摘要：目的 探究己糖激酶2（HK2）在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)，闡明其生物學(xué)功能及機(jī)制和對免疫微環(huán)境的影響。方法 使用生物信息學(xué)方法分析HK2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平、預(yù)后和對免疫微環(huán)境的影響。收集本院8例結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織及配對癌旁組織，利用免疫組化、Western blotting和RT-qPCR實驗驗證HK2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平。篩選出HK2表達(dá)量低的結(jié)直腸癌細(xì)胞系CT26 及HCT116 進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染過表達(dá)HK2，分為空白對照組和HK2 過表達(dá)組；使用HK2 抑制劑3-BP處理HK2 表達(dá)量高的結(jié)直腸癌細(xì)胞系MC38 及CACO2；使用JAK/STAT3 通路抑制劑處理結(jié)直腸癌細(xì)胞HK2 過表達(dá)組。采用CCK-8、平板克隆形成實驗、Transwell 和小鼠皮下荷瘤實驗探究HK2 對結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力的影響。通過Western blotting 檢測HK2 過表達(dá)對JAK/STAT信號通路蛋白表達(dá)的影響。采用MCPcounter和Timer分析HK2 表達(dá)與腫瘤免疫細(xì)胞浸潤水平的相關(guān)性，TCGA、GEO數(shù)據(jù)庫分析HK2表達(dá)與免疫檢查點的相關(guān)性。結(jié)果 癌癥公共數(shù)據(jù)庫顯示，HK2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織（Plt;0.001），并且高表達(dá)HK2 的結(jié)直腸癌患者預(yù)后更差（P=0.09）。免疫組化、Westernblotting 和RT-qPCR 結(jié)果顯示結(jié)直腸癌組織的HK2 表達(dá)水平高于癌旁組織（Plt;0.01）。相較于其他結(jié)直腸癌細(xì)胞，CT26 和HCT116 的HK2 表達(dá)水平最低（Plt;0.05），HK2 過表達(dá)組相較于空白對照組的HK2 表達(dá)水平上調(diào)（Plt;0.01），且過表達(dá)組細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力顯著提高（Plt;0.001）。HK2 被抑制后腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力明顯被抑制。HK2 可促進(jìn)JAK/STAT信號通路中STAT3 磷酸化蛋白的表達(dá)，使用JAK/STAT3 通路抑制劑能夠有效抑制由HK2 過表達(dá)介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的增強(qiáng)。Timer和MCP counter分析顯示HK2 表達(dá)與多種免疫細(xì)胞具有相關(guān)性，TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫分析顯示HK2 的表達(dá)水平與PDCD1 等免疫檢查點顯著正相關(guān)（Plt;0.05）。結(jié)論 HK2 在結(jié)直腸癌中表達(dá)上調(diào)，可能通過激活JAKSTAT信號通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境。

關(guān)鍵詞：結(jié)直腸癌；己糖激酶2；JAK-STAT信號通路；增殖、遷移和侵襲；免疫微環(huán)境

結(jié)直腸癌（CRC）作為全球發(fā)病率和死亡率均居高不下的惡性腫瘤之一，對人類健康的威脅不容小覷［1-3］。CRC已成為癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，其發(fā)病率在許多國家仍在上升［4-7］。盡管CRC的治療手段包括手術(shù)、放化療和靶向治療在過去的幾十年里取得了顯著進(jìn)展，但因腫瘤的高度異質(zhì)性及復(fù)雜的分子生物學(xué)背景，患者5年生存率仍然較低。CRC的高復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移性進(jìn)一步加劇了治療難度［8， 9］。因此，尋找與CRC發(fā)生發(fā)展相關(guān)的新型分子標(biāo)志物，并了解其作用機(jī)制，對提高CRC患者的預(yù)后具有重要意義。

近年來，隨著對腫瘤代謝異常研究的深入，代謝重編程作為腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要驅(qū)動力之一，逐漸成為研究熱點。Warburg效應(yīng)，即腫瘤細(xì)胞即使在有氧條件下也偏好通過糖酵解途徑生成能量，是腫瘤代謝的典型特征［10， 11］。在這一代謝途徑中，己糖激酶2（HK2）作為糖酵解途徑中第一個關(guān)鍵限速酶，主要存在于惡性或快速增殖的腫瘤中，較少見于正常組織中，在癌細(xì)胞重編程葡萄糖代謝中起關(guān)鍵作用 ［11-15］。這提示HK2可能在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。

