摘要：目的 探究蛇毒天然組分蛋白C激活劑（PCA）抑制ROS生成發(fā)揮抗血管內(nèi)皮細胞損傷作用及機制。方法 體外培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞系（HUVECs），建立內(nèi)皮細胞氧糖剝奪/再復氧（OGD/R）模型，檢測PCA和2-ME2（HIF1α 抑制劑）單獨處理及合用對細胞ROS 生成和HIF-1α、BNIP3、Beclin-1 蛋白表達的影響。OGD/R細胞模型轉染BNIP3 特異性siRNA，分為空載組、干擾組、PCA 組、干擾+PCA 組，檢測各組HIF1α、BNIP3、Beclin-1 蛋白表達量及ROS含量。結果 抑制HIF1α表達研究結果表明，PCA處理后蛋白HIF-1α、BNIP3、Beclin-1表達水平增高（Plt;0.05）而ROS含量明顯降低（Plt;0.05），2-ME2+PCA組與PCA組相比，蛋白HIF-1α、BNIP3、Beclin-1表達水平降低（Plt;0.05），而ROS含量增高（Plt;0.05），與之相反，PCA+DMOG組與PCA組相比，蛋白HIF-1α、BNIP3、Beclin-1 表達水平增高（Plt;0.05），而ROS 含量降低（Plt;0.05）。BNIP3 干擾研究結果顯示，干擾組+PCA組與干擾組相比，蛋白BNIP3 表達增高（Plt;0.05），HIF-1α 沒有變化（Pgt;0.05），ROS 含量降低（Plt;0.05）；干擾+PCA 組與PCA組相比蛋白 BNIP3、Beclin-1 蛋白表達水平降低（Plt;0.05），而ROS含量都增高（Plt;0.05）。結論 蛇毒PCA通過調(diào)控HIF-1α上調(diào)BNIP3抑制OGD/R誘導HUVECs 產(chǎn)生的ROS，發(fā)揮抗損傷作用。

關鍵詞：內(nèi)皮細胞氧糖剝奪/再復氧；蛋白C激活劑；線粒體自噬；HIF-1α

治療缺血性腦卒中的主要方式是通過溶栓恢復缺血組織供血，但缺血組織血流復灌會引起腦缺血/再灌注損傷（IRI）［1， 2］。有研究表明IRI的發(fā)病與ROS生成、炎癥反應、細胞鈣離子超載、自噬及細胞死亡等有關［3］，但其具體機制尚未研究清楚。因此通過減少細胞ROS生成可能是治療IRI 的潛在方式。ROS生成的發(fā)生與細胞供養(yǎng)狀態(tài)有關，在正常供氧情況下，線粒體進行氧化磷酸化產(chǎn)生能量不影響機體的活性氧（ROS）的生成［4］。在缺氧條件下，細胞進行無氧呼吸，ATP產(chǎn)量降低，離子交換通道失效進而導致細胞酶活的降低［5］，再復氧時，由于受損線粒體無法恢復完整的氧化磷酸化過程，產(chǎn)生氧自由基，從而引起ROS生成［6］。ROS生成會導致機體內(nèi)皮功能障礙、DNA損傷及局部炎癥反應等不良反應［7， 8］，導致細胞結構損傷引起細胞死亡［9］。因此深入探究缺血再灌注中ROS的調(diào)控機制有很重要的臨床價值。

蛇毒天然組分蛋白C激活物（PCA）是從皖南蝮蛇中分離出的一種能夠激活蛋白酶C的活性多肽，具有有效的抗凝、抗炎和抗氧化作用［10］。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)PCA對急性心肌梗死、心肌缺血再灌注［11， 12］、腦梗死［13， 14］等都具有保護作用，但其對血管內(nèi)皮細胞氧化應激損傷的作用和機制尚未有研究報道。本研究希望從PCA改善氧化應激的角度探究其生物學效應，為以后PCA應用于臨床治療心血管疾病打下基礎。

