[摘" "要]" "目的：研究適合微孔板法檢測RhCE抗原的最優(yōu)條件，分析常州地區(qū)獻血人群RHCE基因型及表型特征。方法：選取2 558例無償獻血者血標(biāo)本，以試管法為標(biāo)準(zhǔn)，凝集試驗為原理，研究微孔板法不同抗體容量、紅細(xì)胞濃度及振蕩頻率、時間對反應(yīng)結(jié)果的影響，建立試驗反應(yīng)和關(guān)鍵參數(shù)。對RhCE抗原弱表達樣本進行RHCE基因10個外顯子測序。結(jié)果：選取待檢紅細(xì)胞濃度為4%、單克隆試劑抗體容量比例為1∶1的反應(yīng)體系，按1 100 r/min頻率震蕩120 s、450 r/min頻率震蕩900 s、1 100r/min震蕩60 s和30 r/min震蕩180 s 4次，讀取的結(jié)果與手工試管法一致率達99.96%。2 558例中表型CCDee占43.47%，CcDEe占35.49%，ccDEE占8.37%，CcDee占8.21%，ccDEe占3.05%，CCDEe占0.71%，ccDee占0.39%，CcDEE占0.31%，未見CCDEE表型。10例RHCE抗原弱表達基因多態(tài)性為RHCE*01/*03和RHCE*04/*03，發(fā)現(xiàn)1例RHCE*04/*02*new。結(jié)論：RhCE抗原在獻血人群中具有基因多態(tài)性特征，存在稀有基因型，建立微孔板法篩查RhCE抗原試驗關(guān)鍵參數(shù)為大規(guī)模篩查獻血人群中RHCE基因多態(tài)性提供試驗方法。新核苷酸突變位點為RHCE變異型發(fā)生機制研究提供樣本來源，為RHCE精準(zhǔn)輸血提供基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]" "微孔板法；關(guān)鍵參數(shù)；抗原弱表達；RhCE抗原篩查

[中圖分類號]" "R392.1 [文獻標(biāo)志碼]" "A [DOI]" "10.19767/j.cnki.32-1412.2025.01.003

Screening RhCE antigen key parameters by microplate method and RHCE gene polymorphism analysis

YANG Hongmei， CHEN Minjie， ZOU Xin， MA Sifei， XIONG Yuqi， ZOU Shuying

（Changzhou Blood Center/ Changzhou Key Laboratory of Clinical Blood Transfusion， Jiangsu 213004）

[Abstract]" "Objective： To study the optimal conditions suitable for the detection of RhCE antigen by microplate method， and to analyze the genotype and phenotypic characteristics of RHCE in the blood donation population in Changzhou. Methods： Samples from 2558 blood donors were selected， and the effects of antibody dosage， different concentrations of red blood cells， oscillation frequency and time on the reaction results were studied by taking the test-tube method as the result standard and the agglutination test as the principle， so as to establish the test response and key parameters. In the experiment， 10 exons of RHCE gene were sequenced on the samples with weak expression of RhCE antigen. Results： The reaction system with 4% red blood cell concentration and 1∶1 monoclonal reagent antibody volume ratio was selected and the reaction system was shaken at 1 100 r/min for 120 s， 450 r/min for 900 s， 1 100 r/min for 60 s and 30 r/min for 180 s， and the coincidence rate of reading results with manual test tube method was 99.96%. The phenotypes of 2 558 blood donors were CCDee（43.47%）， CcDEe（35.49%）， ccDEE（8.37%）， CcDee（8.21%）， ccDEe（3.05%）， CCDEe（0.71%）， ccDee（0.39%）， CcDEE（0.31%）， but CCDEE phenotype was not observed. The polymorphisms of weakly expressed genes of RHCE antigen in 10 cases were RHCE*01/*03 and RHCE*04/*03， additionally a case with RHCE*04/*02*new was found." Conclusion： RhCE antigen has the characteristics of gene polymorphisms and rare genotypes in the blood donation population， and the key parameters of the RhCE antigen screening test by microplate method are established to provide a test method for large-scale screening of RHCE gene polymorphisms in the blood donation population. The new nucleotide mutation sites provide a sample source for the study of the pathogenesis mechanism of RHCE variants and provide a basis for RHCE precision blood transfusion.

