摘要：目的 探究Akkermansia muciniphila（A. muciniphila）灌胃對HIV-1 的包膜病毒蛋白gp120 誘導(dǎo)HIV相關(guān)神經(jīng)認(rèn)知功能障礙（HAND）動物模型中腸道菌群紊亂及腸-腦相互作用障礙（DGBIs）的改善作用。方法 用16S rRNA基因測序技術(shù)檢測6、9、12 月齡野生型（WT 型）小鼠與gp120 轉(zhuǎn)基因（gp120tg）小鼠腸道微生物組。將12 月齡小鼠分為WT+PBS 組、WT+A.muciniphila 組、gp120+PBS 組、gp120+A. muciniphila 組，持續(xù)6 周用A. mucinophila（2×108 CFU/小鼠）灌胃WT+A. muciniphila組及gp120+A. muciniphila組小鼠，1次/d。使用電子天平稱量小鼠體質(zhì)量。免疫組化法觀察各組小鼠結(jié)腸內(nèi)糖基化黏蛋白表達(dá)水平、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤情況、嗜酸性粒細(xì)胞激活標(biāo)志物主要堿性蛋白（MBP）表達(dá)水平。ELISA法檢測12月齡小鼠血清內(nèi)脂多糖表達(dá)情況及結(jié)腸內(nèi)IL-1β表達(dá)水平。qPCR法檢測各組小鼠結(jié)腸內(nèi)Occludin、ZO-1、IL-10、TNF-α、INF-γ表達(dá)水平。通過Morris水迷宮試驗(yàn)探究各組小鼠學(xué)習(xí)及空間記憶能力，通過免疫熒光法觀察各組小鼠腦神經(jīng)元損傷情況。結(jié)果 與WT型小鼠相比，gp120tg小鼠腸道菌群辛普森多樣性降低（Plt;0.001），其中12月齡gp120tg小鼠Akkermansia屬豐富度下降（Plt;0.05）；與12月齡WT 型小鼠相比，12 月齡gp120tg 小鼠血清內(nèi)脂多糖含量明顯升高（Plt;0.01），小鼠結(jié)腸內(nèi)糖基化黏蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（Plt;0.01），灌胃減小結(jié)腸內(nèi)糖基化黏蛋白的差異且灌胃前后各組小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05）；12月齡gp120tg小鼠結(jié)腸內(nèi)緊密連接蛋白Occludin、ZO-1 表達(dá)水平降低（Plt;0.001），并于灌胃后增加（Plt;0.001）；12 月齡gp120tg 小鼠結(jié)腸內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞存在明顯的浸潤激活及促炎細(xì)胞因子TNF-α（Plt;0.001）、INF-y（Plt;0.001）、IL-1β（Plt;0.05）表達(dá)水平的上調(diào)，而抑炎細(xì)胞因子IL-10表達(dá)水平降低（Plt;0.001），灌胃可減小其差異；12月齡gp120tg小鼠存在明顯的認(rèn)知損傷且海馬及皮層中神經(jīng)元數(shù)量減少（Plt;0.05），灌胃后小鼠認(rèn)知損傷得到明顯改善且海馬及皮層中神經(jīng)元數(shù)量增加（Plt;0.05）。結(jié)論 gp120tg小鼠菌群豐富度及多樣性顯著低于WT型小鼠，12 月齡gp120tg 小鼠Akkermansia 屬豐度明顯低于WT型小鼠，二者DGBIs 相關(guān)指標(biāo)表達(dá)情況存在明顯差異。A. muciniphila灌胃顯著減少12月齡gp120tg小鼠腸屏障損傷、降低結(jié)腸炎癥反應(yīng)及嗜酸性粒細(xì)胞激活水平、減少小鼠認(rèn)知損傷及腦神經(jīng)元損傷。

關(guān)鍵詞：gp120；腸道菌群；腸-腦相互作用障礙；嗜酸性粒細(xì)胞；神經(jīng)認(rèn)知功能損傷；Akkermansia muciniphila