研究表明，缺氧誘導因子（HIF-1）在細胞適應缺氧過程中發(fā)揮作用［15］。HIF-1是異二聚體蛋白，由組成型表達的亞基HIF-1β和可激活亞基HIF-1α組成［16］。在供應氧氣充足下，HIF-1α亞基脯氨酸殘基被依賴于氧的脯氨酰-4-羥化酶（PHD）羥基化，從而使HIF-1α結合von Hippel-Lindau 蛋白（pVHL），并靶向E3 泛素-連接酶［12］。此外，抑制因子（FIH）能夠羥基化天冬酰胺殘基，從而防止HIF-1α結合蛋白P300/CBP。在缺氧條件下，PHD和FIH活性受到抑制，HIF-1α發(fā)生聚集并進行核轉運進入細胞核與HIF-1β亞基發(fā)生二聚化［17］，HIF-1α可增強細胞糖酵解［18， 19］，增強細胞有氧代謝的能力。并促進細胞的適應性反應，抑制ROS生成減輕損傷［20］，但其具體的分子機制尚不明確。因此，本研究采用HUVEC人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞氧糖剝奪/再復氧（OGD/R）模型，探究PCA對HIF-1α及BNIP3表達及ROS水平的影響，探討PCA抑制ROS生成的分子機制。

1 材料和方法

1.1 材料

人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞系（HUVECs）（上海酶研生物科技有限公司），蛇毒蛋白C激活劑（PCA）（皖南醫(yī)學院蛇毒研究所），F(xiàn)PS、DMEM培養(yǎng)基（Gibco），HIF?1α抑制劑2-ME2（MCE）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將人臍靜脈內(nèi)皮細胞放置于37 ℃、飽和濕度、體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)液為含體積分數(shù)10%胎牛血清（Clark）、100 U/mL 鏈霉素（Gibco）和100 U/mL青霉素（Gibco）的DMEM，培養(yǎng)液的更換頻率為2 d/次，等待細胞的生長密度至80%時進行細胞傳代。傳代方法如下：首先將傳代所需試劑提前預熱，棄去培養(yǎng)瓶內(nèi)舊的培養(yǎng)基，并用PBS（Beyotime）潤洗細胞15～20 s 后，吸棄PBS，吸取2 mL 消化液（0.25%Trypsin-0.53 mmol/L EDTA）（Beyotime）于培養(yǎng)瓶中，將其置于37 ℃培養(yǎng)箱中消化，顯微鏡下觀察，若細胞90%以上脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶，然后吸取兩倍體積的完全培養(yǎng)基（含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM）終止消化。吹打細胞至分散后轉移至離心管，1000 r/min離心5 min，根據(jù)密度以1∶3或1∶4的比例接種于新的培養(yǎng)瓶。

1.2.2 OGD/R 細胞模型構建 將細胞種進6/96孔板內(nèi)，細胞密度長到80% 左右之后隨機分成組對照組（Control 組）和實驗組。對照組細胞培養(yǎng)使用高糖培養(yǎng)基（含4.5 g/L D-Glucose）（Gibco）培養(yǎng)并且不做其他處理，實驗組細胞培養(yǎng)使用低糖培養(yǎng)基（含1.0 g/LD-Glucose）（Gibco），將實驗組細胞放到簡易密封盒里，并向其中充入 94% N2、5%CO2、1% O2混合氣體，使細胞處于缺氧環(huán)境，缺氧結束后，換成高糖培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。

1.2.3 PCA 濃度梯度配制 稱取1 mg的PCA晶體，拿到超凈臺無菌操作，先加入1 mL的PBS完全溶解PCA，配制成1 mg/mL的PCA母液，再用0.22 μm針頭濾過器過濾除菌后，放置-20 ℃ 冰箱保存，用時取出母液梯度稀釋為1、1.25、1.5、2.0、2.5、5、10、20、40 μg/mL。根據(jù)實驗需求分為：Control 組和PCA 組。

1.2.4 細胞蛋白提取 將6孔板每孔洗凈后加入100 μL裂解液（PMSF：RIPA=1∶99）（Beyotime），冰上裂解20 min后將細胞刮下轉移到預冷離心管中再進行破碎（45 Hz 60 s）。 破碎后離心 25 min（4 ℃ 12 000 r/min），用移液槍吸取離心后的上清至于新離心管中，再加入1/4上清體積的5×loading buffer（Beyotime），100 ℃ 煮沸10 min，-80 ℃ 冰箱保存。

