摘要：目的 探究菊淀粉型巴戟天寡糖（IOMO）對小鼠肺炎鏈球菌腦膜炎（SPM）的治療作用及可能的作用機(jī)制。方法 將120只雄性C57BL/6J 小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、SPM+生理鹽水（Saline）組、SPM+IOMO 25 mg/kg 劑量組、SPM+IOMO 50 mg/kg 劑量組，n=30。從造模當(dāng)天起（0 d），SPM+Saline 組和SPM+IOMO組小鼠分別灌胃生理鹽水或IOMO 25 mg/kg、50 mg/kg 進(jìn)行干預(yù)，持續(xù)7 d，記錄癥狀評分和死亡情況；采用腦組織HE染色和尼氏染色評價病理狀態(tài)和神經(jīng)元損傷情況，qRT-PCR檢測皮質(zhì)中炎癥相關(guān)分子mRNA水平，干濕重法測腦含水量和伊文思藍(lán)染色評價腦水腫程度和血腦屏障通透性，Western blotting檢測皮質(zhì)中BBB相關(guān)蛋白水平，流式細(xì)胞分析檢測浸潤淋巴細(xì)胞IFN-γ 水平；SPM造模后21 d 采用曠場實驗和新物體識別實驗評價小鼠學(xué)習(xí)記憶功能。結(jié)果 灌胃給予IOMO 50 mg/kg（1次/d，連續(xù)7 d）可降低SPM小鼠的癥狀評分和死亡率（Plt;0.05），緩解腦組織病理損傷，降低皮質(zhì)炎癥相關(guān)分子（IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-18、IFN-γ、iNOS、NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD）mRNA水平（Plt;0.05）； IOMO可以降低SPM小鼠腦含水量和伊文思藍(lán)滲透量（Plt;0.05）；IOMO可以上調(diào)腦皮質(zhì)血管內(nèi)皮鈣黏蛋白VECadherin和閉合蛋白Occludin 水平、下調(diào)水通道蛋白AQP4 和BBB損傷的關(guān)鍵調(diào)控因子iNOS、IFN-γ 水平（Plt;0.05）；建模21d后，與SPM + Saline組小鼠相比，IOMO可以改善SPM小鼠學(xué)習(xí)記憶能力（Plt;0.05）。結(jié)論 首次發(fā)現(xiàn)IOMO可降低SPM小鼠的癥狀評分和死亡率，并改善其學(xué)習(xí)記憶能力，其作用機(jī)制可能與IOMO抑制過度炎癥反應(yīng)并保護(hù)血腦屏障有關(guān)。

關(guān)鍵詞：菊淀粉型巴戟天寡糖；腦膜炎；肺炎鏈球菌；血腦屏障；干擾素-γ

細(xì)菌性腦膜炎（BM）是一種危及生命的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，是全球感染相關(guān)死亡的十大原因之一，具有發(fā)病快、爆發(fā)急、流行潛力大、死亡率高（16%～37%）等特點［1］。BM及其它感染（如新冠病毒）誘發(fā)的非可控免疫反應(yīng)，又稱炎癥因子風(fēng)暴，被認(rèn)為是其高致死率的關(guān)鍵病理機(jī)制，對于此類“炎性風(fēng)暴”損傷目前尚缺乏有效的干預(yù)手段。肺炎鏈球菌（S.P）是引起B(yǎng)M的主要細(xì)菌之一；流行病學(xué)研究表明，肺炎鏈球菌腦膜炎（SPM）在所有腦膜炎中致死率最高，且高達(dá)50%的幸存者會發(fā)生長期中樞神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥［2］。S.P通過本身的毒力因子（如莢膜、表面蛋白和溶血素等）和繼發(fā)的炎癥因子風(fēng)暴破壞血腦屏障，誘發(fā)腦水腫，這是其導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和嚴(yán)重后遺癥的重要原因［3］。盡管抗生素和糖皮質(zhì)激素可有效治療SPM，但致死率和病殘率仍然較高，并導(dǎo)致精神運(yùn)動障礙、記憶功能低下、聽力損傷等后遺癥，且存在潛在的細(xì)菌耐藥風(fēng)險［4］。探究感染后過度免疫反應(yīng)的調(diào)控藥物被認(rèn)為是高效干預(yù)此類疾病的理想選擇之一［5］。

