摘要：目的 研究右美托咪定（DEX）對于熱打擊誘導(dǎo)人骨骼肌細胞（HSKMC）脹亡的保護作用及可能機制。方法 體外培養(yǎng)HSKMC，熱打擊組（HS組）將細胞置于43 ℃的水浴鍋中熱打擊4 h，構(gòu)建細胞脹亡模型，設(shè)置對照組、HS組、30 μmol/L DEX+HS組、ML385+30 μmol/L DEX+HS組、si-Nrf2+HS組、si-Nrf2+30 μmol/L DEX+HS組。通過CCK-8法檢測細胞活力，透射電子顯微鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)，Annexin V-FITC/PI免疫熒光流式細胞術(shù)檢測細胞脹亡和細胞凋亡，使用谷胱甘肽（GSH）和GSH-px試劑盒檢測細胞中GSH及GSH-px含量，TBA法檢測丙二醛（MDA），比色法檢測乳酸脫氫酶（LDH）、超氧歧化酶（SOD）、三磷酸腺苷（ATP）表達水平，ELISA法檢測腫瘤壞死因子（TNF）-α、白介素（IL）-6、IL-1β 水平，qRT-PCR及Western blotting 法檢測porimin、caspase-3、Nrf2、p-Nrf2、HO-1、NQO1等蛋白表達水平變化，熒光探針法檢測細胞內(nèi)活性氧（ROS），JC-1熒光染色法檢測線粒體膜電位損傷。結(jié)果 與對照組相比，HS組細胞和細胞器腫脹、胞質(zhì)內(nèi)空泡化明顯，符合脹亡表現(xiàn)，細胞活力下降，細胞雙陽性細胞率（Annexin-V+/PI+）、porimin 蛋白表達量增加（Plt;0.05），caspase-3 蛋白在各組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05），ROS、MDA、LDH、TNF-α、IL-6 和IL-1β 的含量增多（Plt;0.05），ATP、線粒體膜電位、GSH、GSH- px 和SOD水平降低（Plt;0.05）。與HS組相比，30 μmol/L DEX+HS組細胞損傷減輕，細胞活力升高，細胞雙陽性細胞率下降（Plt;0.05），ROS、MDA、LDH、TNF-α、IL-6和IL-1β的含量下降（Plt;0.05），ATP、線粒體膜電位、GSH、GSH- px和SOD含量升高（Plt;0.05），Nrf2、p-Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表達升高（Plt;0.05）。與30 μmol/L DEX+HS 組相比，經(jīng)ML385 或si-Nrf2 干預(yù)后，DEX對HSKMC細胞的保護作用減弱（Plt;0.05）。結(jié)論 熱打擊誘導(dǎo)人骨骼肌細胞發(fā)生脹亡，DEX抑制熱打擊誘導(dǎo)的脹亡，可能機制是激活Nrf2/HO-1 信號通路減輕HSKMC的氧化損傷以及抑制炎癥因子分泌。

關(guān)鍵詞：右美托咪定；橫紋肌溶解癥；脹亡；人骨骼肌細胞；Nrf2/HO-1 通路

創(chuàng)傷、遺傳或中毒等可導(dǎo)致肌肉細胞的急性損傷，即橫紋肌溶解癥，其病理生理學(xué)核心是由于細胞膜破壞和三磷酸腺苷（ATP）耗盡而致鈣離子流入細胞［1-4］。細胞脹亡作為一種關(guān)鍵的促炎性細胞死亡形式，參與了橫紋肌溶解癥的發(fā)生和發(fā)展，其機制可能與ATP耗竭、炎性損傷和氧化損傷有關(guān)［5， 6］。右美托咪定（DEX）作為臨床中廣泛應(yīng)用的麻醉藥物，是一種高選擇性α2腎上腺素能受體激動劑，具備抗氧化應(yīng)激損傷、抑制炎癥因子以及抗細胞凋亡等作用［7， 8］。既往研究表明，DEX是一種高選擇性的α2-腎上腺素能受體，通過減少炎癥和防止細胞死亡對多種器官具有保護作用［9， 10］。課題組前期動物實驗表明，DEX可減輕全身炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)，對橫紋肌溶解起保護作用，但未從細胞層面研究DEX對橫紋肌溶解保護作用的具體機制［11］。本研究基于熱打擊誘導(dǎo)人骨骼肌細胞（HSKMC）發(fā)生脹亡，在細胞水平探討DEX對熱打擊誘導(dǎo)HSKMC脹亡的作用，并闡明其作用機制是否與激活Nrf2/HO-1通路（氧化應(yīng)激反應(yīng)的主要機制［12， 13］）有關(guān)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器