HK2在結(jié)直腸癌中可能具有促進(jìn)腫瘤發(fā)展的潛在作用，但目前研究多集中于體外實驗，缺乏體內(nèi)實驗的數(shù)據(jù)支持及具體機(jī)制探究，并且大多數(shù)研究忽略了HK2與腫瘤免疫微環(huán)境的關(guān)系，這限制了對HK2 在腫瘤發(fā)展過程中的系統(tǒng)理解。本研究旨在探討HK2在CRC組織中的表達(dá)特點，并深入了解HK2與結(jié)直腸癌的預(yù)后、惡性生物學(xué)行為及其免疫微環(huán)境的關(guān)系，從而為結(jié)直腸癌的臨床治療提供新的理論和實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 組織標(biāo)本

人類結(jié)直腸癌組織樣本從南方醫(yī)院普通外科獲得，并經(jīng)南方醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（倫理批號：NFEC-2022-300），共8例配對的腫瘤組織與正常組織樣本。

1.2 主要試劑和儀器

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒（瑞真生物）；細(xì)胞培養(yǎng)基及胎牛血清（Gibco）；HK2過表達(dá)慢病毒（維真生物）；Western blotting 抗體：HK2抗體（abcam，1∶1000），β-actin抗體（abcam，1∶2000），羊抗兔蛋白二抗（abcam，1∶2000）；免疫組化抗體：HK2 抗體（abcam，1∶200），Ki-67 抗體（abcam，1∶200）；CCK-8 細(xì)胞增殖試劑盒（Biosharp）；流式抗體：anti-CD45（Biolegend），anti-CD8A （Biolegend） ； 3-BP （MedChemExpress） ；Ganoderic acid A（GA，MedChemExpress）。

1.3 方法

1.3.1 生物信息學(xué)方法 從UCSC 數(shù)據(jù)庫（https：//xenabrowser.net/）和GEO數(shù)據(jù)庫中獲取結(jié)直腸癌患者轉(zhuǎn)錄組學(xué)及臨床預(yù)后數(shù)據(jù)，對每個表達(dá)值進(jìn)行l(wèi)og2（X+0.001）變換分析。使用R包“l(fā)imma”分析HK2基因在結(jié)直腸癌和正常組織間的表達(dá)差異，使用R包“maxstat”計算結(jié)直腸癌中HK2 的最佳截斷值，根據(jù)此截斷值采用Kaplan-Meier生存曲線分析兩組患者的總體生存（OS）差異，并使用Log-rank檢驗比較兩組的生存曲線。

使用R包MCP Counter以及Timer方法，根據(jù)HK2基因表達(dá)評估結(jié)直腸癌中相關(guān)免疫細(xì)胞的浸潤評分；采用Pearson 相關(guān)性分析檢驗HK2 基因與免疫檢查點之間的相關(guān)性。

1.3.2 免疫組織化學(xué)方法 組織脫水后行石蠟包埋，2.5 μm切片，將石蠟切片組織放入65 ℃烤箱烤片1 h；隨后依次轉(zhuǎn)移至二甲苯以及梯度濃度酒精進(jìn)行脫蠟，復(fù)水：二甲苯（15 min，2 次）；100%酒精（10 min）；90%酒精（10 min）；70%酒精（10 min）；1×TBS緩沖液（5 min，2 次），高壓抗原修復(fù)；TBS漂洗，3%過氧化氫溶液室溫孵育30 min；TBS漂洗，4 ℃，過夜孵育一抗；TBS漂洗，滴加二抗，室溫孵育30 min；TBS漂洗后DAB顯色液顯色；蘇木素復(fù)染核；鹽酸酒精分化；梯度脫水后封片。

