摘要：目的 探究產(chǎn)黑普雷沃氏菌（Pn）聯(lián)合結扎誘導的牙周炎對小鼠認知功能的影響。方法 將24只C57BL/6J小鼠隨機分為3組：空白對照組（CON）、結扎組（P）、結扎+菌組（P+Pn）。P組絲線結扎誘導實驗性牙周炎，P+Pn組絲線結扎并涂布產(chǎn)黑普雷沃氏菌（Pn）誘導實驗性牙周炎。結扎、涂菌6 周后，通過Micro CT、組織學觀察牙槽骨吸收；通過曠場測試、新物體識別測試、Morris水迷宮測試評價其學習記憶能力改變；組織學觀察小鼠大腦海馬組織學變化。評價產(chǎn)黑普雷沃氏菌（Pn）致牙周炎及對小鼠認知功能的影響。結果 牙周結扎6周，Micro CT顯示小鼠牙槽骨水平吸收、根分叉暴露，組織學觀察見小鼠牙周結合上皮根方退縮，上皮釘突增生、淋巴細胞浸潤，P+Pn較P組變化更明顯，牙槽骨高度均較CON組降低（Plt;0.05）。曠場測試的運動總路程、中央?yún)^(qū)時間占比、路程占比及新物體識別測試的路程占比、時間占比、次數(shù)占比均較CON組下降（Plt;0.05）；Morris水迷宮測試各項指標均下降（Plt;0.05），且P+Pn 較P組下降更為明顯（Plt;0.05）；組織學見小鼠大腦海馬區(qū)神經(jīng)元胞漿變性壞死、深染、核固縮、核空泡等，Nissl小體及正常神經(jīng)元數(shù)量明顯減少（Plt;0.05）。結論 產(chǎn)黑普雷沃氏菌（Pn）加重了牙周炎的牙槽骨破壞，加速了小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細胞壞死及形態(tài)異常，并降低了小鼠記憶、學習等認知功能。

關鍵詞：產(chǎn)黑普雷沃氏菌；口腔細菌；牙周炎；認知障礙；行為學

認知障礙是指由不同原因導致的一個或多個認知功能受損，從而造成大腦高級智力加工過程出現(xiàn)異常的情況，認知功能包括記憶、語言、視空間、執(zhí)行、計算和理解判斷等方面。根據(jù)損害程度不同，包括從輕度認知功能損害（MCI）到癡呆［1］。

牙周炎被認為是認知障礙發(fā)展的最常見危險因素之一［2， 3］，能夠引起全身低炎癥狀態(tài)，影響全身健康，增加疾病易感性或導致已有全身性疾病的發(fā)展（包括糖尿病、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病等）［4-7］。主要原因是牙周細菌及其毒素通過血源性、口-消化道等途徑傳播，導致全身低度炎癥［8］。且能通過血腦屏障導致神經(jīng)系統(tǒng)受損、退變，引發(fā)認知功能障礙［7］。

近年來由于高通量測序技術的進步，已經(jīng)產(chǎn)生了大量關于口腔微生物組與牙周病之間關系的數(shù)據(jù)。并從齦下牙菌斑中分離出伴放線放線桿菌、牙齦卟啉單胞菌、中間普雷沃菌、產(chǎn)黑普雷沃氏菌（Pn菌）和福賽斯坦納菌［9］。其中紅色（牙齦卟啉單胞菌、齒狀密螺旋體、連翹坦納菌）和橙色復合物種（梭桿菌、普雷沃氏菌和彎曲桿菌物種）與牙周炎發(fā)生發(fā)展密切相關，有研究中從牙周炎患者齦下菌斑中分離出兩種普雷沃氏菌，包括產(chǎn)黑普雷沃氏菌和頰普雷沃氏菌［10］，它們同為橙色復合物種成員，是齦下斑塊中最常見的菌種之一［11］。在口腔中，該菌屬與慢性牙周炎、牙髓感染以及牙齒或牙周源性膿腫有關，是齲齒和牙周炎等口腔疾病的主要病原體［12， 13］。另有研究表明阿爾茲海默癥與牙周病原菌產(chǎn)黑普雷沃氏菌相關，并且發(fā)現(xiàn)阿爾茲海默癥的死亡風險會隨著產(chǎn)黑普雷沃氏菌的IgG負載增高而增高［14］，但其確定的關系和具體機制還有待進一步研究證實。目前尚未見有關Pn菌對體內認知功能的影響及其潛在機制的研究。本研究擬探究牙周炎密切相關細菌產(chǎn)黑普雷沃氏菌對小鼠認知功能的影響，為認知障礙的早期預防與治療提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選取24 只C57BL/6J 小鼠，7～8 周齡雄性，體質量20 g左右，于北京藥康生物科技有限公司購買［許可證號：SCXK（京）2023-0008］。飼養(yǎng)條件，采用12 h/12 h明暗交替照明，飼養(yǎng)溫度控制在22±2 ℃，相對濕度50%±10%，給予小鼠自由飲食。在實驗開始前1 周適應飼養(yǎng)。本課題已通過軍事醫(yī)學研究院實驗動物倫理委員會批準（倫理批號：IACUC-DWZX-2022-610）。