HSKMC 株（武漢普諾賽公司）；DEX（默克）；porimin抗體、caspase-3抗體、Nrf2抗體（Bioss）；離心機（中國恒諾儀器，型號：AXTGL16M）；恒溫水浴鍋（北京三二八科學(xué)，型號：HH.S11-Ni2）；透射電鏡（FEI，型號：FEI Tecnai G2 Spirit 120 kV Bio-TWIN）；人IL-6ELISA試劑盒（江萊生物）；人TNF-α ELISA試劑盒（江萊生物）；人IL-1β ELISA試劑盒（江萊生物）；ATP試劑盒（南京建成）；GSH試劑盒（南京建成）；GSH-px試劑盒（南京建成）；MDA試劑盒（南京建成）；SOD測試盒（南京建成）；ROS試劑盒（碧云天）；JC-1試劑盒（碧云天）。

1.2 方法

1.2.1 細胞模型的建立及熱打擊后復(fù)溫時間篩選 將HSKMC培養(yǎng)在高糖型杜氏改良培養(yǎng)基（普諾賽）中，培養(yǎng)基中添加10% 胎牛血清和1% 雙抗（四秀青），在37 ℃、含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中孵育，當細胞培養(yǎng)達到70%時進行熱打擊處理。對照組細胞不進行處理，熱打擊組（HS組）將HSKMC置于43 ℃的水浴鍋中進行熱打擊4 h，構(gòu)建熱打擊細胞損傷模型，隨后將其移至細胞培養(yǎng)箱中分別復(fù)溫0、12、24、48 h，CCK-8法檢測復(fù)溫后0、12、24、48 h的細胞活力。細胞活力在60%左右考慮復(fù)溫時間合適，并決定后續(xù)實驗復(fù)溫時間。

1.2.2 篩選DEX用藥濃度 分別使用濃度梯度為1、2、4、8、16、32、64、128 μmol/L的DEX處理細胞24 h，通過CCK-8 法檢測細胞活力判斷DEX毒性，篩選DEX初始范圍濃度。在上述DEX篩選范圍內(nèi)，設(shè)置對照組（NC）、HS 組、1 μmol/L DEX+HS 組、30 μmol/L DEX+HS組、60 μmol/L DEX+HS組，結(jié)合DEX毒性及不同濃度DEX干預(yù)結(jié)果篩選DEX終濃度。

1.2.3 細胞分組 根據(jù)研究目的設(shè)置分組：對照組：正常培養(yǎng)，不進行熱打擊，之后進行相關(guān)檢測。HS 組：將細胞置于43 ℃的水浴鍋中熱打擊4 h，制備熱打擊細胞脹亡模型，然后按照篩選的復(fù)溫時間進行復(fù)溫，然后進行檢測。DEX干預(yù)組（30 μmol/L DEX+HS）：終濃度DEX 預(yù)處理細胞24 h 后，按照HS 組步驟進行造模、復(fù)溫處理。Nrf2 抑制組（ML385+30 μmol/L DEX+HS）：加入10 μmol/L ML385（Nrf2 抑制劑， selleck）處理12 h，再加入終濃度DEX預(yù)處理細胞24 h，再按照HS組步驟進行造模、復(fù)溫。Nrf2敲低組1（si-Nrf2+HS）：加入si-Nrf2（博邁德）轉(zhuǎn)染24 h，本組無DEX干預(yù)，直接按照HS組步驟進行造模、復(fù)溫。Nrf2 敲低組2（si-Nrf2+30 μmol/L DEX+HS）：加入si-Nrf2轉(zhuǎn)染24 h，再加入終濃度DEX預(yù)處理細胞24 h，再按照HS 組步驟進行造模、復(fù)溫。

1.2.4 CCK-8 法檢測細胞活力 細胞正常培養(yǎng)至70%，取1個96孔板，每組加入調(diào)整好的細胞懸液100 μL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，貼壁后進行后續(xù)實驗；向各孔中加入10 μL CCK8 溶液，用酶標儀測定吸光度A450 nm，吸光度值低表示細胞代謝活躍度下降。

