摘要 采用株芽魔芋（A.mueller）、甜魔芋（A.paeoniifolius‘Yellow’）、滇魔芋（A.yunnesis）、勐海魔芋（A.kachinensis）、攸樂魔芋（A.yuleonsis）、梳毛魔芋（A.sinensis）、西盟（A.krausei）、A.asterostigmatus、白魔芋（A.albus）、花魔芋（A.konjac）、雜交魔芋等24個(gè)魔芋屬植物作為鑒別的種內(nèi)、種間植物。利用葉綠體基因trnL-trnF對(duì)樣本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果使用BioEdit進(jìn)行校對(duì)，其序列在NCBI比對(duì)，最后利用MEGA 8.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明：24種魔芋屬的DNA擴(kuò)增效率為100%，在NCBI的最高一致性在96.31%～100%，均屬于魔芋屬。表明trnL-trnF引物通用性好，特異性高，其引物可用于鑒別物種，分析其親緣關(guān)系，為研究魔芋雜交育種中親本選配提供參考。

關(guān)鍵詞 魔芋；trnL-trnF；系統(tǒng)進(jìn)化樹

中圖分類號(hào) S 632.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2025）05-0093-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.05.018

Identification of Core Germplasm Resources of Amorphophallus Based on trnL-trnF Gene Sequence

WANG Meng 3， YANG Chao-zhu 3， QIN Yu 3 et al

（1.Enshi Tujia amp;Miao Autonomous Prefecture Academy of Agricultural Sciences， Enshi， Hubei 445000;2.Engineering Technology Center of Konjac Seed amp; Seedlings in Hubei Province， Enshi， Hubei 445000;3.Western Hubei Comprehensive Experimental Station， Hubei Agricultural Science amp; Technology Innovation Center， Enshi， Hubei 445000）

Abstract 24 Amorphophallus plants such as A.mueller， A.pmuelleraeoniifolius‘Yellow’， A.yunnesis， A.kachinensis， A.yuleonsis， A.sinensis， A.krausei， A.asterostigmatus， A. albus， A. konjac， hybrid konjac were used as intraspecific and interspecific plants for identification.The extracted DNA was amplified by PCR with chloroplast gene trnL-trnF， and sequenced in the first generation of the two-terminal sequencing strategy.The sequencing results were compared and analyzed with BioEdit， and the sequences were compared on NCBI. Finally， the phylogenetic tree was constructed with MEGA 8.0. The results showed that the DNA amplification efficiency of 24 species of Amorphophallus was 100%， and the best identity in NCBI was 96.31%-100%，all belong to Amorphophallus. The results showed that the primers of trnL-trnF had good universality and high specificity， and the primers could be used to quickly identify species and analyze their genetic relationship， providing reference for the study of parental selection in konjac cross breeding.

Key words Konjac;trnL-trnF;Phylogenetic tree

魔芋屬（Amorphophallus）特色經(jīng)濟(jì)作物，其資源豐富，主要分布在亞洲中南半島和我國(guó)秦嶺以南及東南亞和南亞印度等地。在國(guó)內(nèi)有26種［1］，主要分布在海拔800～1 200 m的山地。魔芋分布廣，其資源的遺傳多樣性豐富［2-3］，區(qū)分魔芋親緣關(guān)系不僅對(duì)魔芋雜交育種有著重要作用，還可以避免魔芋產(chǎn)業(yè)發(fā)展的原材料使用出現(xiàn)混亂。但目前魔芋屬的分類主要是通過形態(tài)學(xué)區(qū)別，形態(tài)學(xué)區(qū)分對(duì)魔芋基礎(chǔ)研究要求較高，且易受外界環(huán)境的影響導(dǎo)致結(jié)果不精準(zhǔn)。DNA條形碼（DAN barcode）是物種鑒定和研究種間進(jìn)化關(guān)系可靠的手段，其結(jié)果可靠，被廣泛用于物種鑒別。