1.2 實驗儀器與系統(tǒng)

戊巴比妥鈉（北京化學試劑公司）；架空視頻系統(tǒng)、視頻跟蹤軟件、曠場試驗箱、新物體試驗箱、水迷宮試驗池（上海欣軟信息科技有限公司）。

1.3 Pn的培養(yǎng)

Pn 凍干粉（BNCC369693），在胰酪胨大豆羊血瓊脂即用型平板［TSA+5%脫纖維羊血］中復蘇培養(yǎng)。隨后接種于布氏肉湯培養(yǎng)基中在厭氧條件下培養(yǎng)7 d（37 ℃，55%濕度）。然后離心收集Pn菌（13 000 g，5 min），將沉淀的細胞重懸于PBS中進行實驗。

1.4 動物實驗分組及造模

將24只C57BL/6J小鼠隨機分為對照組（CON），結扎組（P）、結扎+菌組（P+Pn），8只/組。造模持續(xù)6周，實驗流程（圖1）。

1.4.1 小鼠實驗性牙周炎模型的建立 除正常組（CON）小鼠外，其余小鼠使用腹膜內注射戊巴比妥鈉（0.04 g/mL，Sigma）麻醉，用5-0絲線結扎左側上頜第一磨牙牙頸部。每周檢查絲線的結扎情況，如發(fā)現(xiàn)絲線脫落及時重新結扎。結扎造模持續(xù)6周，待行為學實驗結束后進行上頜骨取材，拍攝Micro-CT，觀察牙槽骨吸收情況。

1.4.2 局部涂菌 CON組用100 μL PBS+配置2.5%羧甲基纖維素涂抹小鼠牙齦邊緣；P組結扎造模并用100 μLPBS+配置2.5%羧甲基纖維素涂抹小鼠牙齦邊緣（結扎絲線）；P+Pn 組在結扎后，用100 μL PBS +配置的含2.5%羧甲基纖維素和109 CFU活菌。結扎線在整個實驗期間都保持在原位。禁食禁水1 h，2次/周；在實驗開始當天開始記錄小鼠體質量，1次/周，觀察其變化。連續(xù)涂菌與結扎造模同時進行，持續(xù)6 周，待行為學實驗結束后處死取材。

1.5 行為學實驗

1.5.1 曠場測試（OFT） 將小鼠置于裝置的右上角并進行5 min的自由探索。中心區(qū)域被設置為距離墻壁10 cm的正方形。采用架空視頻系統(tǒng)記錄運動軌跡，系統(tǒng)識別動物的頭部、重心及尾巴，自動跟蹤目標小鼠的運動軌跡，直接生成活動軌跡圖。計算中心區(qū)距離、時間與總距離的百分比。每次測試后，使用75%酒精擦拭清潔箱底及側面，清理設備中的小鼠排泄物和氣味，待酒精氣味完全揮發(fā)后，再放下一只小鼠進行實驗。

