摘要 采用組織塊分離法，從野生烏拉爾甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）的根部分離得到一株內(nèi)生真菌GG5-1，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為Neocosmospora rubicola。通過生長速率法對油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）和葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea）進(jìn)行抑菌活性評價，結(jié)果表明，烏拉爾甘草內(nèi)生真菌GG5-1大米發(fā)酵提取物在0.1 mg/mL對油菜菌核病菌有強(qiáng)烈的抑制效果，抑制率為（97.28±0.77）%。

關(guān)鍵詞 烏拉爾甘草；內(nèi)生真菌；分離鑒定；抑菌活性

中圖分類號 Q 93 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2025）05-0149-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.05.031

Isolation， Identification and Antibacterial Activity Evaluation of an Endophytic Fungus from Glycyrrhiza uralensis Fisch.

XIONG Cai-zhi1， CAO Jin-feng1， ZHAO Jiang-yuan2 et al

（1.Ningxia Normal University， Guyuan， Ningxia 756000; 2.Yunnan Institute of Microbiology， Yunnan University， Kunming， Yunnan 650091）

Abstract An endophytic fungal strain GG5-1 was isolated from the roots of Glycyrrhiza uralensis by the method of tissue-block isolation and identified by molecular biology as Neocosmospora rubicola. Bacteriostatic experiments on Sclerotinia sclerotiorum and Botrytis cinerea were conducted by the growth rate method，the results showed that rice fermentation extract of endophytic fungus GG5-1 from G. uralensis had a strong inhibitory effect against Sclerotinia sclerotiorum at 0.1 mg/mL， with an inhibition rate of （97.28±0.77）%.

Key words Glycyrrhiza uralensis Fisch.;Endophytic fungal;Isolation and identification;Antimicrobial activity

烏拉爾甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）為豆科（Leguminosae）蝶形花亞科（Papiliantae）甘草屬（Glycyrrhiza）多年生草本植物，被譽(yù)為“寧夏五寶”之一，是一種歷史悠久的珍貴藥材，主要分布于我國的東北、華北、西北各省（區(qū)），常生于干旱沙地、河岸砂質(zhì)地、山坡草地及鹽漬化土壤中［1］。目前國內(nèi)外對其研究主要在植物化學(xué)方面，主要成分為黃酮和三萜皂苷類化合物［2-4］，具有抗?jié)?、抗炎、解痙、抗氧化、抗病毒、抗癌、抗抑郁、保肝、祛痰、增強(qiáng)記憶力等生物活性［5-7］。

植物內(nèi)生真菌代表了一個復(fù)雜的微生物群落，與病原菌會使植物染病不同，它們在植物的內(nèi)部健康組織中定殖，與植物形成了一種互利共生的重要關(guān)系［8-9］。作為一種特殊生境的微生物，在長期的進(jìn)化過程中，內(nèi)生真菌可能會有著與宿主相關(guān)或特有的代謝途徑。在地球上的任何角落，只要有植物生活就有植物內(nèi)生真菌在植物內(nèi)定殖，這就決定了內(nèi)生真菌具有強(qiáng)大的生物合成能力，是一個極具潛力且龐大的微生物資源寶庫。另外，與植物資源不同，內(nèi)生真菌有著易于培養(yǎng)、生長速度快、可調(diào)控發(fā)酵條件等優(yōu)點(diǎn)，是一類可持續(xù)發(fā)展的生物資源。近年來學(xué)者們對烏拉爾甘草這一道地藥材的研究逐漸從植物本體轉(zhuǎn)向于其內(nèi)生真菌的研究，而對烏拉爾甘草內(nèi)生真菌的研究則主要集中于抑菌、抗氧化、抑制α-葡萄糖苷酶活性等方面。劉文杰等［10］從烏拉爾甘草中分離鑒定了135株內(nèi)生真菌，其中35株內(nèi)生真菌的代謝粗提物對金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌有廣譜的抑菌活性；楊明俊等［11］分離鑒定了36株烏拉爾甘草內(nèi)生真菌，部分菌絲體乙醇回流提取物、發(fā)酵液的乙酸乙酯相和正丁醇相具有抑菌、抗氧化、抑制α-葡萄糖苷酶等活性。盡管烏拉爾甘草內(nèi)生真菌以及其活性已有許多相關(guān)研究，但是對于烏拉爾甘草內(nèi)生真菌抗植物病原真菌活性的研究鮮見報道。該研究從烏拉爾甘草的根部分離鑒定了一株內(nèi)生真菌GG5-1，并初步研究其對2株重要植物病原真菌的抑菌活性，為后續(xù)進(jìn)一步開發(fā)烏拉爾甘草內(nèi)生真菌生物防治潛力、研究其次生代謝產(chǎn)物活性提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試材料。寧夏烏拉爾甘草采自寧夏中衛(wèi)市。

1.1.2 供試植物病原真菌。葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum），由云南大學(xué)云南省微生物研究所提供。