近年來，基于新冠肺炎的治療經(jīng)驗，中醫(yī)藥在感染性疾病防治中的應(yīng)用日趨受到重視［6］。中藥巴戟天是“四大南藥”之一，為茜草科植物巴戟天的干燥根，已有2000多年的藥用歷史；具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕等功效，見于100 多種中成藥和200 多種傳統(tǒng)方劑［7］。菊淀粉型巴戟天寡糖（IOMO）是從巴戟天中提取的、以水溶性菊淀粉型3-9聚寡糖為主的中藥有效部位。巴戟天寡糖膠囊（國藥證字 Z20120007）于2012 年獲批上市，主要用于臨床輕中度抑郁癥治療，臨床療效與一線化學(xué)藥氟西汀相當(dāng)［8］。研究表明，巴戟天提取物還具有抗氧化［9］、抗炎［10］等多種生物活性；口服IOMO可抑制慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥［11］，并對潰瘍性結(jié)腸炎也有明確的治療作用［12］。目前還沒有該藥用于防治細(xì)菌性腦膜炎的報道。本研究擬建立小鼠SPM模型，探究IOMO對SPM的治療作用及潛在機(jī)制，以期為SPM的臨床治療提供新思路，進(jìn)一步為傳統(tǒng)中藥應(yīng)用于感染性疾病的治療提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性8 周齡C57BL/6J 小鼠120 只，體質(zhì)量21±1 g，購于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0010，實驗小鼠飼養(yǎng)于屏障環(huán)境，溫度22±2 ℃， 相對濕度（60±5）%，光照明暗交替（光照時間為8∶00～20∶00），實驗期間小鼠均自由活動及攝食飲水。所有動物實驗程序均經(jīng)軍事醫(yī)學(xué)研究院實驗動物福利倫理委員會批準(zhǔn)（倫理批號：IACUCDWZX-2023-P550）；實驗動物的飼養(yǎng)及干預(yù)處理嚴(yán)格遵循《實驗動物管理原則》。

1.2 試劑與儀器

IOMO原料藥（淺黃色粉末，北京同仁堂），其中3-9聚寡糖含量53%～70%，5 聚糖含量≥6%。肺炎鏈球菌（ATCC）；CD11b-percp、CD45-APC、IFN-γ-PE 流式抗體（Biolegend）；Percoll 細(xì)胞分離液（GE Healthcare）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TransGen Biotech）；TRIzol 試劑（Invitrogen）；β-actin一抗、iNOS一抗、AQP4一抗、VECadherin一抗、Occludin 一抗、IFN-γ一抗（ABclonal）；PVDF 膜（Amersham Biosciences） ；伊文思藍(lán)（Macklin）。

流式細(xì)胞分析儀（BD）；PCR儀（Bio-Rad）；實時熒光定量PCR儀（羅氏）；高速離心機(jī)（Eppendorf）；，低速離心機(jī)（Thermo）；微量注射器（上海安亭微量進(jìn)樣器廠）；恒溫?fù)u床（蘇州培英實驗設(shè)備有限公司）；Westernblotting電泳儀（Bio-Rad）；化學(xué)發(fā)光凝膠成像自動顯影儀（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 建模與分組

參照文獻(xiàn)［13］制備S.P懸液。1%戊巴比妥鈉按體質(zhì)量10 μL/g腹腔注射麻醉小鼠；醫(yī)用酒精消毒額頂皮膚、剪開皮膚并清理多余毛發(fā)；固定小鼠并調(diào)整姿態(tài)，暴露枕骨大孔；用微量進(jìn)樣器從枕骨大孔注射10 μL（1×109CFU/mL）菌液，注射后緩慢拔出針頭；縫合額頂皮膚，將小鼠放回籠內(nèi)。小鼠出現(xiàn)毛發(fā)干枯、無光澤，弓背向上，反應(yīng)遲鈍等表現(xiàn)，提示建模成功。將建模成功小鼠隨機(jī)分為SPM+Saline 組、SPM+IOMO 25 mg/kg 組和50 mg/kg 組；Sham組小鼠采用相同方法注射10 μL生理鹽水；n=30。從建模當(dāng)日（0 d）小鼠蘇醒后起，每日對小鼠灌胃給予生理鹽水或者IOMO溶液，持續(xù)7 d。實驗流程見圖1。