1.2.5 透射電子顯微鏡檢測細胞脹亡 將收集后的細胞進行水洗、脫水、包埋等操作后，放恒溫烘箱內(nèi)聚合，超薄切片機切片及染色，最后在透射電鏡觀察、拍片。細胞脹亡鏡下表現(xiàn)為細胞和細胞器腫脹、胞質(zhì)內(nèi)空泡化明顯，核周間隙增寬，細胞核凝聚、固縮，部分包膜連續(xù)性中斷。［14］

1.2.6 Annexin V-FITC/PI 雙染色法檢測細胞脹亡和細胞凋亡 采集細胞后，懸浮細胞離心（2000 r/min 離心5 min）收集，用預(yù)冷PBS（4 ℃）洗滌細胞2次（2000 r/min離心5 min）收集細胞；加入500 μL的Binding Buffer懸浮細胞，加入5 μL Annexin V-FITC混勻染色，避光，室溫孵育15 min；然后加入5 μL碘化丙啶，混勻，室溫孵育15 min（上機前5 min再加入5 μL的碘化丙啶染色），進行流式細胞儀的觀察和檢測（激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm）。本染色法可用于檢測凋亡及脹亡，早期凋亡細胞僅與Annexin-V結(jié)合，呈綠色熒光（Annexin-V+/PI-），而脹亡細胞則同時與Annexin-V和碘化丙啶結(jié)合，呈現(xiàn)綠色和紅色雙熒光信號（Annexin-V+/PI+）［15， 16］。

1.2.7 Western blotting檢測脹亡、凋亡相關(guān)蛋白及Nrf2通路蛋白表達 收集細胞后進行轉(zhuǎn)膜，小心取出轉(zhuǎn)移膜置于封閉液中封閉1 h，將封閉后的膜分別加入對應(yīng)的一抗（Porimin，1∶1000；caspase-3，1∶1000；Nrf2，1∶1000；p-Nrf2，1∶1000；HO-1，1∶1000；NQO1，1∶1000），4 ℃反應(yīng)過夜，用1×TBST洗滌3次，將二抗用1×TBST稀釋300倍，將洗滌后的一抗反應(yīng)膜放入二抗工作液中作用60 min，用1×TBST洗膜，將其放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像，以β-actin為內(nèi)參，計算脹亡蛋白porimin、凋亡蛋白caspase-3、Nrf2 通路相關(guān)蛋白（Nrf2、p-Nrf2、HO-1、NQO1）表達水平。

1.2.8 檢測細胞中抗氧化指標及ATP 取對數(shù)生長期細胞接種于6孔板中。棄去培養(yǎng)基，熒光探針法檢測細胞內(nèi)活性氧（ROS）；比色法檢測乳酸脫氫酶（LDH）、ATP、超氧歧化酶（SOD）；硫代巴比妥酸（TBA）法檢測丙二醛（MDA）；嚴格按照試劑盒說明書檢測細胞中ROS、谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-px）、SOD、MDA、LDH活性。

ROS檢測：每個玻片滴加4%的多聚甲醛冰上固定15 min，冷PBS 洗滌2 次；滴加封閉液（5%正常山羊血清），在濕盒中37 ℃孵育60 min，滴加DCFH-DA（1∶500稀釋）置濕盒中37 ℃孵育60 min，再用PBS洗滌5次；滴加DAPI后熒光顯微鏡下觀察拍照，檢測熒光信號，熒光強度與ROS水平成正比［17］。

1.2.9 檢測細胞中炎癥因子 按照實驗分組進行處理，藥物處理后，收集各組細胞培養(yǎng)上清液，分裝，采用ELISA法檢測炎癥因子腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素-6（IL-6）和白介素-1β（IL-1β），按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.10 JC-1 檢測線粒體膜電位 加入1 mL JC-1 染色工作液，充分混勻。細胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育20 min。吸除上清，用JC-1 染色緩沖液洗滌2 次。在激發(fā)波長525 nm、發(fā)射波長590 nm處檢測JC-1聚合物，用熒光顯微鏡觀察。紅色熒光表示JC-1 聚集體，綠色熒光表示JC-1單體，藍色熒光表示細胞核定位。JC-1聚集體與單體的熒光強度比值降低，表示線粒體膜電位降低［18］。

