摘要：目的 探索Circ-MYOCD的反向剪接機制及該分子的反向剪接是如何調(diào)控心肌肥厚的發(fā)生的。方法 Sanger 測序和RNase R實驗驗證Circ-MYOCD的呈環(huán)性和穩(wěn)定性，核質分提確定Circ-MYOCD的分布情況。生物信息學分析及pull-down的質譜結果分析預測與Circ-MYOCD結合的RNA結合蛋白（RBPs）。敲低心肌細胞中HNRNPH1 和HNRNPL篩選可能影響到Circ-MYOCD反向剪接的RBPs，過表達HNRNPH1確定影響Circ-MYOCD反向剪接的RBPs。血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導建立大鼠心肌肥大模型，檢測HNRNPH1在肥大心肌細胞中的表達情況。敲低和過表達心肌細胞中HNRNPH1檢測其對心肌肥厚進程的影響。在大鼠心肌肥大細胞模型中敲低HNRNPH1的表達，檢測HNRNPH1對 Circ-MYOCD反向剪接的影響及對心肌肥厚進程的影響。結果 Sanger測序結果顯示，接頭引物可以擴增出正確的Circ-MYOCD的序列；RNase R實驗和核質分提實驗結果顯示Circ-MYOCD具有穩(wěn)定性且主要分布在細胞質中（Plt;0.001）。生物信息學分析及Circ-MYOCD的pull-down 的質譜結果分析顯示HNRNPH1 和HNRNPL 是與Circ-MYOCD 結合的RBPs。敲低和過表達心肌細胞中RBPs，檢測Circ-MYOCD與MYOCD的表達情況，結果顯示HNRNPH1 影響且抑制Circ-MYOCD的反向剪接（Plt;0.01，Plt;0.05）。AngⅡ誘導建立小鼠心肌肥大模型中，檢測到HNRNPH1的表達升高（Plt;0.001）。過表達HNRNPH1可以增加心肌肥厚標志物分子ANP、BNP 的表達（Plt;0.05），敲低的結果與之相反（Plt;0.05，Plt;0.001）。在肥大的心肌細胞中敲低HNRNPH1 后，Circ-MYOCD表達升高（Plt;0.001），MYOCD的表達降低（Plt;0.01）；檢測心肌肥大相關分子ANP、BNP的表達均降低（Plt;0.05，Plt;0.001）。討論Circ-MYOCD的反向剪接受剪接因子HNRNPH1的調(diào)控進而影響了心肌肥厚的進程。

關鍵詞：心肌肥厚；反向剪接；環(huán)狀RNA；剪接因子；HNRNPH1

心肌肥厚是心肌細胞通過增大細胞體積來增強心肌收縮力、減輕心室壁壓力的一種代償性和適應性反應，但長期的心肌肥厚可能導致心臟收縮和舒張功能受損，最終引發(fā)心力衰竭 ［1］［2］。心肌肥厚分為生理性肥厚和病理性肥厚，前者通過心臟的形態(tài)和功能適應維持泵血功能，后者則因心肌細胞受損及心臟缺血、缺氧而重構，伴隨心力衰竭、心律失常甚至死亡［3］。研究表明，心肌肥厚貫穿于心力衰竭的全過程［4］，因此，對心肌肥厚的干預對于心衰的治療具有重要意義。

環(huán)狀RNA（CircRNA）的形成始于前體mRNA（premRNA）的反向剪接，通過特定的剪接機制將一個外顯子的3'端與另一個外顯子的5'端連接，形成閉合的環(huán)狀結構［5， 6］。研究發(fā)現(xiàn)，心肌肥厚發(fā)生時，CircRNA的表達譜顯著上調(diào)或下調(diào)，提示其在心肌肥厚的發(fā)生和發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用［7］。具體來說，CircRNA通過其獨特的“海綿”效應，即吸附并隔離miRNA，影響下游靶基因的表達，從而參與心肌肥厚的調(diào)控［8］。特定CircRNA的過表達或沉默能夠直接影響心肌細胞的增殖和凋亡，進而影響心肌肥厚的發(fā)生［9］。此外，CircRNA的穩(wěn)定性和特異性為其在心血管疾病的靶向療法中提供了潛在的應用前景［10］。目前對于CircRNA的研究仍處于起步階段，許多具體機制尚不清楚，因此深入探討CircRNA在心肌肥厚中的作用機制對于理解其發(fā)病機制和尋找新療法具有重要意義。