神經(jīng)退行性疾病HIV 相關(guān)神經(jīng)認(rèn)知功能障礙（HAND）是HIV患者的并發(fā)癥之一，大多數(shù)患者表現(xiàn)為輕度認(rèn)知功能障礙，焦慮和抑郁是其常見合并癥［1， 2］。HIV-1的包膜病毒蛋白gp120存在于病毒的外層，其與人類T細(xì)胞受體CD4+結(jié)合的過程是 HIV-1 進(jìn)入CD4+宿主細(xì)胞的第一步，gp120是病毒感染過程中的重要組成部分［3］。HAND致病性的一個可能解釋是gp120產(chǎn)生的持續(xù)免疫激活和細(xì)胞毒性作用導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元損傷［4-6］。本研究中使用的gp120轉(zhuǎn)基因（gp120tg）小鼠是目前廣泛應(yīng)用于gp120相關(guān)HAND研究的動物模型。gp120tg小鼠能表現(xiàn)出與人類艾滋病大腦相似的神經(jīng)病理學(xué)，例如突觸和樹突密度降低，活化小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加及星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著增多。此外，gp120tg小鼠與神經(jīng)認(rèn)知損傷的HIV感染者大腦還存在大量相同的差異調(diào)節(jié)基因［7， 8］。

腸道微生物群在神經(jīng)退行性疾病發(fā)生發(fā)展中起重要作用，腸道微生物群改變在阿爾茲海默病及帕金森等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中已被證實(shí)，目前研究將Akkermansia屬、Faecalibacterium屬及Prevotella屬定義為阿爾茲海默病及帕金森等神經(jīng)退行性疾病腸道微生物群改變最常涉及的微生物群［9］。有證據(jù)表明，腸道通透性參與這些神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制［10］。盡管有研究指出HIV患者常伴隨腸道菌群紊亂［11］、腸通透性增加［12］，但HIV患者并發(fā)癥HAND涉及的腸道微生物群改變?nèi)晕幢粡V泛研究，腸-腦軸在gp120誘導(dǎo)神經(jīng)認(rèn)知功能損傷中的作用尚不明確。

腸-腦相互作用障礙（DGBIs），又名功能性胃腸道疾病，是指在沒有結(jié)構(gòu)異常的情況下出現(xiàn)的腹部癥狀，如腸易激綜合征和功能性消化不良。包括焦慮和抑郁在內(nèi)的心理障礙是DGBIs患者最普遍的精神合并癥［13］。DGBIs患者常伴隨腸道炎癥反應(yīng)增加、腸道微生物群紊亂及腸道通透性增加等腸道癥狀［14］。目前對于gp120誘導(dǎo) HAND動物模型中腸道菌群紊亂及DGBIs指標(biāo)改變尚無報道，因此本研究首先通過16S rRNA檢測了gp120tg小鼠與野生型（WT型）小鼠腸道微生物組，基于前期16SrRNA測序結(jié)果檢測回補(bǔ)A. muciniphila 后gp120tg 小鼠DGBIs 相關(guān)指標(biāo)的改善情況，從而探究gp120 誘導(dǎo)HAND動物模型中腸道菌群紊亂及DGBIs改變。