1.1.3 培養(yǎng)基。馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，氯化鈉 50 g，水1 000 mL；大米固體培養(yǎng)基：大米50 g，水50 mL。以上培養(yǎng)基使用前均經(jīng)過高壓滅菌鍋121 ℃、20 min滅菌。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 烏拉爾甘草內(nèi)生真菌的分離和純化。將采集到的新鮮寧夏烏拉爾甘草根部表面清洗干凈，用自來水沖洗 2 h，用濾紙吸干水分，備用。在超凈工作臺中，將備用的植物組織按文獻(xiàn)［12］改良的步驟操作：①用 75%乙醇浸泡1 min，無菌水沖洗4次；②用4% 次氯酸鈉浸泡 5 min，無菌水沖洗4次；③用75%乙醇漂洗30 s，無菌水沖洗4次；④以無菌濾紙片吸干水分。將上述表面消毒的組織用滅菌的手術(shù)刀分別切成 5 mm×5 mm×1 mm 的小塊，接種于配好的PDA 雙抗培養(yǎng)基上（含50 mg/L氨芐青霉素和50 mg/L硫酸鏈霉素），每個培養(yǎng)皿中接種 4 塊，28 ℃恒溫培養(yǎng)。待植物組織切口長出菌絲后用滅菌的竹簽挑取菌落尖端的菌絲，采用平板劃線法在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，純化后的菌種在-80 ℃下保存于25%甘油管中。

在處理、接種組織塊時，將一個PDA平板敞開放在超凈工作臺中，以檢驗(yàn)操作環(huán)境是否無菌。另外，取最后一次沖洗的無菌水200 μL均勻涂布在PDA平板上，并采用組織印跡法來驗(yàn)證植物組織表面消毒是否徹底。若上述培養(yǎng)皿未長出菌落，證明植株的表面消毒和環(huán)境的無菌是可靠的。

1.2.2 內(nèi)生真菌的分子生物學(xué)鑒定。將烏拉爾甘草內(nèi)生真菌GG5-1在PDA培養(yǎng)基上于28 ℃培養(yǎng)至快長滿平板，再用竹簽挑取菌絲體，按照真菌 DNA 提取試劑盒的方法進(jìn)行提取DNA。真菌的ITS基因序列PCR擴(kuò)增使用的通用引物ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）由擎科生物昆明分公司合成提供。其中PCR擴(kuò)增體系與程序按文獻(xiàn)中的方法［13］進(jìn)行，總體系為50 μL：Genomic DNA 1 μL，10×KOD buffer（含Mg2+）5 μL，dNTPs（2 mmol/L）5 μL，KOD DNA Polymerase（5 U/μL）1 μL，ITS4（10 μmol/L）1 μL，ITS5（10 μmol/L）1 μL，ddH2O 36 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃ 3 min，1個循環(huán)；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min，1個循環(huán)。PCR產(chǎn)物由擎科生物昆明分公司進(jìn)行純化與測序。將所得ITS序列在美國國立生物技術(shù)信息中心NCBI（National Center for Biotechnology Information）GenBank中進(jìn)行BLAST比對，用MEGA 7.0.26軟件中ClustalW功能進(jìn)行多序列比對，裁剪兩端未對齊序列，再用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 內(nèi)生真菌GG5-1的發(fā)酵培養(yǎng)與提取。將活化好的內(nèi)生真菌用6 mm打孔器打成菌餅，再接種于大米培養(yǎng)基（每瓶3塊菌餅），用恒溫培養(yǎng)箱28 ℃培養(yǎng)28 d。待發(fā)酵完成后，用甲醇超聲輔助提取3次，每次30 min得到甲醇提取物，再用水懸浮乙酸乙酯萃取3次得到內(nèi)生真菌GG5-1大米固體發(fā)酵提取物，并用甲醇配成10 mg/mL備用。

1.2.4

內(nèi)生真菌GG5-1發(fā)酵提取物的抗植物病原真菌試驗(yàn)。在超凈工作臺中，將0.2 mL的內(nèi)生真菌GG5-1發(fā)酵提取物加至已滅菌并冷卻至約50 ℃的20 mL馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基中，然后迅速搖勻制成終濃度為0.1 mg/mL的含藥培養(yǎng)基，再倒入平板冷卻得到含藥抗真菌活性測試平板。將活化好的植物病原真菌用6 mm的無菌打孔器制成直徑6 mm的菌餅，菌絲面朝下接種于含藥培養(yǎng)基上，倒扣于恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)?？瞻讓φ战M則使用不含藥的馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，試驗(yàn)組和空白對照組均進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。待空白對照組的植物病原真菌菌落長至平板的1/2時，用十字交叉法［14］測量菌落直徑，并按以下公式計算植物病原真菌生長抑菌率：

抑菌率=（對照組菌落直徑-試驗(yàn)組菌落直徑）/（對照組菌落直徑-菌餅直徑）×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 烏拉爾甘草內(nèi)生真菌GG5-1的分離鑒定