1.5.2 新物體識別測試（NOR） 在適應階段（第1 天），每只小鼠在沒有任何物體的情況下單獨留在裝置中30 min以適應環(huán)境。在訓練階段（第2天），將兩個相同的物體放置在距離墻壁10 cm的設備的相對角落。每只小鼠被允許探索兩個相同的物體10 min。在測試階段（第3 天），兩個物體中的一個被換成了一個新的物體，它在顏色和形狀上都與前一個物體不同。每只小鼠被允許探索兩個不同的物體10 min。小鼠的鼻子指向小于2 cm的物體并探索它（即與物體互動或嗅探）被視為對物體的探索。視頻跟蹤軟件記錄了探索物體所花費的時間、次數(shù)、行進路程。判別指數(shù)根據(jù)以下公式計算：判別指數(shù)（在新物體上花費的時間/在兩個探索物體上花費的總時間）×100%。每次測試后，使用75%酒精擦拭清潔物體、箱底及側面，清理設備中的尿液和糞便，待酒精完全揮發(fā)后，下一只小鼠進行實驗。

1.5.3 Morris 水迷宮測試（MWM） MWM設備由一個直徑為120 cm，深度為50 cm的圓形水池組成。該池劃分為4個相等區(qū)域的象限，在其中一個象限中心放置一個圓形逃生平臺（直徑9 cm），位于水面下約1 cm，實驗于安靜且較暗光線的環(huán)境下進行，水溫控制在與室溫相當?shù)?2±1 ℃。上方安裝攝像頭，采用視頻分析系統(tǒng)監(jiān)測和記錄小鼠的游泳活動。

小鼠通過平臺位置的不斷學習記憶，最終以較短的時間游至放置于水池中的平臺。實驗共6 d完成，前5 d為平臺獲取和平臺隱藏實驗。水池共分為4個象限，將站臺固定放置于某一象限中央位置，實驗者將小鼠放入其中一個象限，使其在水中活動60 s，記錄其尋找到平臺位置所需要的時間；若60 s內不能自發(fā)找到站臺位置，實驗者將小鼠引導至平臺處，使其在平臺上停留20 s。每天進行3次實驗，分別從不同象限入水，每次實驗間隔30 min，共持續(xù)5 d。第6 天為空間探索實驗，撤去水池中的平臺，將小鼠從原平臺對側象限放入水中，記錄小鼠在水池中的游泳軌跡、找到平臺的潛伏期、穿越原平臺位置的次數(shù)以及在目標象限的活動時間。

1.6 樣本收集

行為學實驗結束后，小鼠麻醉致死，取材，收集小鼠上頜骨，固定于4%多聚甲醛溶液中，用Micro-CT檢測頜骨吸收情況；其余4只保留牙齦組織，固定于4%多聚甲醛溶液中，用于HE切片染色。同時收集小鼠腦組織，迅速分離取出腦組織后，固定在4%多聚甲醛溶液中用于后續(xù)組織病理學檢查，HE和尼氏切片染色。

1.7 Micro-CT觀察骨吸收情況

每組小鼠隨機選取4 塊上頜骨，用于Micro-CT掃描，觀察骨吸收情況。待測小鼠頜骨組織樣本擦干固定液，用塑料薄膜包裹。用小動物Micro-CT（Bruker）掃描影像系統(tǒng)上機進行樣本掃描，掃描分辨率9 μm，掃描電壓50 kV， 電流400 μA，曝光時間1300 ms。采用NRecon 軟件（版本1.6.10.1）進行圖像重建， CTvox 軟件（3.0.0.0）對牙周骨組織進行三維重建，測量上頜第二磨牙釉牙骨質界（CEJ）至牙槽嵴頂（ABC）的距離，記為CEJ-ABC。隨后采用 SkyscanCT-Analyzer（CTAn，1.15.2.2）軟件獲取2D虛擬斷層圖像進行圖像重建，手繪第一磨牙周圍牙槽骨設為ROI區(qū)域進行微結構參數(shù)分析，所有標本的分析范圍保持一致。對感興趣區(qū)域（ROI）內的骨組織進行3D分析和量化。