1 材料和方法

1.1 材料

動物實(shí)驗(yàn)方案由南方醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（倫理批號：D2022089），gp120tg 小鼠由美國南加州大學(xué)洛杉磯兒童醫(yī)院Saban研究所友情饋贈，在南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心繁殖并鑒定。相同遺傳背景的WT型C57BL/6 小鼠購買于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，作為正常對照組。實(shí)驗(yàn)組為gp120 轉(zhuǎn)基因小鼠（gp120tg小鼠，6、9、12月齡，n=20，雄性）；C57BL/6J 黑色小鼠（WT型小鼠，6、9、12月齡，n=14，雄性）用作野生型對照。DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司），NanoDrop微量分光光度計、Qubit熒光計（賽默飛世爾科技），TruSeq DNA文庫制備試劑盒（因美納公司），TRIzol 試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR SYBR GreenMaster Mix（北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司），脂多糖（LPS）ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司），白細(xì)胞介素 1β（IL-1β）試劑盒（江蘇蘇酶科生物有限公司），高碘酸-雪弗染色試劑盒和蘇木素及鉻變素（武漢賽維爾生物科技有限公司），神經(jīng)元核NeuN抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司），抗淬滅密封劑（賽默飛世爾科技），熒光顯微鏡（日本尼康公司），粘蛋白（上海源葉生物科技有限公司），腦心浸出液肉湯（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司），一抗（1∶200）、二抗（1∶500）（賽默飛世爾科技公司），NeuN（1∶200）、熒光二抗（1∶500）（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司），水迷宮裝置。

1.2 方法

1.2.1 腸道菌群16S rRNA測序 根據(jù)DNA提取試劑盒說明書，收集糞便用于DNA提取。使用NanoDrop 微量分光光度計測定總DNA 濃度。用引物V4 F（5'-GTGTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和V4 R（5'-CCGGACTACNVGGGTWTCTAAT-3'）對細(xì)菌16 S rRNA的可變區(qū)4（V4）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min，27個循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，再72 ℃延伸10 min），最后4 ℃冷卻并保存。根據(jù)制造商的建議，使用TruSeq DNA文庫制備試劑盒產(chǎn)生測序文庫，并添加索引代碼。使用Qubit熒光計和Agilent2100生物分析儀系統(tǒng)對文庫質(zhì)量進(jìn)行評估。最后，在Illumina HiSeq 2500平臺上對文庫進(jìn)行測序。

1.2.2 A.mucinophila培養(yǎng)及灌胃 A.mucinophila標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC BAA-835）購自廣東省微生物菌種保藏中心。A.mucinophila在37 °C厭氧條件下，于含有0.2%來自豬胃的粘蛋白的腦心浸出液肉湯中生長。進(jìn)一步將12月齡WT型小鼠隨機(jī)分為WT+PBS組（WT型小鼠，灌胃PBS，n=6）、WT+A. muciniphila 組（WT 型小鼠，灌胃A.muciniphila，n=6），將12 月齡gp120tg 小鼠隨機(jī)分為gp120+PBS組（gp120tg小鼠，灌胃PBS，n=6）、gp120+A.muciniphila組（gp120tg小鼠，灌胃A. muciniphila，n=6），在后續(xù)動物實(shí)驗(yàn)中，用A.mucinophila（2×108 CFU/小鼠）灌胃WT+A.mucinophila 組及gp120+A.mucinophila 組小鼠，無菌PBS（200 μL/小鼠）灌胃WT+PBS組及gp120+PBS組小鼠，1次/d，持續(xù)6周。于每次灌胃實(shí)驗(yàn)開展前使用電子天平稱量小鼠體質(zhì)量并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.3 小鼠血清、結(jié)腸、腦組織取材 于取材前停止實(shí)驗(yàn)小鼠的水及糧食供給12 h，對小鼠實(shí)施腹腔麻醉。待小鼠進(jìn)入深麻醉狀態(tài)即可進(jìn)行取材，于右心室取血，置于不含抗凝劑的無酶EP管，于4 ℃保存1 h，待血液凝固后，使用低溫高速離心機(jī)離心，離心后收集上層的淡黃色血清。使用注射器取300 mL生理鹽水對小鼠進(jìn)行緩慢灌注至小鼠肝臟和肺部逐漸變?yōu)榘咨纯?，隨后斷頭，將腦組織置于無菌EP管中，向EP管中加入4%多聚甲醛，于4 ℃固定48 h 以保持組織形態(tài)并防止其降解。取出結(jié)腸組織后使用無菌PBS洗滌小鼠結(jié)腸組織中的糞便殘留物并將新鮮結(jié)腸組織置于無酶EP管中，部分使用4%多聚甲醛固定，部分置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 RNA提取及qPCR 使用qPCR法檢測小鼠結(jié)腸Occludin、ZO-1、TNF- α、INF- γ、IL-10 表達(dá)水平。用TRIzol試劑提取小鼠結(jié)腸（0.1 g）總RNA后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA轉(zhuǎn)化為cDNA。使用qPCR SYBRGreen Master Mix和7500實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)測定基因表達(dá)。靶基因表達(dá)水平的相對定量通過2-ΔΔCT方法測定，使用GAPDH和16 S進(jìn)行歸一化。本研究使用的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。