前期研究已篩選，由MYOCD的pre-mRNA反向剪接形成，在心肌中特異性表達且有差異性表達的Circ-MYOCD，并初步確定其具有抑制心肌肥厚的功能［11］。但目前尚未有關調(diào)控Circ-MYOCD反向剪接表達的報道。在反向剪接過程中，剪接因子SRSFs（富含絲氨酸/精氨酸的剪接因子）與HNRNPHs（異質核核糖核蛋白）家族成員發(fā)揮關鍵調(diào)控作用［12， 13］。它們可以特異性地識別并結合RNA中剪接信號的RNA結合蛋白（RBPs），這些蛋白家族在mRNA剪接中相輔相成［14］，促進反向剪接的發(fā)生［15］。本研究通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)HNRNPHs 和SRSFs 蛋白存在可能調(diào)控Circ-MYOCD反向剪接的RBPs。因此，本研究將深入探討在心肌肥厚模型中SRSFs蛋白家族和HNRNPs蛋白家族對Circ-MYOCD反向剪接的影響，以及這一調(diào)控關系是否可以調(diào)控心肌細胞肥大的進程，以期為心血管疾病的臨床治療提供一個新的策略。

1 材料和方法

1.1 細胞、試劑和器械

H9C2大鼠心肌細胞來自于上海生命科學研究院。PBS、DMEM、50×TAE、瓊脂糖粉（武漢賽維爾生物科技有限公司）；胎牛血清（賽默飛）；膠回收試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；Hieff TransTM脂質體核酸轉染試劑，脂質體核酸轉染試劑，2×Hieff PCR Master Mix（翌圣生物科技股份有限公司）；PVDF膜（默克）；本研究中使用的抗體包括GAPDH、HNRNPH1、HNRNPL（ABclonal）、山羊抗兔IgG-HRP（Abways），化學發(fā)光系統(tǒng)（新賽美生物科技）；siRNA由上海吉瑪制藥技術有限公司合成；所有引物均由金維智有限公司合成。pAd-Track-cmv-GFP質粒為本實驗室前期構建。PCR儀、瓊脂糖凝膠電泳儀（翌圣生物科技股份有限公司）；離心機（海爾生物科技有限公司）、細胞培養(yǎng)箱、無菌超凈工作臺（ThermoFisher）；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 H9C2 細胞培養(yǎng)及AngⅡ誘導的心肌肥大模型建立 將H9C2細胞使用10%牛血清的DMEM培養(yǎng)，并置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，待細胞密度達到80%，用0.25%胰蛋白酶消化后再傳代。將細胞接種與6 孔板后，加入AngⅡ后使最終濃度為10-7 mol/L，刺激24 h使心肌細胞肥大。

1.2.2 實驗分組及處理 AngⅡ組：在AngⅡ的濃度為10-7 mol/L的DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h的H9C2細胞；control組：正常培養(yǎng)24 h的H9C2細胞。NC組：轉染si-NC 陰性對照的H9C2 細胞培養(yǎng)24 h；si-HNRNPH1組：轉染si-HNRNPH1 的H9C2 細胞培養(yǎng)24 h；si-HNRNPL組：轉染si-HNRNPL的H9C2細胞培養(yǎng)24 h。GFP組：感染1 OD的Ad-GAP腺病毒培養(yǎng)24 h的H9C2細胞；Ad-HNRNPH1 組：感染1 OD 的Ad-HNRNPH1腺病毒培養(yǎng)24 h的H9C2細胞；si-HNRNPL組：轉染si-HNRNPL 的H9C2 細胞。AngⅡ+si-HNRNPH1：在心肌肥厚模型基礎上轉染si-HNRNPH1 后培養(yǎng)24 h；AngⅡ+NC：在心肌肥厚模型基礎上轉染si-NC后培養(yǎng)24 h；AngⅡ+Ad-HNRNPH1：在心肌肥厚模型基礎上感染Ad-HNRNPH1 后培養(yǎng)24 h；AngⅡ+GFP：在心肌肥厚模型基礎上感染Ad-GFP 后培養(yǎng)24 h。參照siRNA說明書，使用脂質體核酸轉染試劑進行細胞轉染。