1.2.11 實時熒光定量PCR法檢測脹亡、凋亡相關(guān)蛋白及Nrf2 通路的mRNA 表達 將細胞加入1 mL Trizol（invitrogen），在勻漿儀上勻漿1 min，吸取到1.5 mL EP管中，加入500 μL酚氯仿，4 ℃離心10 min，吸取上層上清于一個新的離心管中，加入700 μL異丙醇，混勻，于4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，去上清，用75%乙醇洗滌1次，溶于50 μL DEPC處理水中，電泳檢測。RNA濃度計算公式為：A260×40 ng/μL。按照說明書使用invitrogen 的superscript III 進行逆轉(zhuǎn)錄。引物序列［博邁德生物科技（固安）有限公司，表1］。Nrf2 通路mRNA表達水平升高，可上調(diào)下游相關(guān)抗氧化酶表達，使氧化產(chǎn)物含量下降，減輕氧化損傷［13］。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 9.5.1 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)溫時間點的篩選

與對照組相比，HS 組復(fù)溫0 h 細胞活力下降（Plt;0.05），隨復(fù)溫時間的延長逐漸加重，復(fù)溫至48 h，細胞活力下降（Plt;0.05，圖1）。選擇復(fù)溫24 h用于后續(xù)實驗。

2.2 DEX用藥濃度的篩選

DEX濃度在1～16 μmol/L范圍內(nèi)對于細胞活力影響較小，DEX濃度為128 μmol/L時，細胞活力下降超過50%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05，圖2A）。對照組與HS組間細胞活力的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05），HS組與1 μmol/L DEX+HS組間細胞活力的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05），但與30 μmol/L DEX+HS 組、60 μmol/LDEX+HS組間細胞活力的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05），30 μmol/L DEX+HS組與60 μmol/L DEX+HS組間細胞活力的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05，圖2B）。DEX終濃度選取30 μmol/L并應(yīng)用于后續(xù)實驗。

2.3 各組細胞活力檢測

與對照組相比，HS細胞活性低于對照組（Plt;0.05）；與HS 組比較，30 μmol/L DEX+HS 組細胞活力升高（Plt;0.05），si-Nrf2+HS 組細胞活力下降（Plt;0.05）；與30 μmol/L DEX+HS 組相比，ML385+30 μmol/LDEX+HS 組及si-Nrf2+30 μmol/L DEX+HS 組細胞活力下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05，圖3）。

2.4 透射電子顯微鏡觀察細胞脹亡

電鏡下觀察，對照組細胞表現(xiàn)為核大濃染，染色質(zhì)濃密，線粒體結(jié)構(gòu)完整；HS組細胞體積增大，胞質(zhì)內(nèi)空泡化，線粒體腫脹，出現(xiàn)脫顆?，F(xiàn)象，細胞核周圍間隙明顯增寬，部分細胞膜出現(xiàn)中斷。與HS組相比，經(jīng)30 μmol/LDEX預(yù)處理后，細胞腫脹程度較前減輕，細胞體積縮小，胞質(zhì)空泡化現(xiàn)象明顯減弱，線粒體腫脹減輕。與30 μmol/L DEX+HS組相比，si-Nrf2+30 μmol/L DEX+HS 組和ML385+30 μmol/L DEX+HS 組無明顯變化（圖4）。

2.5 Annexin V-FITC/PI免疫熒光流式細胞術(shù)檢測細胞脹亡

與對照組相比，HS 組細胞雙陽性細胞率增加（Plt;0.05）；與HS組比較，30 μmol/L DEX+HS組雙陽性細胞率下降（Plt;0.05），si-Nrf2+HS 組雙陽性細胞率升高（Plt;0.05）；與30 μmol/L DEX+HS 組相比，ML385+30 μmol/L DEX+HS組和si-Nrf2+30 μmol/L DEX+HS組雙陽性細胞率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05，圖5）。

2.6 各組HSKMC中脹亡、凋亡相關(guān)蛋白及Nrf2信號通路蛋白表達

Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，HS組脹亡蛋白porimin相對表達量升高（Plt;0.05），Nrf2信號通路蛋白（Nrf2、p-Nrf2、HO-1 和NQO1）表達量下降（Plt;0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與HS組相比，30 μmol/LDEX+HS 組porimin 蛋白相對表達量降低（Plt;0.05），Nrf2信號通路蛋白表達量升高（Plt;0.05）。與30 μmol/LDEX+HS組相比，ML385+30 μmol/L DEX+HS組和si-Nrf2+30 μmol/L DEX+HS 組porimin 蛋白相對表達量升高（Plt;0.05），Nrf2、p-Nrf2、HO-1 和NQO1 蛋白表達量下降（Plt;0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。凋亡蛋白caspase-3在各組中的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05，圖6）。