1.2.5 ELISA實(shí)驗(yàn) 按照ELISA試劑盒說明書檢測小鼠結(jié)腸組織內(nèi)IL-1β及血清中LPS表達(dá)水平。在處死小鼠前收集小鼠血清及結(jié)腸組織。在4 ℃環(huán)境下，將100 mg新鮮結(jié)腸置于1.5 mL離心管內(nèi)，向其中加入1 mLPBS 液，用組織勻漿機(jī)破碎勻漿后，12 000 r/min 離心10 min，取20 μL上清液。

1.2.6 免疫組織化學(xué)及特殊染色 使用免疫組化法觀察小鼠結(jié)腸杯狀細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞激活標(biāo)志物MBP。首先，收集小鼠結(jié)腸組織樣品并在4%多聚甲醛中4 ℃固定48 h 以保持組織形態(tài)并防止降解。固定后，用PBS沖洗組織以去除過量的固定劑。固定的組織通過酒精脫水并包埋，使用切片機(jī)切割制備成石蠟切片。切片脫蠟至水，抗原修復(fù)后使用3%的雙氧水處理切片，使用免疫組化油筆圍繞組織畫圈并使用血清進(jìn)行封閉，一抗（1：200）4 ℃過夜孵育后二抗（1：500）室溫孵育，加DAB顯色液后使用蘇木素染液復(fù)染，染色結(jié)束后進(jìn)一步對組織進(jìn)行脫水、透明，封片后使用顯微鏡觀察MBP陽性嗜酸性粒細(xì)胞并采集圖片。特殊染色切片則分別用過碘酸希夫（PAS）染色以分析杯狀細(xì)胞，蘇木素和鉻變素染色組織塊以分析嗜酸性粒細(xì)胞。使用光學(xué)顯微鏡在低倍鏡（×10）下分析組織切片中的嗜酸性粒細(xì)胞及杯狀細(xì)胞，并轉(zhuǎn)換為更高放大倍鏡（×40）進(jìn)行單個細(xì)胞計數(shù)及觀察特征。

1.2.7 免疫熒光檢測 使用免疫熒光法檢測小鼠海馬及皮層組織神經(jīng)元標(biāo)志物NeuN表達(dá)情況。根據(jù)Abcam標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)步驟對小鼠半腦樣品進(jìn)行固定、包埋和切片。用 1% BSA 封閉腦組織切片，并與用1% BSA稀釋的一抗兔抗NeuN（1∶200）孵育過夜。洗滌切片后，將它們與熒光二抗（1∶500）在室溫下孵育1 h。通過TBST洗滌后用DAPI 重新染色5 min，DAPI染色后添加抗淬滅密封劑覆蓋切片。最后，通過熒光顯微鏡進(jìn)行拍照并觀察切片。

