摘要：目的通過網(wǎng)絡藥理學與分子對接方法預測桂枝茯苓丸對血小板活化的主要活性成分、靶點及信號通路，探究其潛在作用機制，以期開發(fā)新的抗血小板藥物。方法從TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲取桂枝茯苓丸活性成分并在Uniport數(shù)據(jù)庫中規(guī)范，從Genecard、OMIM、TTD等數(shù)據(jù)庫中獲取并整合血小板活化的相關靶點，使用venny平臺篩選共同靶點，借助Cytoscape3.7.2構(gòu)建基因蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡、藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡，通過DAVID數(shù)據(jù)庫進行基因本體（GO）生物功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，利用Autodock vina軟件對核心活性成分及核心靶點進行分子對接驗證。結(jié)果篩選得到桂枝茯苓丸活性成分相關靶點214個，血小板活化相關基因2695個，其中共同靶點124個，GO功能富集得到生物過程（BP）條目588個，細胞組分（CC）條目63個，分子功能（MF）條目109個，KEGG通路富集得到156條信號通路（Plt;0.05）。利用PPI及KEGG通路過程分析得到核心靶點AKT1、PTGS2、NOS3、COL1A1、F3、RAF1、PTGS1；分子對接結(jié)果顯示，桂枝茯苓丸中槲皮素與核心靶點結(jié)合能較強，均lt;-7.0KJ/mol。結(jié)論桂枝茯苓丸通過槲皮素等成分抑制血小板活化與NOS3、PTGS1、PTGS2、RAF1等靶點調(diào)控有關，并作用于一氧化氮生物合成過程、VEGF信號通路、補體和凝血級聯(lián)與cGMP PKG信號通路等。

關鍵詞：網(wǎng)絡藥理學；桂枝茯苓丸；血小板活化；作用機制；分子對接

中圖分類號：R289文獻標志碼：A文章編號：1007-2349（2025）03-0060-09

血小板是一種無核血細胞，主要來源于骨髓巨核細胞，不僅是參與止血的主要細胞，也是重要的免疫細胞，在維持血管完整性、炎癥、調(diào)節(jié)免疫過程和腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著關鍵作用［1］。血小板活化是血小板發(fā)揮作用的關鍵功能，分為血小板粘附、聚集、變形、釋放等多個過程。血小板活化的驅(qū)動過程呈梯度變化，即血小板活化不是一個二元過程，而是一個分級的事件序列［2］。當血管損傷后，血小板粘附在細胞外基質(zhì)上，不同受體間相互協(xié)調(diào)，導致血小板在受損血管壁上形成血栓并開始滾動，最終粘附牢固。血小板粘附觸發(fā)由酪氨酸激酶和G蛋白偶聯(lián)受體介導的信號級聯(lián)反應，引導血小板完全激活并伴隨顆粒釋放，進而導致其他血小板的募集和激活。血小板粘附和活化導致血小板聚集和促凝血表面的出現(xiàn)，促進在受傷部位形成富含纖維蛋白的止血栓。此外，血小板活化還會觸發(fā)內(nèi)皮細胞合成和分泌分子，如前列環(huán)素和一氧化氮，從而嚴格控制和限制血栓形成［3］。血小板不僅在動脈粥樣硬化、心衰、高血壓等心血管疾病中發(fā)揮重要作用［4-5］，還參與癌癥轉(zhuǎn)移過程，血小板-腫瘤細胞相互作用與整合素和糖蛋白等多種粘附分子以及P-選擇素等有關［6］。

即使過去幾十年間已經(jīng)開發(fā)了如環(huán)氧化酶-1抑制劑阿司匹林、P2Y12抑制劑氯吡格雷等藥物［7］，然而更新型、高效、可降低不良事件發(fā)生和出血率的血小板活化抑制劑仍然是目前研究的熱點［8］。中醫(yī)藥是中華民族幾千年來在疾病防治中臨床實踐經(jīng)驗與理論的融合，具有“多成分、多靶點、系統(tǒng)調(diào)控”的顯著特點［9］。目前，中藥聯(lián)合抗血小板藥物的應用研究進展迅速，中藥在一定程度上有助于防止現(xiàn)代抗血小板藥物單一靶向的弊端、增強其抗血小板活性、降低血栓事件的發(fā)生率、降低藥物不良反應的風險［10］。在輸血醫(yī)學領域，尋找能夠抑制血小板活化的中藥活性成分對于血小板保存以及抑制血小板相關免疫調(diào)節(jié)等的研究具有重要意義。