2.7 各組HSKMC中抗氧化指標、炎癥指標和ATP的檢測結(jié)果

對照組MDA、LDH、TNF-α、IL-6和IL-1β的含量低于HS組（Plt;0.05），GSH、GSH-px、SOD和ATP的含量高于HS 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）；HS 組MDA、LDH、TNF-α、IL-6和IL-1β的含量高于30 μmol/L DEX+HS 組（Plt;0.05），GSH、GSH- px、SOD和ATP 含量低于30 μmol/L DEX+HS 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）；與30 μmol/L DEX+HS 組相比，ML385+30 μmol/LDEX+HS 組及si-Nrf2+30 μmol/L DEX+HS 組MDA、LDH、TNF-α、IL-6和IL-1β的含量增多（Plt;0.05），GSH、GSH- px、SOD和ATP含量減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05，圖7）。

2.8 各組HSKMC中ROS檢測

熒光顯微鏡下觀察ROS表達水平，與對照組相比，HS 組細胞內(nèi)ROS 含量升高（Plt;0.05）；與HS 組相比，30 μmol/L DEX+HS 組細胞內(nèi)的ROS 表達降低（Plt;0.05），si-Nrf2+HS組細胞內(nèi)的ROS表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05，圖8）。

2.9 各組HSKMC線粒體膜電位檢測

對照組紅色熒光JC-1聚集體高于HS組，對照組綠色熒光JC-1單體低于HS組，對照組JC-1聚集體與單體的熒光強度比值高于HS組，線粒體膜電位升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）。HS組與30 μmol/L DEX+HS組間JC-1聚集體與單體的熒光強度比值的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05，圖9）。

3 討論

重癥中暑是一種高發(fā)病率和高致死率的疾病，且合并多器官功能障礙綜合征時病死率高達40%，橫紋肌溶解癥是重癥中暑常見的并發(fā)癥，其全身影響范圍從血流肌酶的無癥狀升高到危及生命的急性腎臟損傷和電解質(zhì)異常［19，20］，重癥中暑橫紋肌溶解的具體發(fā)生發(fā)展機制尚不清楚。線粒體內(nèi)產(chǎn)生的ROS及其衍生物可導(dǎo)致膜蛋白的氧化損傷，抑制呼吸鏈的電子傳遞，減少ATP的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致細胞脹亡和凋亡［21，22］。脹亡作為一種關(guān)鍵的促炎性細胞死亡形式，主要依賴非caspase途徑，這一機制不僅與橫紋肌溶解癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，還與急性冠脈綜合征、再灌注損傷及腫瘤等密切相關(guān)［4，5，18，23］。尋找合適的藥物降低氧化應(yīng)激水平，對減輕橫紋肌溶解癥患者氧化應(yīng)激損傷具有潛在價值。

細胞凋亡和細胞脹亡主要根據(jù)細胞體積和核形態(tài)進行鑒別，透射電子顯微鏡被認同為檢測細胞死亡方式的金指標。細胞脹亡主要表現(xiàn)為細胞和細胞器腫脹、胞質(zhì)內(nèi)空泡化明顯、膜通透性增加等［24］。porimin 也被稱為促脹亡受體，是介導(dǎo)細胞脹亡的特異性蛋白，porimin蛋白和配體一旦結(jié)合，會快速破快細胞膜的完整性，介導(dǎo)細胞膜形成孔道，增加細胞膜通透性，造成細胞腫脹死亡［23］。caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，是細胞凋亡的執(zhí)行者［25，26］。采用Annexin-V與PI進行細胞雙染實驗，可用于檢測凋亡及脹亡，綠色和紅色雙熒光信號（Annexin-V+/PI+）考慮脹亡［15，16］。本研究結(jié)果顯示，熱打擊后HSKMC電鏡下表現(xiàn)符合脹亡特征，脹亡蛋白porimin 及雙陽性細胞率（Annexin-V+/PI+）升高，而caspase-3蛋白差異無統(tǒng)計學(xué)意義，熱打擊誘導(dǎo)HSKMC發(fā)生脹亡而非凋亡。本研究結(jié)果與既往研究［27］結(jié)果一致，不同點在于本研究改良了造模條件，與在細胞培養(yǎng)箱中進行熱打擊相比，采用水浴鍋進行熱打擊可使溫度控制更精確，細胞受熱更均勻。此外，細胞凋亡是一種主動耗能的程序性死亡，而細胞脹亡是一種被動的低耗能或不耗能的過程，在脹亡發(fā)生的過程中，線粒體功能發(fā)生障礙，ATP 生成減少［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，熱打擊后線粒體膜電位及ATP水平明顯降低，符合脹亡特點。