1.2.3 PCR擴增 提取H9C2 細胞的RNA將其反轉錄為cDNA，設計用于合成Circ-MYOCD 的引物，序列為5'-TCACGGAAGAATCCATAGGC-3'和5'-ACGGCTTCAACAGAGAAGGA-3'，進行聚合酶鏈式反應（PCR反應），35個循環(huán)后，將產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，30 min后，紫外下顯影并拍照。

1.2.4 CircRNA 富集實驗 首先從H9C2 中提取的總RNA，將原始的RNA分為2份，每份取5 μg的RNA，一份用RNase R處理，標記為 RNase R（+），另一份不做處理，標記為RNase R（-）。按試劑說明配制所需的反應體系，待RNase R酶消化后，提取RNA進行RT-qPCR檢測Circ-MYOCD和MYOCDD的RNA水平。

1.2.5 核質分離實驗 首先細胞收集，PBS清洗2遍，使用 Thermo Fisher 公司的核質分提試劑盒（PARISTMKit Protein and RNA Isolation System）進行實驗，加入ice-cold Cell Fractionation Buffer 冰上裂解10 min，離心后去除上清的細胞質，沉淀為細胞核，細胞核沉淀部分加入ice-cold Cell Disruption Buffer，將樣品轉移到套管中后續(xù)逐步用，洗液清洗最終的到得胞質和胞核的RNA。

1.2.6 qRT-PCR 使用試劑盒（捷飛）提取各組細胞總RNA，根據(jù)反轉錄試劑盒HiScript Ⅲ RT SuperMix forqPCR（+gDNA wiper）試劑盒合將 RNA 逆轉錄為cDNA，使用SYBR? Green Pro Taq HS 預混型試劑進行qRT-PCR檢測。以GAPDH和U6作為檢測內(nèi)參，用2-△△CT法計算基因表達（表1）。

1.2.7 Western blotting 使用RIPA裂解液在冰上裂解后提取細胞的總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。經(jīng)SDSPAGE將蛋白分離后、將蛋白轉移至PVDF膜、5%脫脂奶粉封閉2 h 后，加入相應的一抗（HNRPNH1、HNRNPL抗體的稀釋濃度為1：1000；GAPDH抗體的稀釋濃度為1∶3000），4 ℃ 孵育過夜，TBST洗3遍，加入二抗（山羊抗兔IgG的稀釋濃度為1∶3000），室溫慢搖孵育1 h，再次TBST洗3 遍，使用ECL顯色在暗室下顯影。所有蛋白條帶均以GAPDH為內(nèi)參。

1.2.8 過表達HNRNPH1 重組腺病毒的構建 首先在NCBI 中查詢到HNRNPH1 序列，以H9C2 的cDNA為模板經(jīng)PCR 擴增，將擴增產(chǎn)物定向插入pAd-Trackcmv-GFP載體中構成重組質粒。然后將重組質粒線性化后，在BJ5183大腸桿菌中與已有的pAd-Easy-I骨架質粒進行重組成重組腺病毒載體。最后，使用限制酶PmeⅠ將重腺病毒質粒線性化，轉染到293A細胞中包裝成Ad-HNRNPH1重組腺病毒。同時，用同樣的方法制備了Ad-GFP作為對照腺病毒。

1.2.9 統(tǒng)計學分析 應用GraphPad Prism8.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示，兩組間的差異比較采用配對t檢驗。以Plt;0.05（雙側）為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Circ-MYOCD在H9C2細胞中的成環(huán)性、分布和穩(wěn)定性鑒定

