給藥1次，連續(xù)21d。

2.3 鼻炎癥狀評(píng)分

末次給藥后30min內(nèi)，觀察大鼠撓鼻、流涕、打噴嚏癥狀，并進(jìn)行評(píng)分。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下[7]：撓鼻——1分，輕擦鼻幾次；2分，抓撓鼻頻繁；3分，撓鼻、撓面不止，到處摩擦。流涕——1分，流到鼻前孔；2分，過鼻前孔；3分，流涕滿面，掛滿須毛。打噴嚏——1分，1～3個(gè)；2分，4～10個(gè)；3分，11個(gè)及以上。

2.4 血清中IgE、HIS及炎癥因子水平檢測

鼻炎癥狀評(píng)分結(jié)束后，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠后取腹主動(dòng)脈血，取部分血樣離心收集上清液，然后按照ELISA試劑盒說明書方法檢測血清中IgE、HIS、IL-17、IL-10水平。

2.5 全血中免疫細(xì)胞比例檢測

取“2.4”項(xiàng)下剩余腹主動(dòng)脈血，并分離全血中的淋巴細(xì)胞，加入佛波酯、離子霉素、莫能菌素刺激，然后分別加入CD3+CD4+CD25+Foxp3+及CD3+CD4+IL-17+抗體（稀釋比例均為1∶1000），采用流式細(xì)胞儀檢測全血中Treg、Th17比例，并計(jì)算Th17/Treg比值。

2.6 鼻黏膜組織病理觀察

取血結(jié)束后，處死各組大鼠并取鼻黏膜組織。各組任選6只大鼠的鼻黏膜組織，用4%多聚甲醛固定，常規(guī)制備石蠟切片，脫蠟至水后進(jìn)行常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察切片并進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[9]：0分——上皮正常，纖毛完整，少量杯狀細(xì)胞；1分——杯狀細(xì)胞增多，可見少量炎癥細(xì)胞；2分——纖毛倒伏不整齊、偶見脫落，杯狀細(xì)胞密布，炎癥細(xì)胞增多；3分——上皮層破壞、結(jié)構(gòu)紊亂，纖毛大量脫落，杯狀細(xì)胞密布，炎癥細(xì)胞大量浸潤。

2.7 鼻黏膜組織中TLR4/IRAK4/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白檢測

取各組剩余6只大鼠的鼻黏膜組織，研碎后加入蛋白裂解液提取總蛋白，采用BCA法對總蛋白進(jìn)行定量，并進(jìn)行高溫變性。將變性蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳（120～150V電泳約1h）分離，再將蛋白質(zhì)濕轉(zhuǎn)（110V轉(zhuǎn)移60min）至PVDF膜上，然后加入脫脂奶粉封閉1h。加入β-actin（稀釋比例為1∶1000）以及TLR4、p-IRAK4、IRAK4、p-NF-κBp65、NF-κBp65一抗（稀釋比例均為1∶500），4℃孵育過夜；洗膜后，加入HRP標(biāo)記的二抗（稀釋比例為1∶10000），室溫孵育1h。洗膜后進(jìn)行曝光顯色，采集圖像并用ImageJ軟件分析條帶灰度值。以目的蛋白和內(nèi)參（β-actin）蛋白條帶灰度值比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量，并計(jì)算p-IRAK4/IRAK4、p-NF-κBp65/NF-κBp65比值。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS25.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布的以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 槲皮素對AR大鼠鼻炎癥狀評(píng)分的影響

與Control組[（0.50±0.09）分]比較，AR組大鼠鼻炎癥狀評(píng)分[（7.08±0.74）分]顯著升高（P＜0.05）；與AR組比較，QUE-L組、QUE-H組大鼠鼻炎癥狀評(píng)分[分別為（4.83±0.51）、（2.17±0.23）分]均顯著降低（P＜0.05），且QUE-H組較QUE-L組變化更明顯（P＜0.05）；與QUE-H組比較，QUE-H+LPS組大鼠鼻炎癥狀評(píng)分[（4.25±0.44）分]顯著升高（P＜0.05）。