目前主要用的序列有ITS1、rbcL、matK、trnL-trnF、trnH-psbA。trnL-trnF序列是cp DNA的非編碼區(qū)，其進(jìn)化速率快，片段兩端存在保守序列，是易于設(shè)計(jì)，通用性好，特異性高等特點(diǎn)的引物，葉綠體基因trnL-trnF已在甘薯［4］、草莓［5］、枸杞［6］等作物的分子鑒定、親緣關(guān)系分析中廣泛應(yīng)用。Claudel等［7］利用ITS1、rbcL 、matK對(duì)157種魔芋屬植物進(jìn)行了分子系統(tǒng)發(fā)育分析。Zhao等［8］研究顯示，trnH-psbA能有效鑒別3種魔芋屬，但trnL-trnF的引物通用性比trnH-psbA低。筆者擬通過葉綠體trnl-trnH序列鑒別魔芋屬材料，分析其親緣關(guān)系，旨在為魔芋種質(zhì)資源鑒別提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試魔芋材料：株芽魔芋（A.mueller）、甜魔芋（A.paeoniifolius‘Yellow’）、滇魔芋（A.yunnesis）、勐海魔芋（A.kachinensis）、攸樂魔芋（A.yuleonsis）、梳毛魔芋（A.sinensis）、西盟（A.krausei）、A.asterostigmatus、白魔芋（A.albus）、花魔芋（A.konjac）、鄂魔芋1號(hào)（YuanZa No.1）、2018H-66*2018B-4、2014-38*Y121-242、2014-106*BD164、Y1H81*A.corrugatus、2022H-34*2022B-21。

試驗(yàn)樣品均取自恩施土家族苗族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院魔芋所種植圃，取健康、無病蟲害新鮮葉片，采集消毒后做好標(biāo)記，置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取方法。采用植物基因組DNA提取試劑盒 Plant Genomic DNA kit（天根生化科技有限公司，北京）改良后的方法［9］提取葉片DNA，植物樣品從冰箱取出后，迅速用乙醇雙面擦拭，取100 mg新鮮葉片置于2.0 mL離心管中，放入液氮罐裝入液氮，迅速用鐵質(zhì)圓柱頭類研磨，后續(xù)按照試劑盒的方法提取樣本DNA。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)。根據(jù)已知植物trnL-trnF序列，利用其保守位點(diǎn)和變異位點(diǎn)，用Primer Premier 5 軟件設(shè)計(jì)，委托武漢生工合成部合成引物，合成引物按要求擴(kuò)大10倍緩沖液。

1.2.3 PCR擴(kuò)增及電泳。

PCR反應(yīng)體系40 μL，包括13.8 μL ddH2O，3.0 μL Template，20.0 μL 2×Taq PCR Master Mix（采購(gòu)于TIANGEN公司），3.2 μL Prinmer。PCR產(chǎn)物采用第一代雙端測(cè)序，測(cè)序在武漢生工測(cè)序部完成。使用1.0%瓊脂糖凝膠液靜置30 min，倒入電泳槽中，用移液槍吸取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物4.0 μL，設(shè)置電泳（110 V），約50 min后取出并放置于凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行分析，比較后無雜帶且清晰時(shí)拍照保存圖像。

試驗(yàn)過程中所使用的儀器有恒溫水浴鍋（HH-4，壇市科信儀器廠），電泳儀（DYY-10C，北京市六一儀器廠），PCR儀（PCR System9700，Gene Company Limited基因有限公司），冷凍離心機(jī)（5417R，德國(guó)艾本德公司），凝膠成像系統(tǒng)（Gel Doc200，伯樂公司）。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析。

利用BioEdit對(duì)測(cè)序獲得的原始序列進(jìn)行檢查、拼接及校對(duì)，并將獲得的序列在NCBI Gen Bank 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比。比對(duì)后的序列使用MEGA 8.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)，將處理后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入 MEGA-X軟件，進(jìn)行 ClustalW對(duì)比，以鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。擴(kuò)增引物與擴(kuò)增程序：堿基序列為5′－GGGCAATCCTGAGCCAAATC-3′，3′－GGGACTTGAAACCTCACGAT-5′；反應(yīng)體系為40 μL，13.8 μL ddH2O，3.0 μL模板，20.0 μL Mix，1.6 μL引物；反應(yīng)條件為94 ℃ 4 min，94 ℃ 45 s， 55 ℃ 45 s，72 ℃ 5 min，35個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 擴(kuò)增