桂枝茯苓丸起源于中國古代名醫(yī)張仲景1800年前撰寫的《金匱要略》一書，方中桂枝溫通血脈，以行瘀滯，是為君藥；桃仁活血祛瘀，化瘀消癥，用之為臣；丹皮、芍藥既活血散瘀，又涼血以清瘀久所化之熱，芍藥并能緩急止痛；茯苓滲濕祛痰，助消癥之功，健脾益胃，以扶正氣，均為佐藥［11］，是中醫(yī)活血化瘀經(jīng)典方劑。研究表明，桂枝茯苓丸除治療婦科相關疾病，還與抑制血小板活化過程有關［12-13］。桂枝茯苓丸可以靶向參與調(diào)節(jié)血液循環(huán)、炎癥和免疫因子、增殖、細胞凋亡等的多種信號通路，其下調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細胞中COX-1和COX-2 mRNAs的mRNA表達［14］，并抑制了小鼠子宮組織中COX-2的活性［15］，其機制與血小板活化過程有關。然而。桂枝茯苓丸抑制血小板活化的具體機制尚不明確。

近年來，隨著先進智能技術的出現(xiàn)，網(wǎng)絡藥理學得到了完善和深入實施，為揭示和可視化中藥對抗多因素疾病的潛在相互作用網(wǎng)絡提供了方法。網(wǎng)絡藥理學的開發(fā)和應用促進了中藥的安全性、有效性和機制研究，從而增強了中藥的可信度和普及性［16］。本研究通過網(wǎng)絡藥理學與分子對接的方法，預測桂枝茯苓丸抑制血小板活化的有效成分、作用靶點及可能通路，為后續(xù)研究提供參考。

1材料與方法

1.1桂枝茯苓丸活性成分篩選及有效成分靶點獲取通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫，以口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%及類藥性（drug likeness，DL）≥0.18作為篩選參數(shù)，檢索桂枝茯苓丸藥物活性成分及作用的蛋白質(zhì)靶點，并將所有的靶點在Uniport數(shù)據(jù)庫中進行規(guī)范，將物種設置為人，獲得靶點標準的Uniport名稱。

1.2血小板活化靶點的篩選以“platelet activation”、“platelet aggregation”、“thrombus”等與血小板活化過程有關的名稱為關鍵詞，挖掘Genecards、OMIM、TTD 數(shù)據(jù)庫中血小板活化的潛在靶點。如Genecards數(shù)據(jù)庫中靶點過多時，查閱文獻并根據(jù)相關經(jīng)驗，取Score值大于等于中位數(shù)的目標靶點作為血小板活化潛在靶點。合并并刪除重復值得到血小板活化相關靶點。

1.3桂枝茯苓丸-血小板活化共同靶點PPI網(wǎng)絡構(gòu)建使用Venny2.1.0在線平臺將桂枝茯苓丸藥物靶點與血小板活化靶點進行映射取交。利用String平臺分析其相互作用，構(gòu)建蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡模型，將生物種類設定為“Homo sapiens”，最小互相作用閾值設定為“medium confidence”（gt;0.4），得到PPI網(wǎng)絡，并用 CytoScape3.7.2進一步分析。

1.4桂枝茯苓丸藥物-活性成分-血小板活化靶點網(wǎng)絡圖構(gòu)建運用CytoScape3.7.2構(gòu)建桂枝茯苓丸藥物-活性成分-血小板活化靶點網(wǎng)絡圖，分析有效成分及靶點的網(wǎng)絡拓撲參數(shù)，包括連接度（Degree）、介數(shù)中心性（Betweenness Centrality）及中心接近度（Closeness Centrality）等，并根據(jù)其參數(shù)判斷核心靶點及成分。