Circ-MYOCD由MYOCD的外顯子2～5 組成（圖1A），PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳的結果顯示在300 bp～400 bp 有片段存在，可以正確擴增出360 bp 大小的Circ-MYOCD片段（圖1B），Sanger測序結果顯示，PCR產(chǎn)物中包含的Circ-MYOCD 接頭序列正確（圖1C）。RNase R實驗結果顯示RNase R處理后線性MYOCD的mRNA 出現(xiàn)嚴重的降解（Plt;0.001），Circ-MYOCD的降解不明顯（圖2D）。核質分離實驗和RT-qPCR結果顯示，Circ-MYOCD 主要分布在細胞質中（Plt;0.001，圖2E）。

2.2 預測與Circ-MYOCD結合的RNA結合蛋白

在RBPmap數(shù)據(jù)庫中預測可以與 Circ-MYOCD相互結合的蛋白質，其中包含了SRSFs 蛋白家族成員中SRSF1、SRSF2、SRSF4、SRSF5、SRSF8、SRSF9、SRSF10；以及HNRNPs 蛋白家族中HNRNPA0、HNRNPA1、HNRNPA2B1、HNRNPDL、HNRNPF、HNRNPH1、HNRNPK、HNRNPL、HNRNPLL，將預測的結果與Circ-MYOCD的pull-down 的質譜結果中的HNRNPA3、HNRNPH1、HNRNPL、SRSF3 取交集，結果顯示HNRNPH1 和HNRNPL 可以與Circ-MYOCD相結合（圖2）。

2.3 敲低HNRNPH1和HNRNPL后對Circ-MYOCD與MYOCD的影響

RT-qPCR及Western blotting結果顯示si-HNRNPH1在H9C2細胞中有較明顯的敲低效率（Plt;0.001，圖3A、B）。RT-qPCR結果顯示H9C2細胞中敲低HRNPH1后Circ-MYOCD的表達升高（Plt;0.01），MYOCD的表達降低（Plt;0.05，圖3C）；敲低HNRNPL后Circ-MYOCD降低（Plt;0.001），而MYOCD的表達沒有明顯的變化（圖3D）。

2.4 HNRNPH1可能調(diào)控Circ-MYOCD的反向剪接

熒光顯微鏡成像結果顯示，Ad-HNRNPH1重組腺病毒對心肌細胞具有較高的感染效率（圖4A）；RTqPCR及Western blotting結果顯示，與GFP組相比，Ad-HNRNPH1組中檢測到該重組腺病毒具有較高的過表達效率（Plt;0.001，圖4B）。Ad-HNRNPH組與GFP組相比Circ-MYOCD表達下降（Plt;0.01），MYOCD表達升高（Plt;0.05，圖4C）。

2.5 HNRNPH1可能促進心肌肥厚的發(fā)生

AngⅡ構建的心肌肥大細胞模型中檢測到ANP、BNP這兩種心肌肥厚標志物分子的表達上升（Plt;0.001），心肌細胞肥大模型構建成功（圖5A）。Ang Ⅱ組中HNRNPH1在mRNA和蛋白水平相比于Control對照組的表達均升高（Plt;0.001，圖5B）。si-HNRNPH 組與NC相比肥厚標志物分子ANP和BNP的表達降低（Plt;0.05，圖5C）。Ad-HNRNPH1組與GFP 組相比ANP 和BNP 的表達升高（Plt;0.05，圖5D）。

2.6 HNRNPH1 影響Circ-myocd 的反向剪接且調(diào)控心肌肥厚的進展

RT-qPCR 和Western blotting 的結果顯示，AngⅡ+NC 組與Control+NC 組相比，Ang Ⅱ +NC 組的HNRNPH1的表達升高（Plt;0.05）；AngⅡ+si-HNRNPH1與Ang Ⅱ +NC 組相比，Ang Ⅱ +si-HNRNPH1 組中HNRNPH1的表達出現(xiàn)降低（Plt;0.05，圖6A）。RT-qPCR的結果顯示，AngⅡ+NC 組與Control+NC 組相比，AngⅡ+NC組的Circ-MYOCD的表達降低（Plt;0.05），MYOCD的表達升高（Plt;0.05），ANP和BNP的水平表達均有明顯的升高（Plt;0.001）；AngⅡ+si-HNRNPH1 與AngⅡ+NC 組相比，AngⅡ+si-HNRNPH1 組中Circ-MYOCD 的表達升高（Plt;0.001），MYOCD 的表達降低（Plt;0.01），ANP 和BNP 的水平表達均有明顯的降低（Plt;0.05，Plt;0.001，圖6B）。