1.4 記錄小鼠癥狀評分和死亡情況

根據(jù)Koopmans 等［14］提出的癥狀評分標(biāo)準(zhǔn)對各組小鼠進(jìn)行評價，建模后每日記錄小鼠癥狀評分和死亡情況。

1.5 HE染色觀察腦組織病理學(xué)改變

麻醉小鼠后用20 mL生理鹽水灌注，脊椎脫臼法處死小鼠，取完整腦組織；腦組織用生理鹽水清洗后置于4%多聚甲醛中固定24 h；常規(guī)石蠟包埋，制備成厚度約4 μm的病理切片。將切片置于55 ℃烤箱內(nèi)烘烤30 min，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，加入蘇木精染液染色5 min，流水沖洗；加入伊紅染液染色1 min，流水再沖洗后，脫水、透明，滴加中性樹膠封片，自然晾干，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理變化并采集圖像。

1.6 尼氏染色觀察神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)變化

取1.5中制備的小鼠腦組織病理切片，二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，浸入甲基紫染液中染色10 min，蒸餾水洗滌，滴加 Nissl Differentiation 分化數(shù)秒，無水乙醇處理、二甲苯透明，充分洗滌后滴加中性樹膠封片，自然晾干，在光學(xué)顯微鏡下觀察切片染色情況并采集圖像。

1.7 qRT-PCR 檢測小鼠腦皮質(zhì)組織中炎癥相關(guān)分子mRNA表達(dá)情況

參照試劑盒說明書，用TRIzol 試劑提取小鼠腦皮質(zhì)組織的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)計引物（引物由生工生物工程有限公司合成，序列見表1），以cDNA為模板，設(shè)置3 復(fù)孔，進(jìn)行qRT-PCR檢測，以18S 為內(nèi)參對照，按2-ΔΔCt計算相對表達(dá)量，采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.8 腦含水量檢測

取完整的小鼠腦組織置于小玻璃瓶中，稱取腦組織濕質(zhì)量W1；隨后將小玻璃瓶置于溫度100 ℃的烤箱內(nèi)脫水24 h，稱量腦組織干質(zhì)量W2，計算腦含水量，腦含水量（%）=（W1-W2）/W1。

1.9 伊文思藍(lán)（EB）染色檢測BBB通透性

小鼠尾靜脈注射EB染料（1%，2 mL/kg），循環(huán)1 h后觀察到小鼠四肢、口鼻等皮膚裸露處明顯變藍(lán)；隨后麻醉小鼠，用20 mL生理鹽水灌注，脊椎脫臼法處死小鼠，取完整腦組織；加入2 mL/100 mg 二甲基甲酰胺勻漿研磨，55 ℃孵育18 h，離心取上清液，測定樣品吸光度A620 nm并計算EB透過量。

1.10 Western blotting測定腦皮質(zhì)AQP4、VE-Cadherin、Occludin、IFN-γ和iNOS水平

麻醉小鼠后用20 mL生理鹽水灌注，脊椎脫臼法處死小鼠，取腦皮質(zhì)組織；取得的組織加入RIPA裂解液裂解，離心后取上清液提取總蛋白；BCA法繪制標(biāo)曲并定量蛋白濃度。制備10% SDS-PAGE凝膠，恒壓電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜；5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入AQP4（1∶500）、VE-Cadherin（1∶500）、Occludin（1∶1000）、IFN-γ（1∶500）、iNOS（1∶1000）和β-actin（1∶5000）一抗，4 ℃孵育過夜；次日用TBST漂洗PVDF 膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，TBST漂洗后加入ECL顯影液顯色，以β-actin為內(nèi)參，采用全自動凝膠成像分析儀進(jìn)行拍照，采用Image J 軟件分析條帶灰度值，以待測目的蛋白與內(nèi)參β-actin 灰度值比值表示蛋白相對表達(dá)量。