[Key words]" "microplate method; key parameters; weak expression of antigen; RhCE antigen screening

Rh血型系統(tǒng)是最復(fù)雜、最具多態(tài)性、也是最重要的血型系統(tǒng)，在臨床輸血、移植醫(yī)學(xué)和產(chǎn)前診斷中具有重要意義，其主要抗原有D、C、c、E、e 5種。現(xiàn)行《臨床輸血技術(shù)規(guī)范（2000）》只要求獻血者與受血者RhD抗原同型輸注，但這可能導(dǎo)致Rh系統(tǒng)其它血型特異性抗體的產(chǎn)生，降低輸血療效。文獻報道，輸血后產(chǎn)生不規(guī)則抗體以Rh系統(tǒng)檢出率最高[1-2]，約占特異性抗體的73.91%，這源于Rh血型系統(tǒng)抗原性強度僅次于ABO血型系統(tǒng)[3]。為了降低輸血相關(guān)Rh同種抗體產(chǎn)生及輸血反應(yīng)發(fā)生率，提高輸血治療效果以及保障臨床安全輸血，現(xiàn)多科室聯(lián)合建立常州地區(qū)獻血者RhCcEe表型數(shù)據(jù)庫，為實現(xiàn)精準(zhǔn)化輸血治療提供前期保障?；谖⒖装宸z測RhCE抗原效率高、試劑用量小等優(yōu)點，研究影響微孔板法試驗的關(guān)鍵參數(shù)，確定適合微孔板法檢測RhCE抗原的最優(yōu)條件，以手工試管法進行結(jié)果比對，大規(guī)模地研究獻血人群中RHCE基因多態(tài)性特征?，F(xiàn)將2 558例獻血者RhCE抗原結(jié)果比對及基因多態(tài)性特征報告如下。

1" "資料與方法

1.1" "一般資料" "收集2024年6月1日—12日我站無償獻血者留樣標(biāo)本共2 558例。靜脈采集血樣5 mL，4 ℃保存于乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝管中。本研究已通過常州市中心血站醫(yī)學(xué)倫理委員會審查批準(zhǔn)。

1.2" "儀器與試劑" "抗-C、抗-c、抗-E、抗-e均為IgM型單克隆抗體（上海血液生物），篩選細(xì)胞（匈牙利Reagens公司）。KA-2200血型血清學(xué)專用離心機（日本久保田），低速離心機及2403高速臺式離心機（江蘇貝索生物），STAR-BG全自動血型儀（奧斯邦），平板離心機；平板震蕩儀；2～6 ℃醫(yī)用冷藏箱（海爾公司），96孔U型微孔板，Liswell實驗控制軟件。

1.3" "血清學(xué)檢測

1.3.1" "微孔平板法：采用奧斯邦全自動血型加樣儀，將稀釋的紅細(xì)胞和單克隆抗體分別加樣混勻，按照儀器設(shè)置的振蕩頻率4次震蕩混勻、靜止，最后肉眼觀察結(jié)果。

1.3.2" "鹽水試管法：取被檢者紅細(xì)胞少許，配制成2%～4%紅細(xì)胞懸液進行Rh血型系統(tǒng)抗原實驗，離心判讀凝集強度；同時從篩選細(xì)胞中挑取相應(yīng)細(xì)胞作為陰陽性對照。所有實驗均嚴(yán)格按照臨床檢驗技術(shù)規(guī)范[4]和試劑操作說明書進行。

1.4" "RHCE基因測序及分析" "采用PCR擴增試劑、基因組DNA以及RHCE基因特異性引物進行多重PCR擴增，由西安浩瑞基因技術(shù)有限公司完成。RHCE等位基因命名方法參照國際輸血協(xié)會（International Society of Blood Transfusion，ISBT）血型抗原等位基因數(shù)據(jù)庫。