1.5GO功能與KEGG通路富集分析將桂枝茯苓丸與血小板活化共同靶點錄入DAVID平臺，進行基因本體論（gene ontology，GO）功能注釋和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，篩選條件Plt;0.05。將數(shù)據(jù)結(jié)果通過微生信在線平臺對數(shù)據(jù)可視化處理。

1.6分子對接驗證在KEGG通路圖中尋找血小板活化有關靶點，將相關靶點與PPI網(wǎng)絡分析結(jié)果進行整合，選取degree靠前的7個中藥靶點作為大分子蛋白受體，通過PDB數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）下載核心靶點蛋白結(jié)構(gòu)。選擇1.4參數(shù)中排名前3的成分為小分子配體，通過PubChem數(shù)據(jù)庫獲得核心成分蛋白3D結(jié)構(gòu)。使用Autodock vina進行分子對接，根據(jù)Docking Score值評價靶點與活性化合物的結(jié)合強度與活性。

2結(jié)果

2.1桂枝茯苓丸活性成分及靶點獲取桂枝、茯苓、赤芍、桃仁、牡丹皮分別提取化學成分6、6、13、18、6種，包括槲皮素，山柰酚，黃芩苷等。桂枝、茯苓、赤芍、桃仁、牡丹皮成分的作用靶點分為有29、16、102、54、173個，合并去重得到靶點214個。

2.2血小板活化靶點獲取從Genecards數(shù)據(jù)庫中獲得血小板活化、粘附、變形、聚集、釋放、血栓靶點分別為12704、8264、5023、8204、8708、1114個。設定Relevance score大于中位數(shù)的目標靶點為血小板活化的潛在靶點，可多次取中位數(shù)篩選相關靶點。結(jié)合OMIM、TTD數(shù)據(jù)庫補充相關靶點，合并去重，最終得到血小板活化相關靶點2695個。

2.3桂枝茯苓丸-血小板活化共同靶點PPI網(wǎng)絡的構(gòu)建將篩選的桂枝茯苓丸活性成分靶點與血小板活化靶點取交，通過Venny圖在線平臺繪制韋恩圖，得到桂枝茯苓丸成分-血小板活化共同靶點124個，見圖1。將靶點提交至STRING11.0平臺后，得到其共同靶點蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡，使用cytoscape3.7.2對相互作用關系進行分析，得到圖2。

2.4桂枝茯苓丸藥物-活性成分-血小板活化靶點網(wǎng)絡圖構(gòu)建使用cytoscape3.7.2構(gòu)建桂枝茯苓丸藥物-活性成分-血小板活化靶點網(wǎng)絡，見圖3，通過 cytoscape3.7.2內(nèi)置的Network Analyzer分析桂枝茯苓丸對血小板活化作用網(wǎng)絡拓撲學參數(shù)，得到核心成分。通過網(wǎng)絡分析數(shù)據(jù)，見表1，預測槲皮素為桂枝茯苓丸對血小板活化產(chǎn)生作用的主要成分，其次為β-谷甾醇、山柰酚。

2.5GO功能與KEGG通路富集分析應用DAVID數(shù)據(jù)平臺對共同靶點進行富集分析，借助微生信在線平臺對結(jié)果可視化。由結(jié)果可見多個靶點的功能與血小板活化過程密不可分。桂枝茯苓丸參與的部分生物學過程見圖4A、B、C，參與的通路見圖4D，靶點通路部分結(jié)果見圖5。查找KEGG通路過程圖，得到與血小板活化作用相關的具體靶點，與PPI網(wǎng)絡分析結(jié)果整合，根據(jù)P值排序，得到表2。

2.6分子對接驗證將活性成分槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚與核心靶點分子AKT1、PTGS2、NOS3、COL1A1、F3、RAF1、PTGS1進行分子對接驗證，結(jié)果見表3。文獻研究認為，結(jié)合能lt;0配體和受體能自發(fā)結(jié)合；若結(jié)合能lt;-4.25KJ/mol表明配體與受體有一定的結(jié)合活性；lt;-5.0KJ/mol表明配體與受體有一定的結(jié)合活性，lt;-7.0KJ/mol表明配體與受體有強烈的結(jié)合活性［17］。分子對接結(jié)果示結(jié)合能lt;0的有21種，介于-5和-7的之間有2種，lt;-7.0 KJ/mol的有19種，占所有結(jié)果的90.5%，即大部分靶點與成分有強烈的結(jié)合活性，其中，槲皮素與4個靶點的結(jié)合活性極強，見圖6（A、B、C、D）。