1.3.3 Western blotting實驗 向待檢測組織及細(xì)胞中加入適量蛋白裂解液使其充分裂解；使用BCA法檢測蛋白濃度，配置10% SDS-PAGE分離膠和5% SDS-PAGE的濃縮膠，將蛋白與5×SDS上樣緩沖液混合；100 ℃，金屬浴5 min。取20 μg 上樣，設(shè)定恒壓110 V，電泳結(jié)束后，將蛋白恒流轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，根據(jù)目標(biāo)蛋白的相對分子質(zhì)量設(shè)定相應(yīng)的時間；TBST漂洗后，加入5%脫脂奶粉封閉常溫1 h，TBST漂洗，加入一抗，4 ℃，過夜；TBST漂洗，滴加HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h；TBST漂洗，加入ECL，置于化學(xué)發(fā)光成像儀器內(nèi)現(xiàn)象。

1.3.4 RT-qPCR 待測的組織或者細(xì)胞加入RNA抽提試劑Trizol裂解，加入1/5體積的氯仿，震蕩后室溫靜置15 min；12 000 r/min，4 ℃，離心15 min，吸取上清液至新的去酶EP 管；加入等體積異丙醇，室溫靜置15 min，12 000 r/min，4 ℃，離心15 min，棄上清；加入1 mL無水乙醇，12 000 r/min，4 ℃，離心5 min，棄上清；室溫下晾干，加入適量DEPC水混勻于冰上放置，使用分光光度計測RNA濃度以及純度。RNA逆轉(zhuǎn)錄按PrimeScirpt逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara）說明書操作，Real-time PCR 按SYBR I PremixExTaqTM（Takara）試劑盒說明書操作，PCR反應(yīng)采用羅氏480Real-TimePCR系統(tǒng)。引物序列（5'-3'）由華大基因合成（表1）。

1.3.5 細(xì)胞培養(yǎng)和慢病毒轉(zhuǎn)染 鼠源性結(jié)直腸癌細(xì)胞（MC38、CT26）培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，人源性結(jié)直腸癌細(xì)胞（HCT116、RKO、CACO2、SW480）培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中；均在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

人/鼠源性HK2過表達(dá)慢病毒均由山東維真生物公司合成，按說明書對結(jié)直腸癌CT26和HCT116進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實驗分組為：HK2-NC和HK2-OE。通過RT-qPCR和Western blotting實驗驗證轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的過表達(dá)效率。

1.3.6 CCK-8 細(xì)胞增殖實驗 將對數(shù)生長期CRC細(xì)胞胰酶消化，PBS清洗2次，制備成單細(xì)胞懸液，計數(shù)后，將100 μL、1×103 /孔接種于96孔板中，置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。分別在第1、3、5 天加入10 μL的CCK-8試劑，培養(yǎng)2 h 后，使用酶聯(lián)免疫檢測儀測定吸光度A450 nm，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.3.7 平板克隆形成實驗 將對數(shù)生長期CRC細(xì)胞胰酶消化，PBS清洗2 次，制備成單細(xì)胞懸液，計數(shù)后，以500、750、1000/孔，2 mL體系的梯度密度接種六孔板中（依據(jù)CRC細(xì)胞生長情況判斷），每2 d換液1次。當(dāng)培養(yǎng)皿出現(xiàn)肉眼可見的克隆團(tuán)時（10～14 d），停止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)基，PBS輕柔清洗2次，每孔加入1 mL甲醇固定20 min。棄去固定液，加入1 mL/孔1%結(jié)晶紫染色30 min后流水緩慢沖洗多余染液，空氣干燥。

1.3.8 Transwell實驗 在Transwell小室中，上室加入無血清細(xì)胞懸液，下室加入含血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。細(xì)胞孵育24 h后，擦去未穿透膜的細(xì)胞，使用甲醇固定膜下側(cè)的細(xì)胞，并用結(jié)晶紫染色。最后通過顯微鏡觀察并計數(shù)穿膜細(xì)胞。其中遷移實驗通過讓細(xì)胞穿過不含基質(zhì)膠的帶孔膜（8 μm孔徑），評估細(xì)胞的運(yùn)動能力；而侵襲實驗則在膜上涂覆基質(zhì)膠，模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)。

1.3.9 異種移植瘤模型 CT26細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，消化成單細(xì)胞懸液，用無血清的培養(yǎng)基洗3 次，將細(xì)胞密度調(diào)整為1×107/mL。取4～6周齡、體質(zhì)量為18～22 g的Balb/c小鼠。每只小鼠大腿外側(cè)皮下注射100 μL腫瘤細(xì)胞懸液，5只/組；每隔1 d用游標(biāo)卡尺測量1次腫瘤體積，體積公式為V=L×W×H/2（V：體積；L：長；W：寬；H：高），繪制腫瘤生長曲線。處死小鼠后，分離腫瘤組織并置于10 %中性福爾馬林中固定。