線粒體中生成的ROS及其衍生物等可通過對膜蛋白造成氧化損傷，誘導(dǎo)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔產(chǎn)生，抑制呼吸鏈的電子傳遞，減少ATP生成，參與脹亡的發(fā)生。SOD、GSH是機體重要的抗氧化酶，MDA是脂質(zhì)過氧化物的裂解產(chǎn)物，其表達水平與氧自由基的生成呈正相關(guān)，氧化損傷后細胞膜的完整性可以通過LDH滲漏量反映出來。因此，SOD、GSH、MDA及LDH均為評價氧化應(yīng)激的重要指標［28-31］。本研究發(fā)現(xiàn)，HS組細胞活力下降，ROS、TNF-α、IL-6和IL-1β的含量增多，線粒體膜電位降低及ATP水平下降，提示熱打擊誘導(dǎo)HSKMC脹亡可導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)及ATP耗竭，這與既往一項體外研究［18］結(jié)果相符。此外，本研究還測定了評估氧化應(yīng)激的其他指標（GSH、GSH-px、LDH、SOD 和MDA），結(jié)果發(fā)現(xiàn)HS 組GSH、GSH-px 和SOD水平降低，MDA、LDH水平升高，這提示熱打擊誘導(dǎo)HSKMC發(fā)生脹亡后，細胞內(nèi)GSH、GSH- px、SOD等抗氧化酶活性下降以及ATP耗竭，細胞抗氧化能力降低，致使氧化與代謝功能障礙，ROS、LDH和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA大量累積，進一步驗證了氧化應(yīng)激參與了熱打擊誘導(dǎo)HSKMC脹亡的發(fā)生。

DEX是一種高選擇性α2腎上腺素能受體激動劑，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮、抑制交感神經(jīng)系統(tǒng)活動等作用，作用機制可能涉及AC-cAMP-PKA 通路、TLR4/NF-κB 途徑JAK2-STAT3 途徑和NF-κB/COX-2 途徑等［8，32-34］。本團隊前期動物實驗顯示，DEX 可以降低ROS的生成，通過抑制NLRP3炎癥小體活化減輕勞力性熱射病大鼠橫紋肌溶解癥［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，與HS組相比，DEX 預(yù)處理后可明顯增加細胞活力及存活率，減輕電鏡下細胞及細胞器損傷，降低脹亡特異性蛋白porimin 表達，說明DEX 能減輕熱打擊誘導(dǎo)HSKMC脹亡損傷。DEX降低了ROS、TNF-α、IL-6 和IL-1β的含量，這與課題組前期動物研究結(jié)果一致［11］；此外，本研究發(fā)現(xiàn)DEX提高了GSH、GSH-px、SOD活性以及線粒體膜電位、ATP水平，降低了脂質(zhì)過氧化物MDA及LDH含量，說明DEX通過增強細胞的抗氧化能力減輕ROS氧化應(yīng)激損傷、改善線粒體功能障礙并抑制炎癥反應(yīng)。

Nrf2-Keap1信號通路被認為是細胞內(nèi)最重要的抗氧化應(yīng)激機制之一。當細胞受毒物刺激時，Nrf2 從Keap1中解偶聯(lián)進入細胞核內(nèi)，通過調(diào)控下游抗氧化分子如HO-1、NQO1 等的表達，從而抵抗氧化應(yīng)激損傷［13，35］。研究表明，蘿卜硫素通過激活Nrf2/ARE通路減少凋亡和脹亡減輕肝缺血再灌注損傷［22］；亦有研究表明氧化應(yīng)激反應(yīng)參與了熱打擊骨骼肌細胞脹亡［18］。因此，我們推測DEX可以通過調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1 信號通路抑制熱打擊誘導(dǎo)的HSKMC發(fā)生脹亡。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，熱打擊組Nrf2/HO-1通路相關(guān)蛋白（Nrf2、p-Nrf2、HO-1、NQO1）表達下降，DEX可以逆轉(zhuǎn)這些改變，表明DEX可以通過調(diào)控Nrf2/HO-1 通路而抑制熱打擊誘導(dǎo)的HSKMC發(fā)生脹亡。為了進一步探究Nrf2/HO-1 通路是否參與了DEX對HSKMC脹亡的保護作用，本研究選擇Nrf2 抑制劑ML385 以及siNrf2 敲低Nrf2 的表達來進一步驗證。本研究發(fā)現(xiàn)，ML385 或siNrf2 均可抑制Nrf2/HO-1 通路的激活，提高GSH、SOD活性，降低脂質(zhì)過氧化物MDA含量，并且這兩組間Nrf2 通路相關(guān)蛋白的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，進一步證明DEX通過激活Nrf2/HO-1 信號通路，促進Nrf2 的轉(zhuǎn)錄和表達，減輕氧化應(yīng)激損傷，為DEX的臨床轉(zhuǎn)化提供理論研究基礎(chǔ)。

