摘要 基于流式細(xì)胞儀對(duì)植物染色體倍性鑒定的高效性和準(zhǔn)確性，利用流式細(xì)胞儀分2批次對(duì)60份廣西茶樹種質(zhì)資源的染色體倍性進(jìn)行鑒定分析，以期得到種質(zhì)資源準(zhǔn)確的染色體倍性信息，為茶樹育種提供科學(xué)依據(jù)。共鑒定出茶樹二倍體53份，三倍體6份，單倍體1份，未檢測(cè)到四倍體。而檢測(cè)到的單倍體茶樹180（龍脊古樹2號(hào)）在后續(xù)的茶樹染色體加倍獲得多倍體育種提供原始材料，為茶樹的多倍體育種和運(yùn)用研究提供參考。

關(guān)鍵詞 茶樹；種質(zhì)資源；染色體倍性；流式細(xì)胞術(shù)；鑒定

中圖分類號(hào) S 571.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2025）05-0010-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.05.003

Chromosome Ploidy Identification of 60 Germplasm Resources of Tea Plants in Guangxi

HUANG Shou-hui， PENG Jing-ru， WEN Li-xiang et al

（Gungaxi Subtropical Crops Research Institute， Nanning，Guangxi 530001）

Abstract Given the efficiency of flow cytometry in determining plant ploidy，in this study，flow cytometry was employed to identify the ploidy of 60 tea tree germplasm resources in Guangxi，aiming to obtain accurate ploidy data to support tea plant breeding. The result showed that a total of 53 diploids，6 triploids，and 1 haploid were identified，but no tetraploid was detected. The identified haploid tea tree 180（Longji Ancient Tea Tree No.2）will serve as the original material for subsequent tea plant chromosome doubling to produce polyploid breeding materials，thus providing a reference for the breeding and utilization of polyploid tea trees.

Key words Tea plant;Germplasm resource;Chromosome ploidy;Flow cytometry;Identification

茶樹［Camellia sinensis （L.）O. Ktze.］是山茶科［Theaceae Mirb.（1816）］山茶屬（Camellia L.）灌木，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，其葉片可制成茶，種子可用于榨油，其木因材質(zhì)緊實(shí)可用于雕刻。廣西地跨西南、華南茶區(qū)，是茶樹的次生起源中心，茶樹種質(zhì)資源豐富，遺傳多樣性大［1-3］。

茶樹是山茶屬相對(duì)原始的物種，染色體數(shù)目復(fù)雜，倍性多樣。細(xì)胞學(xué)研究表明，常見茶樹天然群體為二倍體植株（2x-30），但在自然群體中，不斷發(fā)現(xiàn)不同染色體數(shù)目的茶樹品種，三倍體（二倍體-3x-45）、四倍體（二倍體-4x-60）和非整倍體（二倍體+2）等均有［4］。由于遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜，這給茶樹多倍體開發(fā)利用帶來了難度［5］。