3討論

桂枝茯苓丸藥物-活性成分-血小板活化靶點網(wǎng)絡圖顯示，活性成分槲皮素連接度、介數(shù)中心性及中心接近度遠高于β-谷甾醇及山柰酚。分子對接結(jié)果顯示，槲皮素與核心靶點具有強烈的結(jié)合活性。并結(jié)合國內(nèi)外相關研究推測，槲皮素可能是桂枝茯苓丸抑制血小板活化的核心成分。

槲皮素是一種廣泛存在于植物中的類黃酮化合物，具有抗氧化性、抗菌能力、抗腫瘤作用、抗炎和免疫抑制作用以及保護心血管、治療肥胖和2型糖尿病等能力［18］。它可以抑制產(chǎn)生炎癥的酶（環(huán)氧合酶COX和脂氧合酶LOX）來發(fā)揮抗炎和免疫抑制作用，可以通過抑制氮氧化物（NO）和內(nèi)皮功能，以及預防神經(jīng)元的氧化性炎癥損傷和血小板的抗聚集作用保護心血管，還可以抑制凝血酶活性來保護大鼠免受導管相關性金黃色葡萄球菌感染［19］。此外，槲皮素還可通過減少脂質(zhì)過氧化、毛細血管通透性和血小板聚集等方面治療肥胖和2型糖尿?。?0］。

依據(jù)PPI網(wǎng)絡及KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，核心靶點分別為AKT1、PTGS2、NOS3、COL1A1、F3、RAF1、PTGS1、PIK3CG等。分子對接結(jié)果顯示，PTGS2、NOS3、RAF1、PTGS1結(jié)合活性更強。絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt是許多細胞（包括血小板）中PI3K產(chǎn)物的一個靶標，Akt與不同細胞中的多種功能有關，包括抑制細胞凋亡、葡萄糖代謝和細胞增殖，且在體外穩(wěn)定血小板聚集和體內(nèi)血小板栓形成方面具有決定性作用。有研究表明，Akt缺陷型血小板似乎具有分泌缺陷，導致纖維蛋白原結(jié)合減少，從而發(fā)生聚集受損［21］。Woulfe等［22］推測除了影響血小板分泌功能外，Akt調(diào)節(jié)血小板聚集和血栓形成中的作用可能是通過磷酸化eNOS以外的血小板底物或除eNOS之外的血小板底物產(chǎn)生的。此外，Akt還可能調(diào)節(jié)整合素αIIbβ3的功能。PTGS2也稱為環(huán)氧化酶2（COX-2），它可以與G蛋白耦合，從而激活G蛋白，升高細胞內(nèi)cAMP水平，激活蛋白激酶A，達到抑制血小板聚集的效果［23］。此外Buerkle等［24］研究發(fā)現(xiàn)選擇性抑制COX-2可減少倉鼠小動脈中 6-酮-PGF（1alpha）內(nèi)皮釋放，增加瞬時血小板-血管壁相互作用，并牢固血小板的粘附。此外，它還可以更快地閉塞受損的微血管。近些年研究表明，COX-2與血小板活化在子宮內(nèi)膜異位癥和COVID-19等疾病中同樣發(fā)揮作用［25-26］。NOS3是調(diào)節(jié)血管張力、內(nèi)皮功能和血小板聚集的關鍵酶［27］。Freedman等［28］通過實驗證明受刺激的血小板會活化并產(chǎn)生NO從而適度抑制血小板活化，并顯著抑制額外的血小板募集，即血小板產(chǎn)生的NO可能控制血小板形成血栓。還有研究表明某些藥物可以激活大鼠主動脈組織中的 eNOS減弱血小板聚集［29］。F3，即血小板因子 3（PF3），是活化血小板細胞膜上表達的磷脂部分，在凝血機制的激活中起著重要作用。在血栓形成過程中參與血小板聚集，每當發(fā)生血小板活化時，PF3就會釋放并參與凝血酶形成［30-31］。血小板因子3不會被血小板活化因子（PAF）刺激所產(chǎn)生，而主要是由于膠原蛋白在洗滌的血小板中誘導聚集、分泌和 PF3 活化［32］，也有研究表明，膠原刺激的PF1和PF3釋放與血小板聚集或PF4釋放無關，而可能是釋放反應的一個單獨階段［33］。PF3還被發(fā)現(xiàn)可能與血淚和血汗癥有關［34］。在血小板中，Raf-1的活性受細胞內(nèi)鈣和蛋白激酶C（PKC）的調(diào)節(jié)。當用2-甲基硫代二磷酸腺苷（2MeSADP）刺激血小板時，磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（PDK1）在絲裂原活化蛋白激酶MAPK通路中磷酸化并激活上游激酶Raf-1來控制血小板中的血栓生成和血栓形成［35］。還有研究表明，血小板受體糖蛋白Ib-IX 介導的血小板整合素 αIIbβ3激活被Raf-1的顯性陰性突變體抑制［36］。PTGS1，即前列腺素內(nèi)過氧化物合酶 1（COX-1），可以通過氧化反應將花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素（PG）G2，然后通過過氧化物酶反應轉(zhuǎn)化為PGH2，在血小板中，PGH2又通過血栓素合成酶轉(zhuǎn)化為促聚集的 TXA2［37］。