3 討論

CircRNA是一種單鏈共價閉合環(huán)狀 RNA 分子，是通過線性RNA反向剪接形成的，在心肌肥厚的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的調(diào)控作用［16］，CircRNA的形成與剪接因子的調(diào)控密不可分［17］，與此同時，有研究指出剪接因子通過調(diào)控基因的剪接事件影響心肌細胞的肥大和重構，參與心肌肥厚的調(diào)控［18］。目前大量的研究已經(jīng)證明通過CircRNA與相應的miRNA相互作用，影響細胞的自噬、凋亡等過程，從而參與心肌肥厚的調(diào)控［19］，但是關于CircRNA如何受到剪接因子調(diào)控的研究尚顯不足，因此深入研究剪接因子與CircRNA之間的作用機制是十分有意義的，從而不僅為深入理解心肌肥厚的分子機制提供了新的視角，并為心血管疾病的預防和治療提供新的思路和策略。本研究發(fā)現(xiàn)HNRNPH1抑制了Circ-MYOCD的反向剪接，驗證了在肥大的心肌細胞中減少HNRNPH1的表達可以逆轉心肌肥大的發(fā)生。

CircRNA 是一種獨特的RNA 分子，它是由線性mRNA前體經(jīng)過反向剪接而形成的閉合環(huán)形結構［22］。相較于線性mRNA，CircRNA展現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性［21］。本研究針對MYOCD基因的外顯子2和外顯子5的接頭處設計了引物，成功地擴增出了正確的Circ-MYOCD，并驗證了接點的準確性。為了進一步確認其穩(wěn)定性，我們進行了RNase R實驗。實驗結果顯示，Circ-MYOCD比其宿主基因MYOCD的mRNA具有更強的穩(wěn)定性，能夠更好地抵抗RNase R的降解作用。此外，我們還驗證了Circ-MYOCD主要存在于細胞質中，是一種環(huán)形分子。前期研究結果中已經(jīng)驗證Circ-MYOCD在心肌中特異性表達，在肥大的心肌細胞中的表達降低，過表達Circ-MYOCD 可以抑制心肌肥大的發(fā)生。綜上，Circ-MYOCD在心肌細胞質中可以穩(wěn)定存在，其動態(tài)變化可能參與心肌肥厚的發(fā)生。因此，Circ-MYOCD有可能成為相關疾病的潛在生物標志物，為未來心血管疾病診斷和治療提供了新的思路和方向。

剪接因子在CircRNA的反向剪接過程中扮演著不可或缺的角色，通過精確調(diào)控剪接位點的選擇和剪接體的組裝，確保了CircRNA的穩(wěn)定生成和功能發(fā)揮［22］。在反向剪接的過程中，剪接體需精確識別并結合至特定的剪接位點，這一過程涉及一系列復雜的蛋白質-蛋白質和蛋白質-RNA相互作用［23］。目前已知，多個剪接因子參與了這一復雜的生物過程，其中，SRSFs蛋白家族和HNRNPs蛋白家族是兩種關鍵的RBPs白家族，它們在細胞內(nèi)各自扮演著獨特的角色，特別是在前體mRNA的剪接調(diào)控中發(fā)揮著相反或互補的作用［24， 25］。本研究中，我們利用RBPmap 數(shù)據(jù)庫及Circ-myocd 的pulldown質譜技術，深入分析了與Circ-MYOCD相互作用的蛋白質。結果發(fā)現(xiàn)，HNRNPH1 和HNRNPL可能與Circ-MYOCD相結合，并對其反向剪接過程產(chǎn)生影響。通過敲低HNRNPH1 的實驗，我們發(fā)現(xiàn)Circ-MYOCD的表達水平顯著上升，而MYOCD的表達則顯著下降。通過過表達實驗，我們得到了與之相反的結果，我們推測剪接因子HNRNPH1抑制了Circ-MYOCD的反向剪接過程。為了更深入地探究Circ-MYOCD在心肌肥厚中的反向剪接機制，我們在心肌肥厚模型中檢測了HNRNPH1的表達水平。結果顯示，HNRNPH1的表達水平在心肌肥大時上升。在心肌肥大且敲低HNRNPH1的實驗中，我們發(fā)現(xiàn)Circ-MYOCD的表達水平上升，而MYOCD 的表達水平下降，這一結果進一步證實了HNRNPH1 對Circ-MYOCD的負向調(diào)控作用。綜上，我們的研究結果表明HNRNPH1在肥厚的心肌中表達升高，抑制了Circ-MYOCD的反向剪接過程。