綜上所述，熱打擊誘導(dǎo)HSKMC發(fā)生脹亡，結(jié)合本文細胞實驗及相關(guān)指標檢測，發(fā)現(xiàn)DEX預(yù)處理對熱打擊誘導(dǎo)HSKMC脹亡具有保護作用，其機制可能作用于Nrf2/HO-1 信號通路實現(xiàn)。但本研究僅局限于細胞水平，后續(xù)還需以動物模型深入研究DEX調(diào)控Nrf2/HO-1信號通路抑制脹亡的具體機制。

參考文獻：

[1] Torres PA， Helmstetter JA， Kaye AM， et al. Rhabdomyolysis：pathogenesis， diagnosis， and treatment[J]. Ochsner J， 2015， 15（1）：58-69.

[2] Zutt R， van der Kooi AJ， Linthorst GE， et al. Rhabdomyolysis：review of the literature[J]. Neuromuscul Disord， 2014， 24（8）： 651-9.

[3] Cabral BMI， Edding SN， Portocarrero JP， et al. Rhabdomyolysis[J].Dis Mon， 2020， 66（8）： 101015.

[4] Peters AA， Jamaludin SN， Yapa KS， et al. Oncosis and apoptosis induction by activation of an overexpressed ion channel in breast cancer cells[J]. Oncogene， 2017， 36（46）： 6490-500.

[5] Zheng JY， Tan HL， Matsudaira PT， et al. Excess reactive oxygen species production mediates monoclonal antibody-induced human embryonic stem cell death via oncosis[J]. Cell Death Differ， 2017，24（3）： 546-58.

[6] Sun YX， Yu J， Liu XR， et al. Oncosis-like cell death is induced by berberine through ERK1/2-mediated impairment of mitochondrial aerobic respiration in gliomas[J]. Biomed Pharmacother， 2018， 102：699-710.

[7] Liu XM， Chen QH， Hu Q， et al. Dexmedetomidine protects intestinal ischemia-reperfusion injury via inhibiting p38 MAPK cascades[J].Exp Mol Pathol， 2020， 115： 104444.

[8] Weerink MAS， Struys MMRF， Hannivoort LN， et al. Clinical pharmacokinetics and pharmacodynamics of dexmedetomidine[J].Clin Pharmacokinet， 2017， 56（8）： 893-913.

[9] Tian L， Liu Q， Wang X， et al. Fighting ferroptosis： Protective effects of dexmedetomidine on vital organ injuries[J]. Life Sci， 2024， 354：122949.

[10]Bao NR， Tang B. Organ-protective effects and the underlying mechanism of dexmedetomidine[J]. Mediators Inflamm， 2020，2020： 6136105.

[11]李程程， 劉 洋， 毛漢丁， 等. 右美托咪定通過腎上腺素能α2受體調(diào)控NLRP3/IL-1β通路緩解勞力性熱射病相關(guān)性橫紋肌溶解[J/OL].解放軍醫(yī)學(xué)雜志， 2024： 1-14.

[12]Qi YJ， Fu S， Pei DG， et al. Luteolin attenuated cisplatin-induced cardiac dysfunction and oxidative stress via modulation of Keap1/Nrf2 signaling pathway[J]. Free Radic Res， 2022， 56（2）： 209-21.

[13]Ulasov AV， Rosenkranz AA， Georgiev GP， et al. Nrf2/Keap1/ARE signaling： towards specific regulation[J]. Life Sci， 2022， 291：120111.

[14]D’Arcy MS. Cell death： a review of the major forms of apoptosis，necrosis and autophagy[J]. Cell Biol Int， 2019， 43（6）： 582-92.

[15]Lecoeur H， Prévost MC， Gougeon ML. Oncosis is associated with exposure of phosphatidylserine residues on the outside layer of the plasma membrane： a reconsideration of the specificity of the annexin V/propidium iodide assay[J]. Cytometry， 2001， 44（1）： 65-72.