1.3.10 流式細(xì)胞分析 取小鼠皮下腫瘤組織，剪碎后加入5 mL 消化液（含0.5 mg/mL Collagenase IV+0.1 mg/mL DNaseI+2% FBS 的1640 培養(yǎng)基），置于37 ℃搖床進(jìn)行消化（200 r/min，30 min）。用70 μm濾網(wǎng)過濾獲得單細(xì)胞懸液，4 ℃，400 g離心5 min，棄去上清。室溫條件下，用1 mL紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞1 min，再用5 mL含1% FBS PBS終止，4 ℃，400 g離心5 min。取細(xì)胞沉淀進(jìn)行流式抗體冰上30 min染色，流式緩沖液洗2遍后上機(jī)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，相關(guān)性分析采用Pearson法。Plt;0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HK2在結(jié)直腸癌的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系

TCGA聯(lián)合GTEx 數(shù)據(jù)庫分析顯示，在CRC組織中，HK2 的表達(dá)量高于正常組織（Plt;0.0001，圖1A），且高表達(dá)HK2的患者有預(yù)后更差的趨勢（圖1B）。

2.2 HK2在臨床樣本組織中的表達(dá)

免疫組化、Western blotting 和RT-qPCR結(jié)果均顯示，CRC 組織中HK2 表達(dá)水平明顯高于癌旁組織（Plt;0.01，圖2）。

2.3 CRC細(xì)胞株篩選和慢病毒轉(zhuǎn)染結(jié)果

檢測4 株人源性細(xì)胞株及2 株鼠源性細(xì)胞株HK2mRNA 的表達(dá)，人源性細(xì)胞中HK2 mRNA 表達(dá)從高到低分別是LOVO、HT29、SW480、HCT116 細(xì)胞（Plt;0.01，圖3B），而在鼠源性細(xì)胞中CT26 的HK2 mRNA表達(dá)低于MC38（Plt;0.05，圖3A）。因此選用HCT116細(xì)胞和CT26細(xì)胞作為過表達(dá)轉(zhuǎn)染載體。

轉(zhuǎn)染后，CT26細(xì)胞和HCT116細(xì)胞HK2過表達(dá)組中蛋白表達(dá)量（圖3C、D）和mRNA 水平（Plt;0.01，Plt;0.0001，圖3E、F）均高于NC組，過表達(dá)組細(xì)胞株構(gòu)建成功。

2.4 HK2過表達(dá)對體外CRC細(xì)胞增殖能力的影響

CCK-8 和平板克隆形成實驗均顯示，HK2 過表達(dá)組的CT26 和HCT116 細(xì)胞的增殖能力高于對照組（Plt;0.001，Plt;0.0001，圖4）。

2.5 HK2 過表達(dá)對體外CRC細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

Transwell 結(jié)果顯示，HK2 過表達(dá)組的CT26（Plt;0.01，圖5A、B）和HCT116 細(xì)胞（Plt;0.01，圖5C、D）的遷移能力和侵襲能力高于對照組。

2.6 HK2 功能抑制對體外CRC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響

使用3-BP 抑制腫瘤細(xì)胞HK2 功能后，采用Transwell 法分析HK2 對CRC 細(xì)胞遷移和侵襲的影響，結(jié)果顯示3-BP 處理組的MC38（Plt;0.001，Plt;0.01，圖6A、B）和CACO2細(xì)胞（Plt;0.01，圖6C、D）的遷移數(shù)量和侵襲數(shù)量低于對照組。CCK-8 結(jié)果顯示，3-BP處理組的MC38和CACO2細(xì)胞的增殖能力明顯低于對照組（Plt;0.0001，圖6E、F）。