1.8 HE、Masson及尼氏染色檢測小鼠頜骨與腦組織病理變化

骨組織使用 15%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液在室溫下脫鈣，脫鈣完成后，將固定的腦組織與脫鈣的的骨組織按順序置于 70%～100%梯度酒精中脫水，熔融蠟缸中浸蠟包埋，制備3 μm石蠟切片備用。分別進行HE和尼氏染色，再次脫水密封。顯微鏡鏡檢，圖像采集分析（Nikon）。

1.9 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism10.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析及圖形繪制。計量資料以均數(shù)±標準差表示。Morris水迷宮逃避潛伏期釆用雙因素重復測量方差分析，曠場測試、新物體識別測試、空間探索實驗中的穿越平臺次數(shù)進行正態(tài)分析和方差齊性檢驗，若呈正態(tài)分布且方差齊，則運用單因素方差分析，并以LSD法進行組間的兩兩比較，否則運用非參數(shù)檢驗。當Plt;0.05 認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠牙周炎模型建立及驗證

2.1.1 組織學HE染色結果 CON組牙齦上皮完整，牙槽骨未見吸收破壞及炎細胞浸潤，表現(xiàn)為正常牙周組織，P組第一，二磨牙之間牙槽骨吸收破壞，牙周組織炎癥細胞浸潤，結合上皮向根方退縮，P+Pn組小鼠牙周組織炎癥細胞更多，牙槽骨吸收最嚴重，結合上皮向根方進一步退縮（圖2）。

2.1.2 Micro CT結果 Micro-CT三維重建結果顯示：與未放置絲線的對照組（CON）小鼠相比，牙周炎組（P）小鼠第一磨牙、第二磨牙之間牙槽骨發(fā)生明顯吸收，牙周炎+P菌組（P+Pn）小鼠吸收最嚴重（圖3）。定量比較兩組間上頜第一磨牙釉牙骨質界至牙槽嵴頂?shù)木嚯x（CEJABC）距離。牙周炎組（P）小鼠骨高度下降，P+Pn組小鼠骨高度較CON組下降（Plt;0.01），牙槽骨破壞嚴重。

2.1.3 小鼠體質量變化 P組和P+Pn組小鼠牙周結扎造模后體質量開始明顯下降，第15天后開始緩慢上升，與CON組相比，P組和P+Pn 組體質量明顯下降，P+Pn 組與CON組存在差異（Plt;0.05，圖4）。

2.2 實驗性牙周炎對小鼠行為學影響

2.2.1 Pn加劇牙周炎小鼠抗焦慮和運動能力 在中央?yún)^(qū)的路程占比、時間占比，均是CON組最高，P組降低，P+Pn 組占比最低，且各組之間存在差異（Plt;0.01）。小鼠在曠場實驗中運動總路程顯示，CON組距離最長，P組有所下降，P+Pn 運動距離最短，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05，圖5A、B）。

2.2.2 Pn加劇牙周炎小鼠的海馬認知能力損傷 P 組相較于CON 組，與新物體接觸的路程占比有所降低（Plt;0.05），P+Pn組比P組降低（Plt;0.05），與新物體接觸的時間及次數(shù)占比，P組明顯低于CON組（Plt;0.05），且P+Pn組低于P組，但差異無統(tǒng)計學意義（圖5C、D）。

2.2.3 Pn 加劇牙周炎小鼠學習記憶以及空間認知能力訓練第1天，3組小鼠的潛伏期無明顯差異；2～5 d，各組小鼠的平均逃避潛伏期均呈縮短趨勢。3組小鼠中，P+Pn組逃避潛伏期最長，CON組最短（Plt;0.0001）。與對照組CON相比，P組小鼠表現(xiàn)出更長的潛伏期（Plt;0.01）。6 d空間探索實驗顯示，P+Pn組穿越平臺的次數(shù)最少，CON組次數(shù)最多（Plt;0.05，圖5F）。與對照組CON相比，P組穿越平臺的次數(shù)減少（Plt;0.05）。在目標象限的活動時間和路程占比，均是CON組占比最高，P組降低（Plt;0.05），P+Pn組最低，但差異無統(tǒng)計學意義（圖5E、G）。