1.11 流式細(xì)胞分析檢測腦組織浸潤淋巴細(xì)胞IFN-γ水平

參照文獻(xiàn)［15］方法配制FACS緩沖液（含2% FBS的PBS 溶液）、10% 1640 培養(yǎng)基、40% Percoll 和70%Percoll 用于實驗。小鼠腦組織經(jīng)研磨后加入膠原酶D和DNase消化，離心后用40% Percoll重懸；隨后將40%Percoll（含細(xì)胞）沿試管壁緩慢滴加到70% Percoll 上層，離心后收集40% Percoll和70% Percoll之間的單核細(xì)胞層，F(xiàn)ACS緩沖液離心清洗。加入胞內(nèi)染色刺激劑37 ℃刺激6 h，按說明書要求加入流式抗體（CD11bpercp、CD45-APC），4 ℃避光孵育30 min；FACS緩沖液清洗后加入PB固定液（200 μL/樣品），4 ℃固定過夜；次日用1 mL PB固定液清洗1次，100 μL PB固定液重懸，按說明書要求加入流式抗體IFN-γ-PE，4 ℃避光孵育30 min，1 mL PB固定液清洗2次，重懸后待測。圈門策略參考文獻(xiàn)［16］，結(jié)果采用Flow jo軟件分析。

1.12 行為學(xué)評價

1.12.1 曠場實驗（OFT） 采用OFT評價各組小鼠的習(xí)慣性記憶。在訓(xùn)練階段，小鼠從曠場實驗箱（50 cm×50 cm×40 cm，底部均分為16小格）角落面向箱壁放入，自由活動5 min，采用Smart 視頻分析軟件統(tǒng)計小鼠穿越箱底分隔線的次數(shù)（LCT）；24 h 后再次測試，受試小鼠因?qū)嶒炏洵h(huán)境有習(xí)慣性記憶而探索行為減少，LCT下降［17］。行為學(xué)實驗采用盲法，即由不了解具體分組情況的人員實施和記錄；每輪實驗間用75%乙醇溶液擦拭實驗箱內(nèi)部，清理小鼠排泄物，并待乙醇完全揮發(fā)后再放入下一只小鼠。

1.12.2 新物體識別實驗（NORT） 采用NORT評價各組小鼠的認(rèn)知能力。訓(xùn)練階段，在實驗箱（50 cm×50 cm×40 cm）一側(cè)放置兩個完全相同的物體（兩物體處于對稱位置），將受試小鼠放入實驗箱中，自由探索5 min；在測試階段（24 h后），將實驗箱中的一個物體更換為新物體（新物體的顏色、形狀等與舊物體不同，尺寸、體積與舊物體相似），再次將受試小鼠放入實驗箱中，自由探索5 min，采用Smart 視頻分析軟件記錄小鼠探索新物體的時間T1和探索舊物體的時間T2，計算識別指數(shù)RDI=T1/（T1+T2）×100%［17］。

1.13 統(tǒng)計學(xué)分析

計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用GraphPadPrism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)作正態(tài)性和方差齊性檢驗，生存率統(tǒng)計采用Kaplan-Meier法，組間比較采用雙因素方差分析，其余兩組間比較采用t檢驗，以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IOMO降低SPM小鼠癥狀評分和死亡率

各組小鼠癥狀評分和生存率（圖2）。Sham組小鼠在注射生理鹽水后僅出現(xiàn)短暫的體質(zhì)量下降趨勢，飲食及活動正常；SPM+Saline組和SPM+IOMO組小鼠在建模后出現(xiàn)毛發(fā)干枯、無光澤，弓背向上，反應(yīng)遲鈍，體質(zhì)量下降等癥狀。與Sham組相比，SPM+Saline組小鼠的癥狀評分隨時間升高（Plt;0.05）；灌胃IOMO 25 mg/kg（1 次/d，連續(xù)7 d，下同）僅使SPM小鼠的癥狀評分略有下降趨勢，而灌胃IOMO 50 mg/kg使SPM小鼠的癥狀評分降低（Plt;0.05），生存率提高（Plt;0.05），呈現(xiàn)治療效應(yīng)的劑量依賴關(guān)系，后續(xù)研究中采用IOMO 50 mg/kg作為有效劑量。

2.2 IOMO對SPM小鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)的影響

HE染色結(jié)果顯示（圖3），Sham組小鼠腦組織完好，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常且排列有序，細(xì)胞核著色均勻；而SPM+Saline組小鼠腦組織結(jié)構(gòu)疏松，血管擴(kuò)張充血，神經(jīng)細(xì)胞腫脹變形，細(xì)胞核固縮，可見壞死細(xì)胞，并有大量炎癥細(xì)胞浸潤；相較于SPM+Saline組，SPM+IOMO組（50 mg/kg）小鼠腦組織細(xì)胞形態(tài)有所恢復(fù)，細(xì)胞核固縮減少，炎癥細(xì)胞浸潤程度明顯減輕。