2.7 HK2對體內(nèi)鼠源性CRC細(xì)胞增殖能力的影響

Balb/c 小鼠皮下荷瘤實驗（CT26）結(jié)果顯示，HK2過表達(dá)可明顯促進(jìn)皮下腫瘤的生長速度（Plt;0.001，圖7A、B），HK2過表達(dá)組皮下瘤重量（Plt;0.01，圖7C）和體積（Plt;0.01，圖7D）大于對照組；免疫組化結(jié)果顯示，HK2 過表達(dá)組腫瘤細(xì)胞的Ki-67 增殖指數(shù)高于對照組（圖7E）；流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，HK2 過表達(dá)組瘤內(nèi)CD8+ T細(xì)胞數(shù)量下降（Plt;0.01，圖7F、G）。

2.8 HK2對體內(nèi)人源性CRC細(xì)胞增殖能力的影響

Balb/c-nu小鼠皮下荷瘤實驗（HCT116）結(jié)果顯示，HK2過表達(dá)可明顯促進(jìn)皮下腫瘤的生長速度（圖8A），HK2過表達(dá)組皮下瘤重量和體積大于對照組（Plt;0.05，圖8B、C）。

2.9 HK2調(diào)控JAK/STAT信號通路

GSEA分析證實，在TCGA的CRC數(shù)據(jù)中具有高HK2 表達(dá)的CRC患者中，JAK/STAT信號通路顯著富集（圖9A）；Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，CT26 與HCT116 細(xì)胞HK2 過表達(dá)組JAK/STAT信號通路中STAT3磷酸化水平均增加（Plt;0.0001，Plt;0.001，圖9B～E）。

2.10 HK2 通過JAK/STAT 影響結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為

在過表達(dá)HK2 的同時給予JAK/STAT3 通路抑制劑Ganoderic acid A（GA）處理，將實驗分為NC、OE和OE+GA組。Transwell實驗顯示，HK2過表達(dá)可以促進(jìn)CT26 和HC116 細(xì)胞的遷移和侵襲能力（Plt;0.05，圖10A、B、D）。但經(jīng)GA處理抑制JAK/STAT3 通路后過表達(dá)組CT26和HCT116細(xì)胞遷移和侵襲能力受到抑制（Plt;0.05，圖10A～D）。CCK-8 驗證細(xì)胞增殖能力可得到相同趨勢（圖10E、F）。

2.11 HK2表達(dá)與腫瘤免疫細(xì)胞浸潤水平的相關(guān)性分析

MCPcounter和Timer結(jié)果均顯示HK2的表達(dá)與浸潤性免疫細(xì)胞顯著相關(guān)。其中MCPcounter分析結(jié)果顯示T細(xì)胞、B細(xì)胞、髓樣樹突狀細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和中性粒細(xì)胞與HK2的表達(dá)呈正相關(guān)。TIMER分析結(jié)果顯示，B細(xì)胞、CD8T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、DC細(xì)胞和中性粒細(xì)胞與HK2的表達(dá)呈正相關(guān)（圖11）。

2.12 HK2表達(dá)與免疫檢查點的相關(guān)性

HK2 與免疫檢查點相關(guān)性分析結(jié)果顯示，HK2的表達(dá)與PDCD1 等免疫檢查點的表達(dá)呈正相關(guān)（Plt;0.001，圖12A）。GSE147571 數(shù)據(jù)庫分析顯示，HK2 表達(dá)與免疫檢查點HAVCR2正相關(guān)，并和T細(xì)胞殺傷指標(biāo)IFN-γ負(fù)相關(guān)（Plt;0.0001，圖12B）。同樣在GSE104645數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)HK2 表達(dá)與免疫檢查點HAVCR2 正相關(guān)（Plt;0.0001，圖12B）。

3 討論

本研究旨在探討HK2基因在結(jié)直腸癌中的表達(dá)特征及其作用機(jī)制，通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，HK2 在結(jié)直腸癌組織中呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，且其高表達(dá)與患者不良預(yù)后密切相關(guān)。在體外細(xì)胞實驗及體內(nèi)動物模型中，敲低HK2 基因顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116和CT26 的增殖、侵襲和遷移能力，并且調(diào)控了腫瘤免疫微環(huán)境。進(jìn)一步研究表明，HK2 的敲低可能通過影響JAK/STAT 信號通路，進(jìn)而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。