1.2.8 Morris 水迷宮試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分為兩個部分：隱蔽站臺試驗(yàn)、空間探索試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)開展前對4組小鼠進(jìn)行平臺可見期試驗(yàn)，此期間需暴露平臺，并強(qiáng)制小鼠于平臺上休息。隱蔽站臺試驗(yàn)為期5 d，需隱藏平臺。隱蔽站臺試驗(yàn)結(jié)束的第2天進(jìn)行空間探索試驗(yàn)。在該實(shí)驗(yàn)中，需移除水下隱藏的平臺，隨機(jī)將小鼠面朝池壁放入水池內(nèi)。使用TSE VideoMot2 視頻跟蹤小鼠，記錄小鼠在60 s內(nèi)穿越原平臺的次數(shù)、小鼠在原平臺所在象限停留時間等及小鼠游泳軌跡。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS25.0 進(jìn)行統(tǒng)計分析，通過GraphPadPrism 9軟件（版本9.5.0）生成圖。多組比較采用單因素方差分析，Tukey 法對數(shù)據(jù)進(jìn)行事后多重檢驗(yàn)，Plt;0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。ImageJ軟件用于分析組織樣品的組織學(xué)圖像。

2 結(jié)果

2.1 12月齡gp120tg小鼠Akkermansia屬豐度降低

與WT型小鼠相比，gp120tg小鼠腸道微生物群辛普森多樣性指數(shù)降低（Plt;0.001，圖1A）。主坐標(biāo)分析（PCoA）揭示了兩組樣本之間的明顯分離（圖1B）。12月齡小鼠屬水平上的腸道菌群差異熱圖顯示gp120tg小鼠Akkermansia 屬、Prevotella 屬等的豐度顯著低于WT型小鼠（圖1C）。Akkermansia屬豐度隨著gp120tg小鼠年齡增加而持續(xù)下降，其中12月齡gp120tg小鼠與12 月齡WT型小鼠Akkermansia 屬豐度存在顯著差異（Plt;0.05，圖1D）。

2.2 12月齡gp120tg小鼠腸屏障受損

與12月齡WT型小鼠相比，12月齡gp120tg小鼠結(jié)腸內(nèi)杯狀細(xì)胞PAS陽性細(xì)胞明顯減少（Plt;0.01，圖2A、B），血清內(nèi)LPS含量增加（Plt;0.001，圖2C）。qPCR結(jié)果顯示，與12 月齡WT型小鼠相比，12 月齡gp120tg 小鼠結(jié)腸IFN-γ 表達(dá)水平升高（Plt;0.001，圖2D），結(jié)腸緊密連接蛋白Occludin及ZO-1表達(dá)水平降低（Plt;0.001，圖2E、F）。

2.3 12月齡gp120tg小鼠腸道炎癥反應(yīng)及免疫應(yīng)答增加

與12月齡WT型小鼠相比，12月齡gp120tg小鼠結(jié)腸嗜酸性粒細(xì)胞存在明顯浸潤（Plt;0.05，圖3A、C）。免疫組化結(jié)果顯示，12 月齡gp120tg 小鼠結(jié)腸MBP 陽性細(xì)胞增加，嗜酸性粒細(xì)胞激活水平升高（Plt;0.05，圖3B、D）。與12月齡WT型小鼠相比，12月齡gp120tg小鼠結(jié)腸內(nèi)抗炎細(xì)胞因子IL-10表達(dá)水平下調(diào)（Plt;0.001，圖3E），促炎細(xì)胞因子TNF-α表達(dá)水平上調(diào)（Plt;0.001，圖3F）。ELISA結(jié)果顯示，gp120tg小鼠IL-1β表達(dá)量高于WT型小鼠（Plt;0.05，圖3G）。

2.4 A.muciniphila 灌胃改善12 月齡gp120tg 小鼠腸屏障損傷

與12月齡WT型小鼠相比，12月齡gp120tg小鼠杯狀細(xì)胞PAS陽性細(xì)胞減少（Plt;0.01），A.muciniphila灌胃顯著縮小其差異（圖4 A、B），同時下調(diào)12月齡gp120tg小鼠結(jié)腸內(nèi)INF-γ表達(dá)水平，上調(diào)12月齡gp120tg小鼠結(jié)腸緊密連接蛋白Occludin 及ZO-1 表達(dá)水平（Plt;0.001，圖4C～E），改善了12月齡gp120tg小鼠結(jié)腸緊密連接完整性。檢測灌胃A.muciniphila前后小鼠體質(zhì)量變化，結(jié)果顯示12月齡WT型小鼠及gp120tg小鼠體質(zhì)量均無發(fā)生顯著改變（Pgt;0.05，圖4F）。