1.2.5 Western blotting 配置10%濃度分離膠（Beyotime），5%濃度濃縮膠（Beyotime），凝固后點樣 2.5 μL，80 V樣品跑完濃縮膠后，繼續(xù)以120 V電壓進行電泳。電泳結束后，以三明治的形式組裝轉膜結構，275 mA，90 min轉膜，轉膜完畢后將膜取出用TBST清洗后用脫脂牛奶封閉15 min，室溫孵育一抗（Bioss）（1∶1000）4 h 后TBST清洗，再二抗（Beyotime）（1∶10 000）孵育1 h，孵育結束后清洗曝光。

1.2.6 HIF-1α抑制劑干預和激動劑處理及分組 在細胞中加入培養(yǎng)基（不含血清和抗生素）再分別加入2-ME2稀釋液和DMOG（APExBIO）稀釋液，輕輕搖晃細胞培養(yǎng)板，使得細胞與培養(yǎng)基接觸均勻，然后放到培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，時間結束后，替換成完全培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育24 h。根據(jù)實驗要求分為Control 組、模型組（OGD/R）、PCA組（OGD/R （6 h/2 h）+2 μg/mL PCA）、抑制劑組（OGD/R（ 6 h/2 h）+2-ME2）、抑制劑+PCA組（OGD/R（ 6 h/2 h）+2-ME2+2 μg/mL PCA）激動劑組（OGD/R （6 h/2 h）+2 μg/mL PCA+DMOG）。

1.2.7 BNIP3-siRNA 細胞轉染與分組 采用上海吉瑪基因有限公司合成的siRNA核苷酸，序列如表1，在細胞中加入培養(yǎng)基（不含血清和抗生素）和轉染復合物，輕輕搖晃細胞培養(yǎng)板，使得細胞與培養(yǎng)基接觸均勻，然后放到培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，時間結束后，替換成完全培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育48 h。根據(jù)實驗要求分為模型組［OGD/R（6 h/2h）+NC］、干擾組［OGD/R （6 h/2 h）+BNIP3 siRNA］、PCA組［OGD/R（ 6 h/2 h）+NC+2 μg/mL PCA］、BNIP3-siRNA+PCA 組［OGD/R （6 h/2 h）+BNIP3 siRNA+2 μg/mL PCA］。

1.2.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。各樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同缺氧復氧時間對細胞增殖能力的影響

CCK-8檢測結果顯示，在復氧時間相同時，隨著缺氧時間逐漸增長，A值逐漸降低，細胞增殖能力逐漸下降（圖1）。在缺氧3 h 時A值開始下降，細胞增殖能力開始下降（Plt;0.05），缺氧6 h時A值下降明顯，細胞增殖能力下降明顯，而缺氧9 h與12 h時細胞增殖能力大幅下降。所以我們選擇了6 h/2 h作為細胞的后續(xù)研究。

2.2 不同PCA濃度對血管內(nèi)皮細胞的影響

CCK-8檢測結果顯示，隨著PCA濃度的增加，血管內(nèi)皮細胞增殖能力降低，A450 nm值逐漸減小。4 μg/mL PCA組A450 nm值與對照組相比A450 nm值減小，HUVECs增殖能力下降明顯（Plt;0.05），PCA 最適安全濃度為2 μg/mL。因此選擇 2 μg/mL PCA濃度進行后續(xù)實驗（圖2）

2.3 PCA、2-ME2 和DMOG處理后各組細胞ROS生成情況

OGD/R（6 h/2 h）組與control 組比較產(chǎn)生的 ROS明顯增多（Plt;0.01），而 OGD/R（6 h/2 h）+2 μg/mL PCA組與 OGD/R（6 h/2 h）組相比產(chǎn)生 ROS降低（Plt;0.05）；OGD/R（6 h/2 h）+2-ME2+2 μg/mL PCA 組與OGD/R（6 h/2 h）+2 μg/mL PCA 相比ROS 明顯增多（Plt;0.01，圖3D/F），而OGD/R（6 h/2 h） +2 μg/mL PCA+DMOG組與OGD/R（6 h/2 h）+2 μg/mL PCA 相比ROS降低（Plt;0.05，圖3D/F）。