2" "結(jié)" " " 果

2.1" "微孔板法檢測

2.1.1" "微孔板法試驗體系的確定：（1）待檢紅細(xì)胞濃度及加樣量確定：選取24例樣本采用10%、5%、4%、2%四種紅細(xì)胞濃度及20 μL、15 μL、10 μL三種加樣量進行實驗，最終得出最佳條件為待檢紅細(xì)胞濃度為4%、加樣量為15 μL。（2）抗體最適容量的確定：在每支試管中加15 μL 4%待檢紅細(xì)胞，選用10 μL、15 μL、20 μL及30 μL反應(yīng)量進行RhCE抗原檢測，以能檢出RhCE弱陽性質(zhì)控的最小容量確定抗體最適合容量（選取匈牙利抗篩細(xì)胞雜合子RhCcEe），最終確定抗體容量為15 μL。

2.1.2" "微孔板震蕩頻率和時間的確定：利用STAR-BG加樣儀在U型微孔板中加入抗體容量15 μL、4%待檢紅細(xì)胞15 μL混勻，按RhD血型檢測方法設(shè)置震蕩參數(shù)。最終確定按1 100 r/min頻率震蕩120 s、450 r/min頻率震蕩900 s、1 100 r/min震蕩60 s和30 r/min震蕩180 s，共4次，讀取結(jié)果最佳。

2.2" "RhD陽性人群RhCE表型分布" "2 558例獻血者中表型CCDee占43.47%，CcDEe占35.50%，ccDEE占8.37%，CcDee占8.21%，ccDEe占3.05%，CCDEe占0.71%，ccDee占0.39%，CcDEE占0.31%，未見CCDEE表型。見表1。

2.3" "微孔板法RhCE抗原檢測與手工法結(jié)果比對及RHCE基因外顯子測序分析" "采用微板法進行RhCE抗原檢測與手工試管法一致率為99.96%（2 557/2 558）。兩種方法檢測出RhCE抗原弱表達10例（0.39%）（10/2 558），其RHCE基因1～10外顯子測序結(jié)果主要為RHCE*01/*03和RHCE*04/*03，

1例為RHCE*04/*02*new。見表2。

2.4" "RHCE編碼區(qū)全長測序" "編號9為RHCE*04/*02新等位基因，因此進一步采用三代測序技術(shù)對其RHCE基因1～10外顯子及兩條單倍體進行測序。在RHCE第1外顯子發(fā)現(xiàn)c.48Ggt;C和c.105C/T突變；第2外顯子發(fā)現(xiàn)c.150Cgt;T，c.178Cgt;A，c.201Agt;G，c.203Agt;G和c.307Cgt;T突變位點；第5外顯子發(fā)現(xiàn)c.676G/C雜合突變。結(jié)果見圖1和表3。

3" "討" " " 論

Rh血型系統(tǒng)在臨床上的重要性僅次于ABO血型系統(tǒng)，其免疫原性強度由強到弱依次為D、E、C、c、e，目前大量文獻表明Rh血型系統(tǒng)抗體已成為臨床上最常見的不規(guī)則抗體[3，5-6]，因此開展RhCE抗原檢測以Rh分型抗原同型輸注已成為研究的熱點，尤其是對于需要反復(fù)輸血、有輸血史以及妊娠史患者格外重要。Rh抗原配型輸血能明顯降低輸血后Rh血型系統(tǒng)意外抗體陽性率甚至減少輸血不良反應(yīng)，從而有效保障臨床輸血安全[4-5]。目前全國開展RhCE抗原同型輸注的醫(yī)療機構(gòu)較少，我站為建立常州地區(qū)RHCE抗原表型庫以及為RhCE抗原同型輸注精準(zhǔn)化輸血治療作前期準(zhǔn)備，選用微孔板機器法代替試管手工法進行大規(guī)模RhCE抗原篩查。