各組小鼠腦組織內(nèi)均有呈尼氏染色陽性的神經(jīng)元細(xì)胞。與Sham組相比，SPM+Saline組小鼠腦組織尼氏染色陽性細(xì)胞數(shù)目明顯減少；而與SPM+Saline組相比，SPM+IOMO組小鼠腦組織尼氏染色陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加（圖4）。

2.3 IOMO對SPM小鼠腦皮質(zhì)炎癥相關(guān)分子mRNA水平的影響

與Sham組相比，SPM+Saline組小鼠腦皮質(zhì)組織中促炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ、iNOS和炎癥小體通路相關(guān)分子NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD、IL-18 mRNA 水平明顯升高（Plt;0.05）；而與SPM + Saline組相比，IOMO 50 mg/kg可以逆轉(zhuǎn)上述分子mRNA水平（Plt;0.05，圖5）。

2.4 IOMO對SPM小鼠腦組織含水量和BBB通透性的影響

與Sham組相比，SPM+Saline組小鼠腦組織EB含量（Plt;0.05）和含水量（Plt;0.05）升高，提示SPM小鼠BBB損傷，通透性增加，發(fā)生腦水腫；而與SPM+Saline組相比，SPM+IOMO組小鼠腦組織EB含量（Plt;0.05）和含水量（Plt;0.05）降低（圖6）。

2.5 IOMO對SPM小鼠BBB通透性相關(guān)分子表達(dá)水平的影響

與Sham組相比，SPM+Saline組小鼠腦皮質(zhì)血管內(nèi)皮鈣黏蛋白VE-Cadherin 和閉合蛋白Occludin 表達(dá)減少，水通道蛋白Aquaporin-4（AQP4）和BBB損傷的關(guān)鍵調(diào)控因子iNOS、IFN- γ 表達(dá)增加（Plt;0.05）；而與SPM+Saline 組相比，IOMO 50 mg/kg 可逆轉(zhuǎn)上述分子表達(dá)水平（Plt;0.05，圖7）。

與Sham 組相比，SPM+Saline 組小鼠腦組織CD11bloCD45+IFN-γ+細(xì)胞比例明顯升高（Plt;0.05）；而與SPM+Saline 組相比，SPM+IOMO 組小鼠腦組織CD11bloCD45+IFN-γ+細(xì)胞比例明顯降低（Plt;0.05，圖8）。

2.6 IOMO緩解SPM引起的小鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙

曠場實驗顯示（圖9A、B），Sham組小鼠在測試階段的自主活動比在訓(xùn)練階段減少（Plt;0.05）；而SPM+Saline 組小鼠的自主活動在訓(xùn)練階段和測試階段差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05）；IOMO 50 mg/kg可恢復(fù)小鼠的習(xí)慣性記憶能力（Plt;0.05）。在新物體識別實驗中（圖9C），Sham組小鼠對新鮮物體具有明顯的偏好性，表現(xiàn)為對新事物探索時間長于對舊事物（Plt;0.05）；而SPM+Saline 組小鼠對新物體的探索欲明顯較低，探索新、舊物體的時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05）；IOMO50 mg/kg治療可恢復(fù)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力（Plt;0.05）。

3 討論

炎癥因子風(fēng)暴和BBB損傷在SPM的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［18］。本研究首次發(fā)現(xiàn)IOMO可顯著降低SPM小鼠的癥狀評分和死亡率，緩解過度炎癥反應(yīng)和神經(jīng)元損傷，降低BBB通透性，改善腦水腫，恢復(fù)SPM小鼠后期的自主行為和學(xué)習(xí)記憶能力，對SPM具有顯著保護(hù)和治療作用。