2.4 HIF1α 抑制及激動劑處理后各組HIF1α、BNIP3 和Beclin-1 蛋白表達情況

OGD/R（6 h/2 h）組和control組比較HIF1α、BNIP3和Beclin-1 蛋白表達都增高（Plt;0.05，圖4A～D）；OGD/R（6 h/2 h）+2 μg/mL PCA組與OGD/R（6 h/2 h）組相比HIF1α、BNIP3 和Beclin-1 蛋白表達都增高明顯（Plt;0.05，圖4A～D）；而OGD/R（6 h/2 h）+2-ME2組與 OGD/R（6 h/2 h）組相比HIF1α、BNIP3 和Beclin-1 蛋白表達都降低（Plt;0.05，圖4A～D）；OGD/R（6 h/2 h）+2-ME2+2 μg/mL PCA 組與OGD/R（6 h/2 h）+2-ME2 組相比HIF1α、BNIP3 和Beclin-1 蛋白表達都降低（Plt;0.05，圖4）；OGD/R（6 h/2 h）+2-ME2+2 μg/mL PCA 組與OGD/R（6 h/2 h）+2 μg/mL PCA相比 HIF1α、BNIP3 和Beclin-1 蛋白表達都降低（Plt;0.05，圖4），而OGD/R（6 h/2 h）+2 μg/mL PCA+DMOG組與OGD/R（6 h/2 h）+2 μg/mL PCA相比HIF1α、BNIP3 和 Beclin-1 蛋白表達都增高（Plt;0.05，圖4E～H）。

2.5 BNIP3抑制后mRNA表達水平以及各組活性氧染色情況

OGD/R（6 h/2 h）+BNIP3-siRNA 組與OGD/R+NC 組相比BNIP3 蛋白和mRNA 表達水平明顯降低（Plt;0.001，圖5）。OGD/R（6 h/2 h）+BNIP3-siRNA組與OGD/R+NC組比較ROS 明顯增多（Plt;0.05）。OGD/R（6 h/2 h）+NC+2 μg/mL PCA組與OGD/R+NC組相比ROS 含量降低（Plt;0.05），OGD/R（6 h/2 h）+BNIP3-siRNA+2 μg/mL PCA 組與 OGD/R（6 h/2 h））+BNIP3-siRNA 組相比ROS 降低，差異具有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05），而與OGD/R（6 h/2 h）+NC+2 μg/mLPCA 組相比ROS含量增多（Plt;0.05）。

2.6 各組 HIF1α、BNIP3 和 Beclin-1 蛋白表達情況

PCR 和Western blotting 結果顯示（圖6A～C）：OGD/R（6 h/2 h）+BNIP3-siRNA+2 μg/mLPCA 組與OGD/R（6 h/2 h）+BNIP3-siRNA組，比較BNIP3、Beclin-1蛋白表達水平增加（Plt;0.05），而HIF1α蛋白表達水平差異不具有統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05，圖6A～D）；OGD/R（6 h/2 h）+NC+2 μg/mL PCA 組與OGD/R（6 h/2 h）+NC 比較HIF1α、BNIP3 和Beclin-1 蛋白表達都增高（Plt;0.05，圖6A～D）；而OGD/R（6 h/2 h）+BNIP3-siRNA+2 μg/mLPCA組與OGD/R（6 h/2 h）+NC+2 μg/mL PCA 組相比BNIP3和 Beclin-1蛋白表達都降低（Plt;0.05）。