HK2在調(diào)控細(xì)胞代謝和促進(jìn)細(xì)胞增殖方面發(fā)揮著重要作用，并且可能與腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)。近年來，越來越多的研究證實了HK2 在多種腫瘤中的關(guān)鍵作用，因此，HK2有望成為一種潛在的腫瘤生物標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)HK2在前列腺癌中通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，并保護(hù)細(xì)胞免受化療引發(fā)的凋亡［16］。HK2在肺癌中高表達(dá)，增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的干性特性，進(jìn)而促進(jìn)了小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖［17］。HK2在肝癌組織中上調(diào)，抑制了肝癌細(xì)胞的凋亡并促進(jìn)其增殖，從而增強(qiáng)了腫瘤對放療的抵抗力［18］。然而，HK2在結(jié)直腸癌中的具體作用及其潛在機(jī)制尚不清楚。尚無研究深入評估HK2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)特征、預(yù)后意義、潛在機(jī)制及其對腫瘤免疫微環(huán)境的影響。

本文首先通過TCGA、GTEx 和GEO 數(shù)據(jù)集對HK2的表達(dá)水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)HK2在結(jié)直腸癌的表達(dá)水平高于對照癌旁組織，并且其表達(dá)水平與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。通過免疫組化、RT-qPCR和Western boltting對8 例CRC患者腫瘤及癌旁組織的分析進(jìn)一步驗證HK2在腫瘤中的高表達(dá)水平特點。因此我們提出，HK2可能是CRC不良預(yù)后的重要預(yù)測指標(biāo)。

腫瘤細(xì)胞能夠通過血管和淋巴管進(jìn)行遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，或通過直接侵入鄰近的組織結(jié)構(gòu)而擴(kuò)散至相鄰的部位，這是腫瘤惡性進(jìn)展的重要特征之一，也往往是導(dǎo)致多種癌癥患者死亡的主要原因［19， 20］。在臨床實踐中，由于結(jié)直腸癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的遷移和侵襲性，因此患者常常在疾病的早期階段便發(fā)生肝臟等重要器官的轉(zhuǎn)移。這種早期的轉(zhuǎn)移增加了治療難度，導(dǎo)致術(shù)后5 年生存率大幅降低，嚴(yán)重影響患者長期預(yù)后和生存質(zhì)量［21-23］。因此，如何有效控制腫瘤的轉(zhuǎn)移成為改善結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)鍵挑戰(zhàn)之一。本研究首先在體外通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方式，分別獲得HK2 過表達(dá)和空白對照CRC細(xì)胞株，Transwell 實驗表明，HK2 過表達(dá)組腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng)。CCK-8、平板克隆形成實驗及體內(nèi)皮下荷瘤實驗均證實，與對照組相比，HK2 過表達(dá)組的腸癌細(xì)胞增殖能力在體內(nèi)體外均顯著提升。這表明HK2 與結(jié)直腸癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。

JAK-STAT信號通路是細(xì)胞增殖、分化、凋亡和免疫調(diào)控的關(guān)鍵信號通路之一，該通路在多種腫瘤中存在異常激活，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展［24-27］。已有研究表明p-STAT3信號通路的激活可導(dǎo)致體內(nèi)外CRC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移增強(qiáng)［28， 29］。在TCGA數(shù)據(jù)庫中，HK2高低表達(dá)組間的KEGG分析顯示，JAK-STAT 信號通路顯著富集。Western blotting 分析顯示，HK2 過表達(dá)可提高CRC 細(xì)胞中p-STAT3 的表達(dá)水平，與先前報道一致。隨后使用JAK/STAT3 信號通路抑制劑處理腫瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其可逆轉(zhuǎn)HK2 過表達(dá)所介導(dǎo)的促增殖、遷移和侵襲作用。

在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞高表達(dá)HK2，增加葡萄糖消耗，導(dǎo)致代謝競爭，使T細(xì)胞功能受限，免疫抑制加劇。此外，HK2與炎癥信號通路（如NF-κB）相關(guān)，參與免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)；作為糖酵解的關(guān)鍵酶，HK2在免疫細(xì)胞功能調(diào)控、代謝重編程以及腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制中起著重要作用，這些研究都表明，HK2 與免疫微環(huán)境之間存在緊密聯(lián)系［30-32］。本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)HK2 的腫瘤免疫微環(huán)境中CD8+ T細(xì)胞數(shù)量明顯減少，此外通過生物信息學(xué)分析揭示了HK2 與多種免疫細(xì)胞浸潤和PDCD1 等免疫檢查點的表達(dá)具有相關(guān)性，這些均提示HK2 亦可能通過調(diào)控腫瘤免疫微環(huán)境在CRC中發(fā)揮作用。