2.3 實驗性牙周炎對小鼠海馬影響

2.3.1 大腦組織學切片HE 染色結果 HE 染色結果顯示：牙周炎6 周，CON組海馬區(qū)神經(jīng)元結構完整，核仁清晰。P組小鼠海馬 CA3 區(qū)神經(jīng)元出現(xiàn)結構破壞，部分細胞出現(xiàn)深染、核固縮、核空泡等現(xiàn)象（圖6A），神經(jīng)元細胞數(shù)量較CON組下降（Plt;0.05）；P+Pn 組則神經(jīng)元細胞結構破壞更加嚴重，正常神經(jīng)元數(shù)量較P 組降低（Plt;0.05）。

2.3.2 大腦尼氏染色切片 與CON組相比，P 組、P+Pn組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元結構破壞，Nissl小體及神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，出現(xiàn)細胞核固縮、核空泡，P+Pn組變性的神經(jīng)元更多，破壞更嚴重（圖6B）。

3 討論

牙周炎作為一種慢性炎癥性疾病，與全身多種疾病發(fā)生和進展密切相關。已經(jīng)有大量研究表明牙周炎及其相關唾液菌群與認知障礙密切相關［5， 15， 16］。有研究報道Pn是牙周炎的主要病原體，并且與阿爾茲海默癥相關［14］，但并未進行實驗驗證。本研究通過Pn 結合牙齦絲線結扎法建立了小鼠牙周炎模型，發(fā)現(xiàn)Pn加重了牙周炎的破壞，同時也加重了小鼠記憶、學習等認知功能的損害，這表明Pn菌可能與認知障礙發(fā)生發(fā)展有關。

牙周炎相關口腔細菌Pn菌如何通過牙周炎誘導神經(jīng)炎癥，本研究采用牙齦絲線結扎聯(lián)合牙齦致病菌感染的方法構建牙周炎模型，首先用5～0絲線結扎上頜第一磨牙，形成局部牙周袋，并將活細菌涂抹在牙齦緣，相較于鋼絲結扎最大限度的減少了對牙周組織的機械損傷。這種方法可以促進牙周袋形成，并提供持續(xù)的炎癥微環(huán)境，促進牙周炎的持續(xù)進展。實驗結果顯示牙槽骨明顯吸收，表明我們成功構建了牙周炎模型。結扎法作為牙菌斑機械聚集的促進因子，可導致菌斑的持續(xù)積累，引發(fā)牙齦免疫反應，表現(xiàn)為炎癥細胞的浸潤、牙周纖維結締組織的破壞和牙槽骨吸收［17， 18］。同時細菌毒素激活大量炎性因子的釋放，這些炎癥因子及毒素可通過外周血和血腦屏障進入大腦皮層，誘導炎癥過程和神經(jīng)炎癥，上調IL-6 和IL-21 水平［19-22］。已有研究采用結扎法誘導阿爾茨海默病小鼠模型（3×Tg-AD）牙周炎，出現(xiàn)顯著牙槽骨吸收，牙齦中單核細胞趨化蛋白1（MCP-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-1β（IL-1β）基因表達水平升高，同時下丘腦中IL-6顯著增加，同時增加了大腦DG區(qū)和丘腦區(qū)域的Iba-1免疫反應性以及丘腦區(qū)域的GFAP免疫反應性［12］。本研究組織學結果顯示正常牙周炎小鼠認知功能檢測未見異常，而伴隨著牙槽骨吸收、炎細胞浸潤等牙周炎癥出現(xiàn)，小鼠大腦海馬區(qū)認知相關測試水平降低，而且Pn加重了牙周炎牙槽骨破壞和牙齦上皮炎癥反應，小鼠大腦切片顯示海馬區(qū)神經(jīng)元細胞損害加重，而對應的小鼠認知障礙進一步加重，這提示Pn菌可能加重對小鼠認知障礙影響。