3 討論

缺血再灌注發(fā)生時，ROS大量生成［21］，引發(fā)脂質(zhì)過氧化與蛋白質(zhì)氧化［22］，造成血管內(nèi)皮細胞凋亡與壞死，使微血管損傷，造成微循環(huán)障礙［23， 24］，這對缺血再灌注的發(fā)展與患者的預后有重要影響所以尋找改善微循環(huán)氧化應激障礙具有重要的臨床意義。PCA是蛇的毒液中分離出來的一種成分，有抗炎、促進細胞存活和調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能等多方面的作用［25］，但PCA是否有抗氧化的作用和其具體機制鮮有報道，深入挖掘PCA的生物活性對實現(xiàn)天然蛇毒組分臨床轉化提供了很好的基礎實驗支持。隨著中國心腦血管發(fā)病率的逐年增高，PCA的抗氧化效應具有很好的應用前景，它可以有效減輕心腦血管疾病的損傷，彌補蛇毒藥物在這一方面的空缺。最新研究表明，HIF1-α在調(diào)控氧化應激方面具有重要的作用，在缺血再灌注中可以與其他轉錄因子結合，調(diào)控一系列基因的表達，發(fā)揮抗氧化應激損傷的作用。這些基因包括那些與抗氧化反應相關的酶，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）和催化酶（Catalase），通過誘導抗氧化酶的表達，增強細胞抵抗氧化應激的能力，清除體內(nèi)過量的活性氧，保護細胞免受氧化損傷［26-30］。由此本課題組提出猜想，PCA抑制ROS生成是否與HIF-1α相關。

為了驗證前期猜想，我們構建了內(nèi)皮細胞OGD/R（6 h/2 h）模型，篩選了PCA的最適安全濃度2 μg/mL，此濃度不會造成內(nèi)皮細胞的損傷，用PCA治療OGD/R時發(fā)現(xiàn)，PCA可抑制ROS 的生成；為了驗證PCA抑制ROS的生成是否與HIF-1α相關，我們使用了HIF-1α抑制劑2-ME2 和激動劑DMOG處理，用2-ME2 處理后，HIF-1α的表達被抑制，PCA的抑制ROS生成的作用顯著降低，與之相反，DMOG處理后，HIF-1α的表達被促進，這些結果提示PCA可能通過調(diào)控HIF-1α抑制ROS生成從而減輕損傷。有研究表明，HIF-1是一種轉錄因子，在缺氧時被激活，在抗氧化應激中通過誘導抗氧化酶的表達、調(diào)節(jié)谷胱甘肽代謝、抑制促氧化因子、等多種機制幫助細胞抵御氧化損傷［31］。這與我們的研究結果一致。同時，在內(nèi)皮細胞OGD/R（6h/2h）中發(fā)現(xiàn)HIF-1α可增強BNIP3 的表達，為了進一步驗證PCA是否可以通過HIF-1α調(diào)控BNIP3從而抑制ROS生成，我們敲低了BNIP3，發(fā)現(xiàn)BNIP3敲低后HIF-1α的表達沒有變化，而在HIF-1α抑制時BNIP3 表達降低，這些結果提示PCA可通過調(diào)控HIF-1α的水平，上調(diào)BNIP3的表達從而抑制ROS 的生成。有研究表明在缺血再灌注發(fā)生時，BNIP3可誘導自噬清除損傷的細胞器與蛋白質(zhì)，減輕損傷［32］，在缺氧或其他應激條件下，BNIP3通過調(diào)節(jié)Beclin1的活性，促進自噬過程，抗氧化應激損傷［33］。此外，在內(nèi)皮細胞OGD/R（6 h/2 h）中發(fā)現(xiàn)，PCA可以上調(diào)Beclin1 表達水平，抑制HIF-1α 和BNIP3 的表達后Beclin1的表達水平也受到抑制，由此我們認為PCA抑制ROS生成可能與自噬有關，PCA通過同時抑制ROS生成和調(diào)控自噬，提供了一種多層次的保護機制。這種雙重作用機制在傳統(tǒng)的抗氧化劑和自噬調(diào)節(jié)劑中并不常見，顯示了PCA在細胞保護方面的獨特性。PCA與自噬之間的相互關系不僅有助于理解細胞如何應對氧化應激和損傷，還為相關疾病的治療提供了新的研究方向和臨床應用潛力，在后續(xù)研究中我們會進一步探究。通過以上實驗，我們認為，PCA能減輕OGD/R損傷，進而改善微循環(huán)障礙，對減輕臨床上缺血再灌注損傷有指導意義。

綜上所述，本研究探究了PCA與氧化應激相關蛋白因子的關系，通過PCA處理及相關因子的抑制或激動處理揭示了PCA 具有抗氧化應激的作用，并發(fā)現(xiàn)PCA的潛在機制可能與提高HIF-1α表達水平，促進BNIP3、Beclin1 釋放從而抑制ROS 生成，減輕OGD/R損傷。

參考文獻：

[1] Campbell B C V， Desilva D A， Macleod M R， et al. Ischaemic stroke[J].Nat Rev Dis Primers， 2019， 5（1）：70.