盡管本研究揭示了HK2 在CRC發(fā)展中的重要作用及其可能的分子機(jī)制，但仍存在一些局限性。首先，本研究主要集中在HK2對CRC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，而對其在腫瘤其他生物學(xué)功能中的作用未深入探討。其次，本研究通過生物信息學(xué)分析揭示了HK2與免疫微環(huán)境的相關(guān)性，但這些結(jié)果仍需進(jìn)一步實驗驗證，特別是在體內(nèi)實驗?zāi)Ｐ椭械尿炞C。同時，應(yīng)探索HK2作為CRC治療靶點的可能性，研究其在臨床應(yīng)用中的潛在價值。

綜上所述，HK2基因在結(jié)直腸組織中高表達(dá)，與腫瘤預(yù)后密切相關(guān)。HK2可能通過激活JAK-STAT信號通路，增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。此外，HK2還與腫瘤浸潤免疫細(xì)胞及免疫檢查點有緊密關(guān)聯(lián)。因此，HK2有望成為結(jié)直腸癌患者的潛在治療靶點。

參考文獻(xiàn)：

[1] Kim S， Koh J， Song SG， et al. High tumor hexokinase-2 expression promotes a pro-tumorigenic immune microenvironment by modulating CD8+/regulatory T-cell infiltration[J]. BMC Cancer，2022， 22（1）： 1120.

[2] Ciscato F， Ferrone L， Masgras I， et al. Hexokinase 2 in cancer： a Prima donna playing multiple characters[J]. Int J Mol Sci， 2021， 22（9）： 4716.

[3] Yu Q， Wang Y， Dong L， et al. Regulations of glycolytic activities on macrophages functions in tumor and infectious inflammation[J]. Front Cell Infect Microbiol， 2020， 10： 287.

[4] Sung H， Ferlay J， Siegel RL， et al. Global cancer statistics 2020：GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]. CA Cancer J Clin， 2021， 71（3）： 209-49.

[5] Li Y， Shen Z， Chai Z， et al. Targeting MS4A4A on tumour-associated macrophages restores CD8+ T-cell-mediated antitumour immunity[J]. Gut， 2023， 72（12）： 2307-20.

[6] Zou Y， Wang S， Zhang H， et al. The triangular relationship between traditional Chinese medicines， intestinal flora， and colorectal cancer[J]. Med Res Rev， 2024， 44（2）： 539-67.

[7] Zheng RS， Zhang SW， Zeng HM， et al. Cancer incidence and mortality in China， 2016[J]. J Natl Cancer Cent， 2022， 2（1）： 1-9.

[8] Rumpold H， Niedersü? -Beke D， Heiler C， et al. Prediction of mortality in metastatic colorectal cancer in a real-life population： a multicenter explorative analysis[J]. BMC Cancer， 2020， 20（1）：1149.

[9] Zygowiec J. Virtually grounded[J]. JAMA， 2023， 329（12）： 977.

[10]Zhu J， Cai H， Xu C， et al. Acidity-responsive nanoreactors destructed “Warburg effect” for toxic-acidosis and starvation synergistic therapy[J]. Small， 2023， 19（46）： e2304058.

[11] Zhou Y， Guo Y， Tam KY. Targeting glucose metabolism to develop anticancer treatments and therapeutic patents[J]. Expert Opin Ther Pat， 2022， 32（4）： 441-53.

[12]DeWaal D， Nogueira V， Terry AR， et al. Author Correction：Hexokinase-2 depletion inhibits glycolysis and induces oxidative phosphorylation in hepatocellular carcinoma and sensitizes to metformin[J]. Nat Commun， 2018， 9： 2539.

[13]Zhuang W， Liu X， Liu G， et al. Purinergic receptor P2Y12 boosts autoimmune hepatitis through hexokinase 2-dependent glycolysis in T cells[J]. Int J Biol Sci， 2023， 19（11）： 3576-94.

[14]Zhong J， Lu S， Jia X， et al. Role of endoplasmic reticulum stress in apoptosis induced by HK2 inhibitor and its potential as a new drug combination strategy[J]. Cell Stress Chaperones， 2022， 27（3）：273-83.