GO富集分析結(jié)果顯示這些共同靶點參與傷口愈合、細胞內(nèi)外各方面、蛋白質(zhì)結(jié)合等過程。研究發(fā)現(xiàn)，血小板在傷口愈合中不止有止血的作用，血小板會改變形狀并釋放儲存在顆粒中的各種生物活性分子，包括生長因子、細胞因子和趨化因子，這些生物活性分子有助于募集和激活參與傷口愈合級聯(lián)反應的各種細胞類型。血小板通過這些機制充當復雜傷口愈合過程的關鍵協(xié)調(diào)者，引發(fā)導致炎癥、細胞增殖和組織重塑的級聯(lián)事件。它們在釋放生物活性分子中的作用及其對調(diào)節(jié)傷口愈合微環(huán)境的貢獻突出了它們在愈合中的重要性［38］。

KEGG通路分析結(jié)果中，桂枝茯苓丸抑制血小板活化的信號通路有11條（Plt;0.05）。首先，桂枝茯苓丸直接參與血小板活化，還通過VEGF信號通路、補體和凝血級聯(lián)、cGMP PKG信號通路等參與血小板活化過程?；罨难“遽尫叛軆?nèi)皮生長因子（VEGF），該因子向血管內(nèi)皮細胞（EC）發(fā)出信號，并在傷口愈合早期啟動血管生成的萌芽［39］。補體系統(tǒng)和凝血級聯(lián)是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，它們以炎癥因子為橋梁相互調(diào)節(jié)和影響。例如，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中，循環(huán)免疫復合物激活補體，導致補體片段的形成。血小板結(jié)合補體裂變產(chǎn)物可能誘導下游免疫介導的血小板活化，導致刺激后血小板聚集增強［40］。為了防止在正常情況下不必要的血小板活化并限制血管損傷部位的止血反應，從內(nèi)皮細胞釋放的一氧化氮（NO）通過激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（sGC）抑制血小板聚集，從而上調(diào) cGMP 和激活蛋白激酶 G（PKG），導致下游蛋白質(zhì)磷酸化，Ca2+ 水平減少，抑制整合素活化和顆粒分泌［41］。

綜上所述，桂枝茯苓丸抑制血小板活化的主要活性成分可能為槲皮素，通過作用于PTGS2、NOS3、RAF1、PTGS1等靶點，參與NO生物合成、蛋白質(zhì)結(jié)合等生物過程，以及VEGF信號通路、補體和凝血級聯(lián)、cGMP PKG等信號通路。本研究體現(xiàn)了中醫(yī)藥治療疾病的整體觀念，也為篩選抑制血小板活化藥物及相關作用機制提供參考，但網(wǎng)絡藥理學的預測存在一定局限性，有待后期臨床與動物試驗進一步證實。

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