2.5 A.muciniphila 灌胃降低12 月齡gp120tg 小鼠結(jié)腸炎癥反應(yīng)及免疫應(yīng)答水平

免疫組化結(jié)果顯示，gp120+PBS 組結(jié)腸內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤水平高于WT+PBS組（Plt;0.05），A.muciniphila灌胃縮小其差異（圖5A、C），并下調(diào)了gp120tg小鼠結(jié)腸內(nèi)MBP 表達(dá)水平（Plt;0.05，圖5B、D）。與gp120+PBS組相比，灌胃增加了12 月齡gp120tg 小鼠結(jié)腸內(nèi)IL-10表達(dá)量（Plt;0.01，圖5E），減小了12月齡gp120tg小鼠結(jié)腸內(nèi)TNF-α表達(dá)量（Plt;0.01，圖5F）。ELISA 檢測結(jié)果顯示，與gp120+PBS組相比，gp120+A.muciniphila組小鼠結(jié)腸內(nèi)IL-1β表達(dá)水平上調(diào)（Plt;0.05），灌胃顯著縮小其差異（圖5G）。

2.6 A.muciniphila 灌胃改善12 月齡gp120tg 小鼠認(rèn)知損傷

在空間探索試驗(yàn)中，各組小鼠游動軌跡圖顯示，gp120+PBS 組小鼠的搜索軌跡集中性較低（圖6A）。gp120+PBS組小鼠在目標(biāo)象限花費(fèi)的時間及路程明顯低于WT+PBS 組小鼠（Plt;0.05），灌胃顯著縮小了其差距（圖6B、C）。同時，gp120+PBS組小鼠穿越平臺次數(shù)低于WT+PBS組（Plt;0.01，圖6D），A.muciniphila灌胃顯著減小了其差距（圖6D）。各組小鼠的游動速度及總游動距離差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05，圖6E、F）。

2.7 A.muciniphila 灌胃改善12 月齡gp120tg 小鼠腦神經(jīng)元損傷

通過NeuN（綠色）免疫熒光定量12月齡gp120tg小鼠腦神經(jīng)元損傷程度。gp120+PBS組海馬（Plt;0.01）及皮層（Plt;0.05）中神經(jīng)元數(shù)量低于WT+PBS組。gp120+A.muciniphila 組相較gp120+PBS 組，小鼠海馬（Plt;0.01）及皮層（Plt;0.05）中神經(jīng)元數(shù)量增多（圖7）。