[16]Zhou X， Sun WJ， Wang WM， et al. Artesunate inhibits the growth of gastric cancer cells through the mechanism of promoting oncosis both in vitro and in vivo[J]. Anticancer Drugs， 2013， 24（9）： 920-7.

[17]Duanghathaipornsuk S， Farrell EJ， Alba-Rubio AC， et al. Detection technologies for reactive oxygen species： fluorescence and electrochemical methods and their applications[J]. Biosensors，2021， 11（2）： 30.

[18]豆春麗. ROS介導(dǎo)線粒體功能障礙在熱應(yīng)激骨骼肌細胞脹亡中機制研究[D]. 廣州： 廣州中醫(yī)藥大學(xué)， 2020.

[19]Peiris AN， Jaroudi S， Noor R. Heat stroke[J]. JAMA， 2017， 318（24）： 2503.

[20]Kodadek L， Carmichael Ii SP， Seshadri A， et al. Rhabdomyolysis： an American association for the surgery of trauma critical care committee clinical consensus document[J]. Trauma Surg Acute Care Open， 2022， 7（1）： e000836.

[21]Yue RC， Hu HX， Yiu KH， et al. Lycopene protects against hypoxia/reoxygenation-induced apoptosis by preventing mitochondrial dysfunction in primary neonatal mouse cardiomyocytes[J]. PLoS One， 2012， 7（11）： e50778.

[22]Chi XJ， Zhang R， Shen N， et al. Sulforaphane reduces apoptosis and oncosis along with protecting liver injury-induced ischemic reperfusion by activating the Nrf2/ARE pathway[J]. Hepatol Int，2015， 9（2）： 321-9.

[23]Weerasinghe P， Maximilian Buja L. Oncosis： an important nonapoptotic mode of cell death[J]. Exp Mol Pathol， 2012， 93（3）： 302-8.

[24]Trump BF， Berezesky IK， Chang SH， et al. The pathways of cell death： oncosis， apoptosis， and necrosis[J]. Toxicol Pathol， 1997， 25（1）： 82-8.

[25]Wang YP， Gao WQ， Shi XY， et al. Chemotherapy drugs induce pyroptosis through caspase-3 cleavage of a gasdermin[J]. Nature，2017， 547（7661）： 99-103.

[26]Ge Y， Cai YM， Bonneau L， et al. Inhibition of cathepsin B by caspase-3 inhibitors blocks programmed cell death in Arabidopsis[J]. Cell Death Differ， 2016， 23（9）： 1493-501.

[27]豆春麗， 袁芳芳， 劉 斌， 等. 熱打擊誘導(dǎo)骨骼肌細胞脹亡而非凋亡[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志， 2020， 45（10）： 1047-51.

[28]Wu C， Chen RL， Wang Y， et al. Acacetin alleviates myocardial ischaemia/reperfusion injury by inhibiting oxidative stress and apoptosis via the Nrf-2/HO-1 pathway[J]. Pharm Biol， 2022， 60（1）：553-61.

[29]Park WH. Antiapoptotic effects of caspase inhibitors on H2O2-treated lung cancer cells concerning oxidative stress and GSH[J].Mol Cell Biochem， 2018， 441（1/2）： 125-34.

[30]Zhang Q， Dong XW， Xia JY， et al. Obestatin plays beneficial role in cardiomyocyte injury induced by ischemia-reperfusion in vivo and in vitro[J]. Med Sci Monit， 2017， 23： 2127-36.

[31]Yilmaz Y， Tumkaya L. Effects of hyperbaric oxygen and iloprost on intestinal ischemia-reperfusion induced acute lung injury[J]. Ann Surg Treat Res， 2019， 96（1）： 34-40.

[32]Yang L， Xing GL， Wang L， et al. Acute kidney injury in China： a cross-sectional survey[J]. Lancet， 2015， 386（10002）： 1465-71.

[33]Lankadeva YR， Ma S， Iguchi N， et al. Dexmedetomidine reduces norepinephrine requirements and preserves renal oxygenation and function in ovine septic acute kidney injury[J]. Kidney Int， 2019， 96（5）： 1150-61.

[34]Yao H， Chi XJ， Jin Y， et al. Dexmedetomidine inhibits TLR4/NF-κB activation and reduces acute kidney injury after orthotopic autologous liver transplantation in rats[J]. Sci Rep， 2015， 5： 16849.

[35]Kopacz A， Kloska D， Forman HJ， et al. Beyond repression of Nrf2：an update on Keap1[J]. Free Radic Biol Med， 2020， 157： 63-74.

（編輯：郎 朗）