新物體識別和莫里斯水迷宮是廣泛用于評估嚙齒動物記憶、學習和空間認知功能的經(jīng)典試驗，這兩項任務都涉及海馬體和相關區(qū)域的完整性，以及前額葉皮層連接，可以用來評估海馬依賴記憶時面臨的主要問題［23］。其中腦前額葉皮質功能與認知和行為管理等相關，海馬體CA3 區(qū)在信息的整合和傳遞過程中發(fā)揮著關鍵作用，此外，海馬體CA3 區(qū)還與GABAA受體和NMDA受體相互作用，這些受體在學習和記憶中也起到了重要的作用［24］。本研究對Pn菌所致牙周炎6周的小鼠模型進行大腦取材，通過組織學HE和尼氏小體染色觀察到其海馬CA3 區(qū)神經(jīng)細胞變性壞死等病變，病理表型與上述文獻報道一致，也與行為學改變一致，首次證明Pn 菌誘導的神經(jīng)細胞損傷破壞了大腦海馬體CA3區(qū)從而導致了認知障礙，對其認知能力、學習記憶以及空間認知能力造成損害。

目前相對大量的臨床觀察和流行病學實驗證據(jù)表明，牙周炎是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的危險因素［25］。慢性牙周炎和牙齦卟啉單胞菌感染已被確定為癡呆和阿爾茲海默癥發(fā)生的重要危險因素［16］。單純結扎誘導的牙周炎也會對認知造成損害，有研究發(fā)現(xiàn)結扎誘導的大鼠牙周炎會導致全身炎癥，最終導致認知障礙［21］。同時牙周炎中失調的促炎細胞可能會誘導炎癥和神經(jīng)炎癥［19， 21］。細菌及其產(chǎn)物如外囊泡和脂多糖可能分別通過三叉神經(jīng)和牙周血通路易位到到大腦中，導致認知能力下降［26］。因此我們通過設置單純結扎組，觀察由結扎誘導的牙周炎對認知的影響，由結果推斷Pn菌與海馬區(qū)神經(jīng)元的關系應該是通過牙周炎介導的，且Pn菌會加重牙周炎，并對小鼠海馬體造成進一步損害，具體機制有待進一步探究。

以阿爾茲海默癥的為例的認知障礙，其發(fā)病機制至今尚未完全闡明，也缺乏有效的治療手段及藥物成為臨床上亟待解決的難題。有研究發(fā)現(xiàn)牙周炎最常見的致病菌牙齦卟啉單胞菌（Pg）誘發(fā)的慢性牙周炎與阿爾茲海默癥、心血管疾病和類風濕性關節(jié)炎發(fā)生相關，并已經(jīng)在阿爾茲海默癥患者的大腦中發(fā)現(xiàn)了Pg［27-29］。本研究推測Pn菌很可能與Pg菌的作用機制相似，由其本身和致病性副產(chǎn)物（如LPS和外囊泡）引起的神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元細胞凋亡，或導致血腦屏障受損［16， 30， 31］，使細菌及其毒性產(chǎn)物由口腔進入大腦并通過多種途徑傳播，包括單核細胞感染后在腦部募集［32］、直接感染和損傷血腦屏障的內皮細胞［33］、感染并通過顱神經(jīng)傳播（例如嗅覺［34］或三叉神經(jīng)）。因此我們推測Pn菌及其毒性產(chǎn)物通過口腔突破血腦屏障進入大腦，導致神經(jīng)細胞變性或死亡，從而誘導神經(jīng)炎癥，導致認知障礙，使小鼠的學習和記憶能力受損。相關推測有待進一步驗證。

綜上，本研究結果表明Pn通過加重牙周炎癥破壞小鼠大腦海馬CA3 區(qū)神經(jīng)元數(shù)量及細胞結構，對認知能力、學習記憶以及空間認知能力造成損害，導致小鼠出現(xiàn)認知障礙。該研究揭示了牙周炎與牙周炎相關Pn對認知障礙的影響，為未來牙周炎與認知障礙相關疾病的治療和預防提供了更具有針對性的策略。而有關Pn菌加重牙周炎及認知障礙的分子機制，未來可以通過對使用Pn菌干預后的小鼠口腔菌群進行轉錄組測序，探究相關分子通路機制，進行進一步的研究和驗證，以深入了解Pn菌對牙周炎及認知障礙中的重要作用。

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（編輯：經(jīng) 媛）