3 討論

HIV-1 相關(guān)神經(jīng)認(rèn)知功能障礙（HAND）背后的致病機(jī)制仍未被充分解釋，HAND致病性一個可能解釋是gp120 產(chǎn)生的持續(xù)免疫激活和細(xì)胞毒性作用導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元損傷［4-6］。本研究探究了gp120 誘導(dǎo)HAND動物模型中腸道菌群紊亂及腸-腦相互作用障礙（DGBIs）指標(biāo)改變。結(jié)果顯示，gp120轉(zhuǎn)基因（gp120tg）小鼠相較野生型（WT型）小鼠，其腸道菌群辛普森多樣性指數(shù)顯著降低，菌群豐富度及多樣性顯著下降。其中，Akkermansia 屬豐度在gp120tg 小鼠中呈年齡相關(guān)性下降，12月齡gp120小鼠Akkermansia屬豐度顯著低于WT型小鼠，這與已報道的在HIV患者中的發(fā)現(xiàn)存在一致性［15-17］。近期研究表明，Akkermansia 屬能增加抗炎細(xì)胞因子釋放［18］。Akkermansia屬通過保護(hù)粘液層在腸道健康中起重要作用，其失調(diào)與腸屏障功能損傷相關(guān)［19， 20］。我們進(jìn)一步檢測12月齡小鼠腸屏障相關(guān)指標(biāo)并使用“腸道炎癥動物模型組織病理學(xué)評價的類別和一般標(biāo)準(zhǔn)”對PAS染色結(jié)果進(jìn)行評分［21］。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與12月齡WT型小鼠相比，12月齡gp120tg杯狀細(xì)胞豐度明顯減少、血清LPS含量明顯增加、腸組織緊密連接蛋白Occludin、ZO-1表達(dá)水平顯著下調(diào)，而gp120+A.muciniphila組腸屏障指標(biāo)明顯得到改善。這表明12月齡gp120tg小鼠腸屏障存在明顯的損傷，A.muciniphila 能減小12 月齡gp120tg 小鼠腸屏障損傷程度。腸屏障功能障礙是DGBIs基本病理特征之一［22， 23］。2016年，羅馬IV診斷指南中將“ 功能性胃腸障礙”重命名為“腸-腦相互作用障礙（DGBIs）”［24］，強(qiáng)調(diào)了腸道和大腦之間的異常相互作用是該疾病的核心機(jī)制。為探究腸-腦軸機(jī)制疾病DGBIs指標(biāo)在gp120誘導(dǎo)的腸道菌群紊亂與神經(jīng)認(rèn)知損傷中的潛在作用，我們進(jìn)一步檢測了DGBIs相關(guān)指標(biāo)。

腸上皮屏障具有分隔腸腔內(nèi)物質(zhì)及維持腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要作用，當(dāng)腸道菌群失調(diào)、腸屏障被破壞時，微生物代謝產(chǎn)物及其他外來有害物質(zhì)就可以通過受損的腸屏障進(jìn)入體內(nèi)，從而導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)激活，急性或慢性炎癥發(fā)生。目前許多證據(jù)表明，腸道炎癥與腸屏障功能障礙有關(guān)［25］。在DGBIs 患者腸道中，促炎細(xì)胞因子如INF-γ、IL-1β、TNF-α表達(dá)顯著上調(diào)［26］。本研究中，12月齡gp120tg 小鼠結(jié)腸INF-γ表達(dá)水平顯著高于12 月齡WT 型小鼠，灌胃顯著縮小了這種差異。已有研究表明， IFN-γ在調(diào)節(jié)緊密連接蛋白表達(dá)和腸屏障功能方面起著至關(guān)重要的作用［27， 28］。同時，IFN-γ 是目前許多研究中測量腸道炎癥嚴(yán)重程度的替代指標(biāo)［29］。這提示腸屏障受損的12月齡gp120tg小鼠腸道內(nèi)可能存在較高的炎癥反應(yīng)。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步檢測了12 月齡小鼠結(jié)腸內(nèi)炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)情況，研究結(jié)果觀察到，與WT型小鼠相比，腸屏障功能明顯損傷的gp120tg小鼠結(jié)腸內(nèi)促炎細(xì)胞因子IL-1β及TNF-α表達(dá)水平明顯上調(diào)、抑炎細(xì)胞因子IL-10表達(dá)水平明顯下調(diào)，灌胃顯著縮小了這種差異。12 月齡gp120tg 小鼠結(jié)腸炎癥反應(yīng)增加可能與腸屏障損傷有關(guān)。