HNRNPH1在心血管疾病領域的研究中，展現(xiàn)了多方面的角色和重要性，它不僅作為生物標志物在診斷中發(fā)揮作用，還參與了心肌纖維化和代謝性心血管疾病的調(diào)控過程［26］。首先，HNRNPH1 被確認為肺動脈高壓（PAH）診斷的潛在重要生物標志物之一［27］。此外，HNRNPH1 還參與了DICAR代謝的調(diào)節(jié)過程，特別是對OGDHL、谷氨酰胺及谷胱甘肽的合成具有關鍵作用。在糖尿病相關的心血管疾病中，這一調(diào)節(jié)作用可能發(fā)揮著舉足輕重的作用［28］。在心肌梗死后的心肌纖維化研究中，可以通過直接注射重組腺相關病毒9（rAAV9）短發(fā)夾RNA（shRNA）來抑制circHNRNPH1的方法，可以有效降低心肌中circHNRNPH1 的水平［29， 30］。盡管這種方法對mRNA-HNRNPH1的影響不明顯，但它揭示了HNRNPH1在心肌纖維化過程中的潛在調(diào)控作用。作為RNA結合蛋白，HNRNPH1在RNA的成熟及轉錄后加工修飾過程中發(fā)揮著至關重要的作用。這一特性使其在心血管疾病的研究中具有潛在的應用價值。本研究實驗首次探究了HNRNPH1在心肌肥厚中的作用。實驗結果表明，HNRNPH1可以促進心肌肥厚標志物分子ANP、BNP的表達，具有促進心肌肥厚的效果。具體來說，在肥大的心肌細胞中，它通過抑制MYOCD的反向剪接，導致心肌細胞內(nèi)MYOCD的積累，減少Circ-MYOCD的產(chǎn)生促使細胞的肥大發(fā)生。對于肥大的心肌細胞而言，降低HNRNH1的表達可以提升Circ-MYOCD的表達，從而減少MYOCD的表達，進而有可能逆轉心肌肥厚的發(fā)生。這一發(fā)現(xiàn)與以往關于circ-MYOCD和MYOCD在心肌肥厚中作用的認知相吻合，即MYOCD 促進心肌細胞的增殖和肥厚。HNRNPH1與MYOCD之間的相互作用，為理解心肌肥厚的發(fā)生機制提供了新的視角，也為心血管疾病的治療提供了新的潛在靶點。

綜上所述，本研究證明Circ-MYOCD的反向剪接過程受到HNRNPH1的調(diào)控作用。在心肌肥厚發(fā)生的過程中，剪接因子HNRNPH1的表達顯著上升，這進而抑制了Circ-MYOCD的反向剪接活動。這一抑制作用導致Circ-MYOCD的水平降低，而MYOCD的含量上升，從而促成了心肌肥厚的發(fā)生。通過抑制HNRNPH1在肥厚過程中的表達，可以有效地減輕對Circ-MYOCD反向剪接的抑制效應。這一操作能使Circ-MYOCD的表達水平顯著提高，從而有可能逆轉心肌肥厚的發(fā)展。這一發(fā)現(xiàn)為未來心肌肥厚治療的研究提供了新的思路和科學依據(jù)。未來，我們將繼續(xù)深入研究Circ-MYOCD在抑制心肌肥厚作用中的下游靶標。我們將探索其具體的分子機制以及涉及的信號通路，以期在整體動物水平上更準確地明確Circ-MYOCD對心肌肥厚的調(diào)控作用。這些研究將為基于CircRNA的心肌肥厚治療研究提供寶貴的科學資料，為臨床治療提供新的可能性和方向。

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（編輯：余詩詩）