3.2 槲皮素對AR大鼠血清中IgE、HIS水平的影響

與Control組比較，AR組大鼠血清中IgE、HIS水平均顯著升高（P＜0.05）；與AR組比較，QUE-L組、QUE-H組大鼠血清中IgE、HIS水平均顯著降低（P＜0.05），且QUE-H組較QUE-L組變化更明顯（P＜0.05）；與QUE-H組比較，QUE-H+LPS組大鼠血清中IgE、HIS水平均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

3.3 槲皮素對AR大鼠血清中炎癥因子水平的影響

與Control組比較，AR組大鼠血清中IL-17水平顯著升高（P＜0.05），IL-10水平顯著降低（P＜0.05）；與AR組比較，QUE-L組、QUE-H組大鼠血清中IL-17水平均顯著降低（P＜0.05），IL-10水平均顯著升高（P＜0.05），且QUE-H組較QUE-L組變化更明顯（P＜0.05）；與QUE-H組比較，QUE-H+LPS組大鼠血清中IL-17水平顯著升高（P＜0.05），IL-10水平顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

3.4 槲皮素對AR大鼠全血中免疫細(xì)胞比例的影響

與Control組比較，AR組大鼠全血中Th17比例和Th17/Treg比值均顯著升高（P＜0.05），Treg比例顯著降低（P＜0.05）；與AR組比較，QUE-L組、QUE-H組大鼠全血中Th17比例和Th17/Treg比值均顯著降低（P＜0.05），Treg比例均顯著升高（P＜0.05），且QUE-H組較QUE-L組變化更明顯（P＜0.05）；與QUE-H組比較，QUE-H+LPS組大鼠全血中Th17比例和Th17/Treg比值均顯著升高（P＜0.05），Treg比例顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表3。

3.5 槲皮素對AR大鼠鼻黏膜組織病理變化的影響

Control組大鼠鼻黏膜組織形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常，無明顯病理變化；AR組大鼠鼻黏膜組織損傷嚴(yán)重，上皮細(xì)胞出現(xiàn)部分脫落，杯狀細(xì)胞增生，可見細(xì)胞間質(zhì)水腫、毛細(xì)血管擴(kuò)張及明顯炎癥細(xì)胞浸潤；QUE-L組、QUE-H組大鼠鼻黏膜組織輕微損傷，上皮細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)相對完整，存在少量炎癥細(xì)胞浸潤；QUE-H+LPS組大鼠較QUE-H組鼻黏膜組織病理損傷加重。

與Control組[（0.17±0.02）分]比較，AR組大鼠鼻黏膜組織病理評(píng)分[（2.67±0.31）分]顯著升高（P＜0.05）；與AR組比較，QUE-L組、QUE-H組大鼠鼻黏膜組織病理評(píng)分[分別為（1.50±0.18）、（0.67±0.08）分]均顯著降低（P＜0.05），且QUE-H組較QUE-L組變化更明顯（P＜0.05）；與QUE-H組比較，QUE-H+LPS組大鼠鼻黏膜組織病理評(píng)分[（1.83±0.20）分]顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖1。

3.6 槲皮素對AR大鼠鼻黏膜組織中TLR4/IRAK4/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與Control組比較，AR組大鼠鼻黏膜組織中TLR4蛋白相對表達(dá)量及p-IRAK4/IRAK4、p-NF-κBp65/NF-κBp65比值均顯著升高（P＜0.05）；與AR組比較，QUEL組、QUE-H組大鼠鼻黏膜組織中TLR4蛋白相對表達(dá)量及p-IRAK4/IRAK4、p-NF-κBp65/NF-κBp65比值均顯著降低（P＜0.05），且QUE-H組較QUE-L組變化更明顯（P＜0.05）；與QUE-H組比較，QUE-H+LPS組大鼠鼻黏膜組織中TLR4蛋白相對表達(dá)量及p-IRAK4/IRAK4、p-NF-κBp65/NF-κBp65比值均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖2、表4。