持續(xù)不斷的炎癥會引起機(jī)體免疫系統(tǒng)激活。最近研究提出了DGBIs患者腸粘膜內(nèi)免疫細(xì)胞如肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤的證據(jù)，這一證據(jù)還表明，免疫細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞釋放的傷害性介質(zhì)增加在DGBIs中起關(guān)鍵作用［30］。在本研究中，12月齡gp120tg小鼠相較12月齡WT型小鼠，其結(jié)腸組織嗜酸性粒細(xì)胞存在明顯的浸潤。在此基礎(chǔ)上，我們通過MBP染色評估MBP沉積并觀察嗜酸性粒細(xì)胞以評估gp120tg 小鼠結(jié)腸組織中嗜酸性粒細(xì)胞激活情況，陽性MBP可以指示嗜酸性粒細(xì)胞的活化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察到gp120+PBS 組與WT+PBS組相比具有較高數(shù)量的MBP陽性嗜酸性粒細(xì)胞。gp120+A.muciniphila組與WT+A.muciniphila組則無明顯差異，灌胃顯著降低了12月齡gp120tg小鼠結(jié)腸嗜酸性粒細(xì)胞浸潤激活水平。12 月齡gp120tg 小鼠嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量增加及MBP陽性嗜酸性粒細(xì)胞的存在表明嗜酸性粒細(xì)胞積極參與了其結(jié)腸組織內(nèi)的免疫應(yīng)答，這可能是對炎癥刺激的應(yīng)答。已有研究表明，嗜酸性粒細(xì)胞可以通過從其顆粒釋放的包括MBP在內(nèi)的各種細(xì)胞因子及蛋白質(zhì)增強(qiáng)其他炎癥細(xì)胞的增殖和活力［31］。MBP還具有破壞細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的細(xì)胞毒性作用，最終可導(dǎo)致腸緊密連接損傷并可導(dǎo)致細(xì)胞死亡［32］。嗜酸性粒細(xì)胞釋放的生物活性介質(zhì)，如陽離子蛋白及神經(jīng)營養(yǎng)因子，能導(dǎo)致包括神經(jīng)生長、神經(jīng)損傷、神經(jīng)肽合成和釋放及激活和敏化在內(nèi)的多種神經(jīng)元效應(yīng)，導(dǎo)致病理?xiàng)l件下的高反應(yīng)性和異常神經(jīng)肽釋放［31］。同時，抑郁和認(rèn)知損傷往往伴隨明顯的腦神經(jīng)元損傷［33， 34］。而近期研究表明，帕金森模型小鼠腸道中Akkermansia屬豐度顯著降低［35］，A.muciniphila灌胃可以減少帕金森小鼠海馬體的神經(jīng)炎癥［36］，A.muciniphila補(bǔ)充在神經(jīng)退行性疾病治療中發(fā)揮重要潛在作用。本研究進(jìn)一步檢測了A.muciniphila灌胃前后12月齡gp120tg小鼠學(xué)習(xí)能力、空間記憶能力及腦神經(jīng)元數(shù)量變化，結(jié)果表明A.muciniphila灌胃明顯改善12月齡gp120tg小鼠認(rèn)知損傷及腦神經(jīng)元損傷。然而，本研究并未深入探討嗜酸性粒細(xì)胞釋放的生物活性介質(zhì)對神經(jīng)元產(chǎn)生的影響，擬作為下一個研究重點(diǎn)進(jìn)行探討。

本研究通過16S rRNA測序分析發(fā)現(xiàn)12 月齡WT型小鼠與gp120tg小鼠Akkermansia屬豐度存在顯著差異，在此基礎(chǔ)上探究了A.muciniphila 灌胃前后DGBIs相關(guān)指標(biāo)的改變，發(fā)現(xiàn)A.muciniphila可改善gp120誘導(dǎo)的神經(jīng)認(rèn)知功能損傷。綜上所述，本研究初步證實(shí)了gp120誘導(dǎo)的腸道菌群紊亂與神經(jīng)認(rèn)知功能損傷相關(guān)，本研究中A. muciniphila 灌胃處理后gp120tg 小鼠DGBIs相關(guān)指標(biāo)的改善提示了恢復(fù)gp120 誘導(dǎo)的微生物群紊亂可改善gp120誘導(dǎo)的神經(jīng)認(rèn)知功能損傷。這一研究結(jié)果將為gp120誘導(dǎo)的HIV患者神經(jīng)認(rèn)知功能損傷提供新型治療思路。

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（編輯：林 萍）