從一株健康的烏拉爾甘草的根部成功分離得到一株內(nèi)生真菌GG5-1（圖1）。將內(nèi)生真菌GG5-1測得的ITS序列在美國國立生物技術(shù)信息中心NCBI GenBank中BLAST比對后，下載相似度高的相關(guān)菌種ITS基因序列。使用MEGA 7.0.26軟件中的ClustalW功能進(jìn)行排序，將多序列比對后的序列裁剪掉兩端未對齊的序列，再用鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，參數(shù)設(shè)置為Bootstrap method檢驗(yàn)取樣進(jìn)行1 000次，矩陣距離使用Kimura 2-parameter model進(jìn)行計算，Gaps/Missing Data Treatment采用Complete deletion模型，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。從鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）可以看出，內(nèi)生真菌GG5-1與Neocosmospora rubicola CBS 101018（Accession No.NR_154227.1）聚為一簇，置信度為96%。通過BLAST比對分析與Neocosmospora rubicola CBS 101018的相似度為100%。最終通過分子生物學(xué)的鑒定，認(rèn)為內(nèi)生真菌GG5-1為子囊菌門（Ascomycota）盤菌亞門（Pezizomycotina）糞殼菌綱（Sordariomycetes）肉座菌亞綱（Hypocreomycetidae）肉座菌目（Hypocreales）叢赤殼科（Nectriaceae）鐮刀菌屬（Fusarium）的Neocosmospora rubicola。

2.2 烏拉爾甘草內(nèi)生真菌GG5-1發(fā)酵提取物的抑菌試驗(yàn)

用葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea）和油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）這2種重要的植物病原真菌作為目的病原菌，以菌絲生長速率法檢測了烏拉爾甘草內(nèi)生真菌GG5-1大米發(fā)酵提取物的抑菌活性。如圖3所示，烏拉爾甘草內(nèi)生真菌GG5-1大米發(fā)酵提取物對油菜菌核病菌的抑制效果最強(qiáng)，抑制率為（97.28±0.77）%，對葡萄灰霉病菌的抑制效果較弱，抑制率為（28.82±0.94）%。抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，烏拉爾甘草GG5-1大米發(fā)酵提取物對這2種重要植物病原真菌均有一定的拮抗作用，其中對油菜菌核病菌有強(qiáng)烈的抑制效果，而對葡萄灰霉病菌有弱的抑制效果。

3 討論與結(jié)論

農(nóng)作物的真菌病害可能導(dǎo)致作物產(chǎn)量和質(zhì)量大幅下降，威脅全球糧食安全［15］。傳統(tǒng)的化學(xué)合成農(nóng)藥一直是對抗植物真菌病害的有效方法，但是隨著農(nóng)藥的濫用使得“3R”問題（農(nóng)藥殘留Residue、有害生物再度猖獗Resurgence、生物抗藥性Resistance）日益顯著，對農(nóng)產(chǎn)品的安全和經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成了很大影響［16］。這就需要高效、低毒、環(huán)境友好的綠色殺菌劑來解決這一問題，其中天然來源的生物防治手段就是有效的方案之一［17-18］。內(nèi)生真菌作為一種特殊生境的微生物，可能有著獨(dú)特的代謝途徑產(chǎn)生各種生物活性物質(zhì)，具有很好的生物防治潛能［19-20］。因此，開發(fā)能夠拮抗植物病原真菌相關(guān)的植物內(nèi)生真菌資源對真菌病害的生物防治具有重要意義。

烏拉爾甘草作為寧夏地區(qū)的特色藥材，已有研究表明其內(nèi)生真菌具有較好且多樣的生物活性［21-23］，但對其拮抗植物病原真菌的內(nèi)生真菌資源研究還較少。該研究從烏拉爾甘草根部分離得到一株內(nèi)生真菌GG5-1，通過分子生物學(xué)手段以ITS基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹鑒定為Neocosmospora rubicola。對植物病原真菌的抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，內(nèi)生真菌GG5-1大米發(fā)酵提取物在0.1 mg/mL的給藥濃度下，對油菜菌核病菌有著強(qiáng)烈的抑制效果，抑制率達(dá)到了（97.28±0.77）%；對葡萄灰霉病菌有弱的抑制效果，抑制率為（28.82±0.94）%。由此可見，內(nèi)生真菌GG5-1對植物病原菌有著潛在的生物防治能力，具有一定的研究價值。

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基金項(xiàng)目 寧夏重點(diǎn)研發(fā)計劃項(xiàng)目（2023BEG03061）；寧夏自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2022AAC02049，2022AAC03297，2023AAC03355）；寧夏高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目（NYG2022073）。

作者簡介 熊財智（1999—），男，江西上饒人，碩士研究生，研究方向：植物內(nèi)生真菌。*通信作者，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究。

收稿日期 2024-02-29