在茶樹染色體倍性研究和利用方面，前人開展了大量工作。20世紀(jì)60年代有利用花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)單倍體研究，卻鮮見有關(guān)茶樹單倍體植株的報(bào)道。報(bào)道較早的是1988年陳振光等［6］以“福云7號(hào)”花藥為材料誘導(dǎo)出了茶樹單倍體植株。屈文琦等［7］在分析我國(guó)32個(gè)具有代表性的無性系茶樹品種染色體倍性時(shí)發(fā)現(xiàn)，茶樹無性系品種以二倍體為主（約占81%），同時(shí)也發(fā)現(xiàn)三倍體是常見的多倍體染色體型。王守生等［8］在對(duì)四川野生大茶樹群體研究時(shí)發(fā)現(xiàn)了1株天然四倍體茶樹并編號(hào)為“9006”，在對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)其抗寒耐旱性弱，環(huán)境適應(yīng)性也較差。李素芳［9］于1996年鑒定分析了云南勐海、浙江、廣西桂林等地的100份茶樹種質(zhì)資源染色體倍性，結(jié)果顯示，98份是二倍體，只有2份存在染色體數(shù)目變異。李斌等［10］分析廣東、廣西茶區(qū)的10個(gè)茶樹品種染色體倍性時(shí)發(fā)現(xiàn)，廣東平遠(yuǎn)鍋篤茶品種中部分為三倍體。王春梅等［11］借助染色體核型分析技術(shù)研究了6種不同類型崇州枇杷茶樹的進(jìn)化和變異程度，為該品種的起源進(jìn)化提供了研究依據(jù)。李瑞林［12］基于FISH技術(shù)建立了茶樹倍性檢測(cè)體系，鑒定到“舒茶早”“白毫早”“福云6號(hào)”為二倍體，“政和大白茶”“杭州大葉”為三倍體，“上浮洲”愈傷組織為四倍體。眾多研究表明，抗逆性強(qiáng)，適應(yīng)性廣，內(nèi)含物豐富，光合效率高，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)旺盛，可育性低，發(fā)芽早，發(fā)芽率高等是茶樹多倍體的突出特點(diǎn)，這些特點(diǎn)是茶樹新品種培育的重要基礎(chǔ)資源［13］。

由于多倍體茶樹通常會(huì)表現(xiàn)出較強(qiáng)的生命力和優(yōu)良的農(nóng)藝性狀。因此，研究分析茶樹倍性，可以更好地了解茶樹遺傳背景特征，為進(jìn)行茶樹的雜交育種和基因分析提供原材料信息。目前，流式細(xì)胞儀已被廣泛用于動(dòng)植物的 DNA 含量檢測(cè)、倍性鑒定等研究中，其原理和步驟為：用染色劑對(duì)細(xì)胞染色體進(jìn)行染色，隨后上機(jī)檢測(cè)，依據(jù)熒光密度與DNA 含量成正比的關(guān)系，以獲取的峰值圖直觀地反映不同染色體倍性細(xì)胞所占的比例。筆者利用流式細(xì)胞儀，從分子水平上對(duì)種植于廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所茶樹種質(zhì)資源圃的60份茶樹種質(zhì)資源進(jìn)行染色體倍性鑒定和分析，以期為廣西茶樹的多倍體育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 茶樹種質(zhì)資源

所有茶樹種質(zhì)資源均來自廣西各產(chǎn)茶區(qū)保存于廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所茶樹種質(zhì)資源圃。取樣時(shí)間為8：00—9：00，取樣部位為剛展開的嫩葉。將采集的新鮮葉片，用打濕的濾紙包裹之后放入自封袋中并做好標(biāo)記，然后放入4 ℃泡沫箱密封保存待用。該試驗(yàn)共分2個(gè)批次采集，第1批采集20份樣本（表1），第2批采集40份樣本（表2），共采集樣本60份。2個(gè)批次測(cè)試的對(duì)照樣本均為二倍體金牡丹。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)儀器與試劑。

使用的倍性檢測(cè)儀器是CyFlow Space Flow Cytometer （Sysmex Partec， Muenster， Germany）；檢測(cè)試劑盒為Partec CyStain UV Precise P （Sysmex Corporation，USA）。

1.2.2 試驗(yàn)步驟。

取采集的新鮮茶樹葉片0.5 cm2，放于培養(yǎng)皿中央。取Partec CyStain UV Precise P核裂解液400 μL滴于茶樹葉片周圍，快速用鋒利刀片切成0.5 mm左右碎片（不可切得太碎或直接研磨，避免細(xì)胞核懸液雜質(zhì)過多和過于黏稠），從而提取出完整的細(xì)胞核，提取時(shí)間60 s。接著用30 μm濾網(wǎng)將培養(yǎng)皿中的液體過濾至樣品管中，隨后向樣品管中加入Partec CyStain UV Precise P染色液1 600 μL，染色30 s。接著進(jìn)行上機(jī)測(cè)試：調(diào)整Gain值和Threshold閾值，使標(biāo)樣（對(duì)照樣本）的熒光強(qiáng)度在100 （橫坐標(biāo)）或50，根據(jù)標(biāo)樣（對(duì)照樣本）的具體倍性確定。檢測(cè)速度為0.5～2.0 μL/s。確定標(biāo)樣（對(duì)照樣本）后，取出待測(cè)樣品，重復(fù)上述步驟。上機(jī)測(cè)試后，觀察測(cè)試樣品熒光強(qiáng)度的位置，與標(biāo)樣（對(duì)照樣本）進(jìn)行比較。