如圖1所示，采用trnL-trnF（長(zhǎng)度510 bp）在 魔芋樣本中均獲得了預(yù)期的擴(kuò)增條帶，擴(kuò)增成功率為 100%。24個(gè)樣本中包含株芽魔芋、甜魔芋、滇魔芋、勐海魔芋、攸樂魔芋、梳毛魔芋、西盟魔芋、白魔芋、A.asterostigmatus、鄂魔芋1號(hào)、花魔芋、田陽(yáng)魔芋12個(gè)魔芋種質(zhì)資源。

2.2 序列驗(yàn)證

PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序成功率為100%，測(cè)序后序列通過BioEdit和DNAMEN 8進(jìn)行校對(duì)，獲

得24條序列，采 用 NCBI（National Center for Biotechnology Information）平臺(tái)的BLAST 工具與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種最佳匹配度匹配。比對(duì)結(jié)果見表1，比對(duì)結(jié)果顯示，24條序列均屬于魔芋屬，A.konjac、2014-38*Y121-242、2014-106*BD164、YuanZa No.1最高一致性均為100%，其他材料最高一致性均在99.31%及以上，結(jié)果表明所使用引物是特異性高的有效擴(kuò)增引物（表1）。

2.3 親緣關(guān)系

24份魔芋屬材料親緣關(guān)系圖2所示，雜交魔芋和花魔芋、白魔芋的親緣關(guān)系較近，Y1H81*A corrugatus的特性更偏向白魔芋；A.asterostigmatus是由國(guó)外引進(jìn)，至今未命名的魔芋種，其親緣關(guān)系和西盟魔芋較近；西盟魔芋同花魔芋、白魔芋的親緣關(guān)系近，其特性相似；滇魔芋、攸樂魔芋、勐海魔芋與梳毛魔芋關(guān)系較近；株芽魔芋、甜魔芋的親緣關(guān)系差距較大，這可能是株芽魔芋種間差距大造成的。

3 結(jié)論與討論

魔芋在我國(guó)種質(zhì)資源豐富，且分布較廣。DNA條形碼技術(shù)不受環(huán)境影響，能快速、準(zhǔn)確地對(duì)物種進(jìn)行識(shí)別，為研究物種的進(jìn)化、遺傳變異、系統(tǒng)發(fā)育以及生物多樣性等提供理論依據(jù)，是魔芋屬種質(zhì)資源鑒定的有效技術(shù)。該研究利用葉綠體基因trnL-trnF，通過PCR、電泳成像、BLAST核苷酸序列比對(duì)分析手段，驗(yàn)證了trnL-trnF引物的有效性，建立24個(gè)魔芋屬的DNA條形碼。trnL-trnF引物序列在24個(gè)遺傳背景較大的魔芋樣本中均獲得了預(yù)期的擴(kuò)增條帶，擴(kuò)增成功率為 100%，雙向測(cè)序矯正后成功獲得24條魔芋屬的DNA條形碼。序列在NCBI比對(duì)后，最佳匹配度在96.31%～100%，表明trnL-trnF引物通用性強(qiáng)，特異性高，是鑒別魔芋屬的有效引物。親緣關(guān)系的研究可為魔芋屬種質(zhì)資源利用與創(chuàng)新提供依據(jù)，該研究中西盟魔芋和花魔芋、白魔芋親緣關(guān)系較近，這與李梅［10］的研究結(jié)果一致；攸樂魔芋與滇魔芋、勐海魔芋親緣關(guān)系較近，這與牛義等［11-13］研究結(jié)果一致。董坤等［14］利用ISSR分子標(biāo)記對(duì)魔芋材料進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示，勐海魔芋、珠芽魔芋、滇魔芋、甜魔芋各自聚為一類，但該研究中株芽魔芋的5個(gè)樣品的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這可能由于種間差異較大造成。魔芋作為特色的園藝植物，品種間形態(tài)特征變化較小，DNA條形碼技術(shù)鑒定品種十分重要，所做親緣關(guān)系圖可為魔芋雜交育種中親本選配、定向配組提供理論參考。

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基金項(xiàng)目 湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心項(xiàng)目（2016-620-000-001-062）。

作者簡(jiǎn)介 王孟（1992—），女，湖北建始人，農(nóng)藝師，碩士，從事魔芋高效栽培研究。

收稿日期 2024-02-21