目前臨床上對于SPM的治療，主要采用抗生素（如頭孢曲松［19］）聯(lián)合糖皮質(zhì)激素藥物（如地塞米松和氫化可的松［20］）進(jìn)行抗菌、抗炎處理?，F(xiàn)有治療方案通過抑制炎癥反應(yīng)、改善神經(jīng)元代謝、控制粘連和水腫等緩解患者癥狀、改善預(yù)后。但是抗生素的大規(guī)模使用帶來致病菌進(jìn)化、耐藥菌增加等問題［21］；臨床研究發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素類藥物對帶有膿毒性休克癥狀的SPM患者有加重病情的風(fēng)險［22］，而且在一些以小鼠為實驗對象的基礎(chǔ)研究中發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素類藥物可能加重海馬神經(jīng)元損傷［23］。與現(xiàn)有臨床用藥相比，中藥具有多靶點、多途徑和低不良反應(yīng)等優(yōu)勢，其在以新冠肺炎為代表的急重癥感染性疾病治療中發(fā)揮重要作用，成為干預(yù)此類疾病的理想選擇之一［6］。研究表明，IOMO具有較強(qiáng)的抗炎、抗氧化等免疫調(diào)控功能，還可通過增加腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用［7］，因此本研究嘗試運(yùn)用IOMO對SPM小鼠進(jìn)行治療干預(yù)。本研究結(jié)果顯示，IOMO可以有效改善SPM小鼠的癥狀，降低死亡率；腦組織HE染色和尼氏染色結(jié)果顯示，IOMO組小鼠腦組織細(xì)胞形態(tài)有所恢復(fù)，炎性浸潤現(xiàn)象明顯改善，神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量趨于正常。前期研究證實，灌胃給予IOMO 25～100 mg/kg具有明確的抗抑郁效應(yīng)［24］，IOMO50 mg/kg 還具有抗PTSD［8］、改善AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力［25］等作用。目前已經(jīng)上市的巴戟天寡糖膠囊（北京同仁堂，國藥準(zhǔn)字Z20120013）治療抑郁癥口服劑量為300～600 mg/d（以IOMO計算），臨床研究數(shù)據(jù)顯示［26-28］，該劑量長期服用不良反應(yīng)輕微，顯示出良好的安全性。以該臨床給藥劑量折算成小鼠劑量為45.05～90.1 mg/kg，與本研究采用劑量基本一致。在SPM小鼠癥狀評分和死亡率實驗中，高劑量IOMO（50 mg/kg）的治療效果優(yōu)于低劑量（25 mg/kg），表現(xiàn)出一定的劑量依賴關(guān)系，這與上述IOMO相關(guān)研究中的效應(yīng)劑量一致，提示IOMO在抗抑郁有效劑量范圍內(nèi)，可有效保護(hù)和治療SPM導(dǎo)致的腦損傷。

SPM病理的關(guān)鍵驅(qū)動因素是機(jī)體對細(xì)菌的免疫反應(yīng)［2］。在一項包含48例BM患者的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，患者腦內(nèi)以TNF-α為代表的炎癥因子水平與疾病的嚴(yán)重程度和中樞神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥呈正相關(guān)［29］；有研究也發(fā)現(xiàn)［30］，SPM小鼠腦組織中IL-1β水平與中樞神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥相關(guān)。在本研究中，SPM+Saline組小鼠腦皮質(zhì)組織中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18、IFN-γ、iNOS等促炎性細(xì)胞因子水平高于Sham組，與上述文獻(xiàn)報道基本一致，提示SPM+Saline組小鼠腦組織中存在嚴(yán)重炎癥反應(yīng)；相較于SPM+Saline組，SPM+IOMO組小鼠腦組織中炎癥因子水平下降，炎癥反應(yīng)得以緩解。IL-18和部分IL-1β主要來源于激活的炎癥小體，實驗結(jié)果顯示SPM組小鼠腦組織炎癥小體相關(guān)分子NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD mRNA水平升高，而IOMO組水平降低，提示炎癥小體可能是IOMO抑制炎癥因子風(fēng)暴的途徑之一。