[15]Zhang Y， Zhu JH， Zhou Y， et al. Activation of HIF-1α C-terminal transactivation domain promotes tubulointerstitial fibrosis through hexokinase 2-mediated metabolic reprogramming[J]. Cell Signal，2024， 127： 111531.

[16]Shangguan X， He J， Ma Z， et al. SUMOylation controls the binding of hexokinase 2 to mitochondria and protects against prostate cancer tumorigenesis[J]. Nat Commun， 2021， 12（1）： 1812.

[17]Wang J， Shao F， Yang Y， et al. A non-metabolic function of hexokinase 2 in small cell lung cancer： promotes cancer cell stemness by increasing USP11-mediated CD133 stability[J].Cancer Commun： Lond， 2022， 42（10）： 1008-27.

[18]Zheng Y， Zhan Y， Zhang Y， et al. Hexokinase 2 confers radio-resistance in hepatocellular carcinoma by promoting autophagydependent degradation of AIMP2[J]. Cell Death Dis， 2023， 14（8）： 488.

[19]Esposito M， Ganesan S， Kang Y. Emerging strategies for treating metastasis[J]. Nat Cancer， 2021， 2（3）： 258-70.

[20]Sleeboom JJF， van Tienderen GS， Schenke-Layland K， et al. The extracellular matrix as hallmark of cancer and metastasis： From biomechanics to therapeutic targets[J]. Sci Transl Med， 2024， 16（728）： eadg3840.

[21]Tian Y， Wang Y， Wen N， et al. Prognostic factors associated with early recurrence following liver resection for colorectal liver metastases： a systematic review and meta-analysis[J]. BMC Cancer，2024， 24（1）： 426.

[22]Liu QL， Zhou H， Zhou ZG， et al. Colorectal cancer liver metastasis：genomic evolution and crosstalk with the liver microenvironment[J]. Cancer Metastasis Rev， 2023， 42（2）： 575-87.

[23]Fang Q， Ni CD， Cai Z， et al. Prognostic significance of hsa_circ_0048122 to predict liver metastasis in early-stage colorectal cancer[J]. Clinical Laboratory Analysis， 2022， 36（8）： e24577.

[24] Johnson DE， O’Keefe RA， Grandis JR. Targeting the IL-6/JAK/STAT3 signalling axis in cancer[J]. Nat Rev Clin Oncol， 2018， 15（4）： 234-48.

[25]Zhou QL， Ren Q， Jiao LH， et al. The potential roles of JAK/STAT signaling in the progression of osteoarthritis[J]. Front Endocrinol，2022， 13： 1069057.

[26]Zalpoor H， Nabi-Afjadi M， Forghaniesfidvajani R， et al. Quercetin as a JAK-STAT inhibitor： a potential role in solid tumors and neurodegenerative diseases[J]. Cell Mol Biol Lett， 2022， 27（1）： 60.

[27]Xue C， Yao Q， Gu X， et al. Evolving cognition of the JAK-STAT signaling pathway： autoimmune disorders and cancer[J]. Signal Transduct Target Ther， 2023， 8（1）： 204.

[28]Sun YC， Gong WP， Zhang S. METTL3 promotes colorectal cancer progression through activating JAK1/STAT3 signaling pathway[J].Cell Death Dis， 2023， 14（11）： 765.

[29]Wang J， Zhang Y， Song H， et al. The circular RNA circSPARC enhances the migration and proliferation of colorectal cancer by regulating the JAK/STAT pathway[J]. Mol Cancer， 2021， 20（1）： 81.

[30]Guo D， Tong YY， Jiang XM， et al. Aerobic glycolysis promotes tumor immune evasion by hexokinase2-mediated phosphorylation of IκBα[J]. Cell Metab， 2022， 34（9）： 1312-24.e6.

[31]Gu MD， Zhou XF， Sohn JH， et al. NF-κB-inducing kinase maintains T cell metabolic fitness in antitumor immunity[J]. Nat Immunol，2021， 22（2）： 193-204.

[32]Cao YN， Yi YN， Han CX， et al. NF-κB signaling pathway in tumor microenvironment[J]. Front Immunol， 2024， 15： 1476030.

（編輯：林 萍）