4 討論

AR屬于常見鼻腔黏膜變應(yīng)性疾病，主要是特異性個(gè)體接觸變應(yīng)原后，Th被激活產(chǎn)生免疫應(yīng)答，B細(xì)胞被激活形成變應(yīng)原特異性IgE，然后與其受體結(jié)合釋放炎癥介質(zhì)HIS、IL-17等，作用于鼻黏膜組織，引發(fā)強(qiáng)烈的超敏反應(yīng)及炎癥[10]。黃酮類化合物槲皮素因具有抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抗過敏等多種功能，已成為治療AR的候選藥物。已有研究顯示，槲皮素可顯著減少AR小鼠打噴嚏和擦鼻的次數(shù)，降低IgE、IL-17、TNF-α和IL-6等炎癥因子水平，抑制過敏性炎癥反應(yīng)，改善受損的鼻黏膜，緩解AR癥狀[11―12]。本研究結(jié)果顯示，槲皮素可降低模型大鼠鼻炎癥狀評(píng)分和血清中IgE、HIS水平，進(jìn)一步驗(yàn)證了槲皮素可減輕AR大鼠癥狀。

免疫失衡及炎癥反應(yīng)與AR的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而Th17/Treg失衡在其中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。Th17與Treg是人體免疫的重要組成部分，正常情況下，兩者處于動(dòng)態(tài)平衡以維持機(jī)體免疫；而當(dāng)AR發(fā)生時(shí)，Th17比例明顯增加，導(dǎo)致其釋放的IL-17等炎癥因子增多，加速IgE、HIS生成，同時(shí)抑制Treg分泌IL-10等抑炎因子，進(jìn)而導(dǎo)致組織損傷，引發(fā)自身免疫性疾病[13]。研究顯示，抑制NF-κB表達(dá)可抑制Th17/Treg失衡，進(jìn)而降低IgE、IL-17水平，升高IL-10水平，改善AR豚鼠的炎癥反應(yīng)[14—15]。本研究結(jié)果顯示，槲皮素可降低Th17比例、Th17/Treg比值及IL-17水平，升高Treg比例及IL-10水平。這提示，槲皮素可通過調(diào)節(jié)Treg/Th17平衡，抑制AR大鼠的炎癥反應(yīng)。

TLR4/IRAK4/NF-κB信號(hào)通路作為免疫炎癥相關(guān)通路，在包括AR在內(nèi)的多種免疫炎癥相關(guān)疾病的發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。TLR作為廣泛表達(dá)在呼吸道鼻黏膜的樹突狀細(xì)胞及黏膜上皮細(xì)胞表面的天然免疫受體，當(dāng)機(jī)體受到外界免疫刺激時(shí)，TLR家族成員TLR4被異常激活后與細(xì)胞受體結(jié)合，導(dǎo)致IRAK4磷酸化，激活NF-κB，影響Treg/Th17平衡，促進(jìn)促炎因子表達(dá)，引發(fā)免疫應(yīng)答反應(yīng)[16―17]。研究顯示，抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路可減輕超敏反應(yīng)及炎癥，緩解鼻黏膜組織損傷，改善AR大鼠癥狀[7，18]。本研究結(jié)果顯示，槲皮素可降低AR大鼠鼻黏膜組織中TLR4蛋白相對表達(dá)量及p-IRAK4/IRAK4、p-NF-κBp65/NF-κBp65比值，提示其可能通過抑制TLR4/IRAK4/NF-κB信號(hào)通路活性，進(jìn)而抑制AR大鼠的炎癥反應(yīng)。為此本研究對高劑量槲皮素處理的AR大鼠給予TLR4激活劑LPS處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠鼻黏膜組織中TLR4蛋白相對表達(dá)量及p-IRAK4/IRAK4、p-NF-κBp65/NF-κBp65比值均升高，這說明槲皮素對AR大鼠炎癥反應(yīng)的抑制作用被逆轉(zhuǎn)，驗(yàn)證了槲皮素可通過抑制TLR4/IRAK4/NF-κB信號(hào)通路活性，減輕AR大鼠炎癥反應(yīng)。

綜上所述，槲皮素可通過抑制TLR4/IRAK4/NF-κB信號(hào)通路活性來抑制AR大鼠炎癥反應(yīng)。但AR發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，槲皮素可能通過調(diào)控其他通路影響AR發(fā)展進(jìn)程，加之本研究可能存在實(shí)驗(yàn)樣本量偏小、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容欠全面等問題，仍需更多實(shí)驗(yàn)加以佐證。