BBB調(diào)控循環(huán)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間的物質(zhì)交流，是保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)免受病原體侵襲的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)［31］。在SPM中，S.P本身的毒力因子和繼發(fā)的炎癥因子風(fēng)暴均對BBB產(chǎn)生破壞作用，引發(fā)免疫細(xì)胞浸潤和級聯(lián)炎癥反應(yīng)，這是SPM預(yù)后不良、后遺癥高發(fā)的重要原因［3］。AQP4在腦組織和BBB細(xì)胞廣泛表達(dá)，對維持腦內(nèi)水平衡和BBB完整性發(fā)揮重要作用；在SPM中，星形膠質(zhì)細(xì)胞等AQP4表達(dá)升高，誘發(fā)細(xì)胞毒性腦水腫，導(dǎo)致不良預(yù)后［32］。VE-cadherin 和Occludin 主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞，是組成細(xì)胞間緊密連接的重要成分［33］。在本研究中，SPM+Saline組小鼠腦組織含水量、EB含量和AQP4水平明顯升高，提示BBB通透性增加，出現(xiàn)腦水腫癥狀，與上述文獻(xiàn)報道一致；與SPM+Saline組相比，IOMO給藥小鼠腦組織含水量、EB含量和AQP4 水平明顯降低，提示BBB被部分修復(fù)、通透性降低，腦水腫癥狀緩解。然而，EB染色尚無法精確揭示BBB損傷的具體位置，在SPM中同時存在著緊密連接蛋白破壞［34， 35］、腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞穿孔［36， 37］等多種BBB損傷。本研究發(fā)現(xiàn)IOMO治療使SPM小鼠VE-Cadherin 和Occludin 表達(dá)水平回升，提示部分修復(fù)S.P對BBB連接蛋白的破壞，這可能是IOMO保護(hù)BBB的機(jī)制之一，IOMO是否同時通過其他途徑（如影響肺炎鏈球菌溶血素的穿孔作用）發(fā)揮BBB保護(hù)作用還需要進(jìn)一步研究和探討。

BBB和神經(jīng)元損傷與SPM患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥呈正相關(guān)［3］。為進(jìn)一步研究IOMO對SPM小鼠學(xué)習(xí)和記憶功能障礙的影響，本研究通過OFT和NORT對各組小鼠進(jìn)行評價；造模21 d后，SPM+Saline組小鼠習(xí)慣記憶能力和自主探索能力明顯降低；而SPM+IOMO組小鼠的習(xí)慣記憶能力和自主探索能力明顯回升，表明IOMO能有效改善SPM引起的學(xué)習(xí)記憶能力損傷。

IFN-γ和iNOS在SPM病理進(jìn)程中扮演重要角色，其中IFN-γ也是SPM臨床檢測的主要指標(biāo)之一［38］。在SPM中，IFN-γ的產(chǎn)生主要受炎癥小體接頭蛋白ASC和IL-18調(diào)控［39］；IFN-γ激活巨噬細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞，并與IL-1β一起調(diào)節(jié)其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生，使其成為細(xì)胞因子風(fēng)暴的關(guān)鍵調(diào)控因子［40］。在小鼠SPM模型中IFN-γ可通過誘導(dǎo)一氧化氮合酶2破壞BBB［13］；而Too等［41］研究者發(fā)現(xiàn)，與WT小鼠相比，IFN-γ-/-小鼠的BBB通透性和促炎細(xì)胞因子水平降低，海馬和皮層神經(jīng)元損傷減少，行為和認(rèn)知障礙得到改善。iNOS主要在中性粒細(xì)胞中存在，在炎癥、感染等病理狀態(tài)下可出現(xiàn)異常高表達(dá)，誘導(dǎo)NO合成，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞毒性；研究表明NO在BM的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用［42］，可促進(jìn)BBB破壞和促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生［43］。在本研究中，SPM+Saline組小鼠腦皮質(zhì)中IFN-γ、iNOS和腦組織浸潤淋巴細(xì)胞（CD11bloCD45+）中IFN-γ水平明顯升高，而SPM+IOMO組小鼠IFN-γ、iNOS水平明顯下降，提示IOMO可能通過調(diào)控IFN-γ、iNOS水平抑制級聯(lián)炎癥反應(yīng)，保護(hù)BBB。Chi等［44］研究者發(fā)現(xiàn)口服IOMO吸收較差，口服后血液和腦內(nèi)的藥物濃度較低；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)IOMO可能主要通過“腸-腦”軸影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能，發(fā)揮治療作用［45］。腸道菌群與BBB功能關(guān)系密切［46］，這可能是IOMO發(fā)揮BBB保護(hù)作用的重要內(nèi)在機(jī)制。本研究的不足之處主要在于尚未對IOMO影響炎癥因子水平和保護(hù)血腦屏障的機(jī)制作深入探索，這也是我們未來進(jìn)一步研究的方向。

綜上所述，IOMO能緩解SPM引起的急性癥狀，降低死亡率；減少腦組織炎癥反應(yīng)和神經(jīng)元損傷，減輕腦水腫和神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。其作用機(jī)制可能與其抑制過度炎癥反應(yīng)、保護(hù)血腦屏障有關(guān)。本研究也為IOMO應(yīng)用于急重癥感染性疾病的治療提供了理論依據(jù)。

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（編輯：經(jīng) 媛）