[2] Tsivgoulis G， Katsanos AH， Sandset EC， et al. Thrombolysis for acute ischaemic stroke： current status and future perspectives[J].Lancet Neurol， 2023， 22（5）： 418-29.

[3] He JF， Liu DY， Zhao LX， et al. Myocardial ischemia/reperfusion injury： mechanisms of injury and implications for management（review）[J]. Exp Ther Med， 2022， 23（6）： 430.

[4] Babior BM， Kipnes RS， Curnutte JT. Biological defense mechanisms. The production by leukocytes of superoxide， a potential bactericidal agent[J]. J Clin Invest， 1973， 52（3）： 741-4.

[5] Hubert M， Stuart S， Ohh M. Glucose deprivation impairs hypoxiainducible factor-1α synthesis[J]. Discov Oncol， 2024， 15（1）： 595.

[6] Wang H， Song TY， Reyes-García J， et al. Hypoxia-induced mitochondrial ROS and function in pulmonary arterial endothelial cells[J]. Cells， 2024， 13（21）： 1807.

[7] Fleming AM， Burrows CJ. Why the ROS matters： One-electron oxidants focus DNA damage and repair on G-quadruplexes for gene regulation[J]. DNA Repair， 2025， 145： 103789.

[8] Ernster L， Schatz G. Mitochondria： a historical review[J]. J Cell Biol， 1981， 91（3 Pt 2）： 227s-55s.

[9] 李 益， 劉柯妤， 徐艷艷， 等. 轉錄因子FOXO3在心肌缺血再灌注損傷中的研究進展[J]. 中國分子心臟病學雜志， 2024， 24（3）： 6173-8.

[10] Mrá?ek T， Drahota Z， Hou?těk J. The function and the role of the mitochondrial glycerol-3-phosphate dehydrogenase in mammalian tissues[J]. Biochim Biophys Acta， 2013， 1827（3）： 401-10.

[11]李 曙， 張根葆， 洪 云， 等. 蝮蛇毒蛋白C激活物改善急性心肌梗死大鼠心功能的機制研究[J]. 中國臨床藥理學與治療學， 2012， 17（2）：141-6.

[12]李 曙， 陸曉華， 張根葆. 蝮蛇毒蛋白C激活物對大鼠在體心肌缺血再灌注損傷的干預作用[J]. 皖南醫(yī)學院學報， 2008， 27（3）： 167-9.

[13]張 陽， 陳 瑞， 劉 迪， 等. 蝮蛇毒蛋白C激活物對全腦缺血再灌注損傷大鼠血-腦屏障通透性的影響[J]. 中國臨床藥理學雜志， 2020， 36（16）： 2404-7.

[14]張 陽， 張根葆， 吳 娟. 蝮蛇毒蛋白C激活物對全腦缺血再灌注損傷大鼠血液粘度變化的影響[J]. 皖南醫(yī)學院學報， 2009， 28（6）：399-401.

[15]Zhu MX， Li XF， Guo J， et al. Orexin A protects against cerebral ischemia-reperfusion injury by enhancing reperfusion in ischemic cortex via HIF-1α-ET-1/ENOS pathway[J]. Brain Res Bull， 2024，218： 111105.

[16]Li ZH， Yin B， Xu YN， et al. Von Hippel-Lindau deficiency protects the liver against ischemia/reperfusion injury through the regulation of hypoxia-inducible factor 1α and 2α[J]. Hepatol Commun， 2024， 8（12）： e0567.

[17]Gao WH， Wang DY， Shi YM， et al. Potential cardiovascular disease treatment by natural drugs targeting the HIF-1α factor and its pathway[J]. Comb Chem High Throughput Screen， 2024.