微孔板法試驗關(guān)鍵參數(shù)的確定非常重要，若震蕩頻率過低或時間過短，紅細(xì)胞不能完全振散，可造成假陽性過多[7]；若震蕩頻率過高或時間過長，雜合子與血型抗體的凝集可能出現(xiàn)假陰性。本研究通過不斷摸索，最終確定微孔板法試驗待檢紅細(xì)胞濃度為4%、單克隆試劑抗體容量比例為1∶1的反應(yīng)體系，按1 100 r/min頻率震蕩120 s、450 r/min頻率震蕩900 s、1 100 r/min震蕩60 s和30 r/min震蕩180 s 4次，讀取的結(jié)果與手工試管法一致率達99.96%。該方法簡便快速，適用于大部分血站RhCE抗原檢測，為建立RhCE抗原數(shù)據(jù)庫及了解RHCE基因變異型提供了基本方法。

常州地區(qū)2 558例獻血人群中C、c、E、e四種抗原頻率分別為66.18%、33.82%、28.31%和71.69%，其中C抗原比例接近70%，在RhCE抗原同型輸注中C抗原意義最大，最常見表型為CCee（43.47%），與文獻報道相符。根據(jù)ISBT等位基因命名表目前已確認(rèn)RHCE變異型等位基因160多種[8-9]，本次對常州地區(qū)獻血人群大規(guī)模RhCE抗原篩查中共發(fā)現(xiàn)10例抗原弱表達（RHCE變異型），以RHCE*01/*03和RHCE*04/*03為主，發(fā)現(xiàn)1例RHCE*04/*02*new，第1個外顯子第105號堿基發(fā)生C＞T的雜合突變，該突變未影響氨基酸的改變，因而未影響RHCE蛋白表達。但該標(biāo)本RHCE基因測序不僅發(fā)現(xiàn)正常外顯子突變，還發(fā)現(xiàn)在第2內(nèi)含子中有109 bp大小插入片段，單倍體1外顯子突變組合為c.48Ggt;C、c.105C/T、c.150Cgt;T、c.178Cgt;A、c.201Agt;G、c.203Agt;G、c.307Cgt;T和c.676G/gt;C，根據(jù)ISBT標(biāo)準(zhǔn)（https：//www.isbtweb.org/resource/004rhd.html）判斷單倍體分型為RHCE*04，表型為Ce；單倍體2測序顯示第2、3外顯子丟失現(xiàn)象，懷疑RH Ce第2～3外顯子存在RHCE*Ce-D（3）重組，從而導(dǎo)致e抗原弱表達，與RHCE*03.32導(dǎo)致E抗原的表達類似。通過Pacbio三代測序平臺的全長RHCE基因序列，確認(rèn)9號樣本與RH Ce-D（3）-Ce對齊。此外還找到重組的確切起始和結(jié)束區(qū)域，兩者之間的起始區(qū)域c.148-807至c.148-997和兩者之間的結(jié)束區(qū)域c486+6289至c.486+6696，最終確定其表型為CCEeweak，認(rèn)定是由于RHCE與RHD發(fā)生重組從而導(dǎo)致e抗原弱表達。

綜上所述，本研究通過優(yōu)化微孔板法篩查RhCE抗原試驗關(guān)鍵參數(shù)，建立大規(guī)模篩查獻血人群RhCE抗原的試驗方法，進一步了解常州地區(qū)獻血人群RHCE基因多態(tài)性特征，為精準(zhǔn)輸血打下堅實基礎(chǔ)。國內(nèi)外文獻報道RHCE基因分布存在地區(qū)和種族差異[10-13]，本研究結(jié)果為RHCE等位基因核苷酸序列多樣性提供豐富資料，新核苷酸突變位點為RHCE變異型機制研究提供樣本來源。

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[收稿日期] 2024-11-07

（本文編輯" "繆宏建）

* [基金項目] 常州市中心血站站級課題（xz202304，xz202402）；常州市科技局課題項目（CJ20245046，CJ20241124）。

** [作者簡介] 楊紅梅，女，漢族，江蘇常州人，生于1982年11月，碩士，副主任技師。研究方向：主要從事血液質(zhì)量控制及管理的研究。" "通信作者：鄒書英，E-mail：541741745@qq.com