[18]Shen GL， Wang H， Zhu N， et al. HIF-1/2α?activated RNF146 enhances the proliferation and glycolysis of hepatocellular carcinoma cells via the PTEN/AKT/mTOR pathway[J]. Front CellDev Biol， 2022， 10： 893888.

[19]Wurm CA， Jakobs S. Differential protein distributions define two sub-compartments of the mitochondrial inner membrane in yeast[J]. FEBS Lett， 2006， 580（24）： 5628-34.

[20]Toulmay A， Prinz WA. Lipid transfer and signaling at organelle contact sites： the tip of the iceberg[J]. Curr Opin Cell Biol， 2011， 23（4）： 458-63.

[21]Li S， Mo JC， Fang YX， et al. Macrophage migration inhibitory factor facilitates replication of Senecavirus A by enhancing the glycolysis via hypoxia inducible factor 1 alpha[J]. Int J Biol Macromol， 2024，281（Pt 1）： 136197.

[22]Huang YY， Yang Y， Chen XL， et al. Downregulation of malic enzyme 3 facilitates progression of gastric carcinoma via regulating intracellular oxidative stress and hypoxia-inducible factor-1α stabilization[J]. Cell Mol Life Sci， 2024， 81（1）： 375.

[23]Lu B， Li JH， Gui MT， et al. Salvianolic acid B inhibits myocardial I/ R-induced ROS generation and cell apoptosis by regulating the TRIM8/GPX1 pathway[J]. Pharm Biol， 2022， 60（1）： 1458-68.

[24]Ding CG， Ding XM， Zheng J， et al. miR-182-5p and miR-378a-3p regulate ferroptosis in I/R-induced renal injury[J]. Cell Death Dis，2020， 11（10）： 929.

[25]李 曙， 張根葆， 洪 云， 等. 蛇毒PCA改善冠脈微血栓大鼠血液流變學的機制研究[J]. 中國病理生理雜志， 2012， 28（4）： 595-600.

[26]Zhang L， Cao YY， Guo XX， et al. Hypoxia-induced ROS aggravate tumor progression through HIF-1α -SERPINE1 signaling in glioblastoma[J]. J Zhejiang Univ Sci B， 2023， 24（1）： 32-49.

[27]徐 丹， 陶 陶， 張繼榮， 等. HIF-1α對腦缺血再灌注損傷細胞凋亡及凋亡相關基因的研究進展[J]. 中國神經(jīng)免疫學和神經(jīng)病學雜志，2017， 24（3）： 219-22.

[28]Kobayashi Y， Oguro A， Imaoka S. Feedback of hypoxia-inducible factor-1alpha （HIF-1alpha） transcriptional activity via redox factor-1 （Ref-1） induction by reactive oxygen species （ROS）[J]. Free Radic Res， 2021， 55（2）： 154-64.

[29]Zhang C， Zhen LM， Fang ZP， et al. Adiponectin treatment attenuates cerebral ischemia-reperfusion injury through HIF-1 α -mediated antioxidation in mice[J]. Oxid Med Cell Longev， 2021， 2021：5531048.

[30]Yang N， Yang X， Fang Y， et al. Nitric oxide promotes cerebral ischemia/reperfusion injury through upregulating hypoxia-inducible factor1?α?associated inflammation and apoptosis in rats[J].Neurosci Lett， 2023， 795： 137034.

[31]Wang CC， Li Y， Qian XQ， et al. Empagliflozin alleviates myocardial I/R injury and cardiomyocyte apoptosis via inhibiting ER stressinduced autophagy and the PERK/ATF4/Beclin1 pathway[J]. J Drug Target， 2022， 30（8）： 858-72.

[32]Shao Z， Dou S， Zhu J， et al. The Role of Mitophagy in Ischemic Stroke[J]. Front Neurol， 2020， 11：608610.

[33]Li SH， Jiang JM， Fang JY， et al. Naringin protects H9C2 cardiomyocytes from chemical hypoxia-induced injury by promoting the autophagic flux via the activation of the HIF-1α/BNIP3 signaling pathway[J]. Int J Mol Med， 2021， 47（6）： 102.

（編輯：余詩詩）