1.2.3 結(jié)果判定方法。

樣本峰值的熒光強(qiáng)度X-Mean （橫坐標(biāo)）與單個(gè)細(xì)胞DNA含量成正比，因此由各樣本X-Mean之間的比例關(guān)系可以初步判斷倍性。如，將對(duì)照的二倍體峰調(diào)整在橫坐標(biāo)200位置，則單倍體會(huì)出現(xiàn)在100，峰值在400位置為四倍體。圖形的縱坐標(biāo)代表細(xì)胞數(shù)量，峰的高低反映細(xì)胞比例的不同。隨后利用公式：倍性=待測(cè)樣本的峰值/參照物的峰值×參照物的倍性，根據(jù)四舍五入法確定待測(cè)樣品的倍性。樣本之間的誤差范圍在±5%以內(nèi)。

為防止儀器熱量散發(fā)或其他原因造成的數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確，每做一批樣本試驗(yàn)（8個(gè)樣本）都要用對(duì)照樣本進(jìn)行重新調(diào)試，以減少偏峰現(xiàn)象的出現(xiàn)，減少誤差，保證所測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)照樣本染色體的倍性測(cè)定

在2個(gè)批次測(cè)試試驗(yàn)中，均以已知二倍體品種 “金牡丹”作為對(duì)照樣本。在第1批次中，檢測(cè)調(diào)試電壓時(shí)把“金牡丹”的峰值調(diào)到100道的位置（圖1A），結(jié)果顯示“金牡丹”的熒光峰值為106.36；在第2批次中，檢測(cè)調(diào)試電壓時(shí)把 “金牡丹”的峰值調(diào)到200道的位置（圖1B），結(jié)果顯示 “金牡丹”的熒光峰值為190.80。細(xì)胞染色體的倍性與細(xì)胞核DNA含量成正比的關(guān)系，而細(xì)胞核的DNA含量又與熒光強(qiáng)度成正比，因此根據(jù)其熒光值與對(duì)照樣本的熒光峰值比對(duì)結(jié)果可以推測(cè)出待測(cè)樣品染色體的倍性。如果測(cè)試樣本的 G0/1 峰的峰值位置與已知二倍體“金牡丹”（圖1）的位置基本相仿，位置的偏移可能是由于不同品種基因組大小的差異造成，可以判斷其為二倍體。同樣，可以根據(jù)G0/1 峰比值初步判斷測(cè)試樣本是否為三倍體、四倍體。需要注意的是在測(cè)每一批樣品前都要用對(duì)照組進(jìn)行重新調(diào)試，從而減少偏峰現(xiàn)象的出現(xiàn)，減小誤差。

2.2 茶樹測(cè)試樣品染色體的倍性分析

通過對(duì)未知樣品的檢測(cè)，將獲得的峰值與對(duì)照樣品的峰值進(jìn)行比對(duì)，即可鑒定出待測(cè)樣品染色體倍性。在第1批樣本中，分別以田間編號(hào)4號(hào)（德保古樹1號(hào)）和21號(hào)（安塘種） 2個(gè)茶樹種質(zhì)資源為代表進(jìn)行分析說明（圖2），其他茶樹種質(zhì)資源的分析同理。與對(duì)照樣本（金牡丹）峰值（106.36）的比較可知，4號(hào)（德保古樹1號(hào)）和21號(hào)（安塘種）的峰值分別為109.24 （圖2A）和153.14 （圖2B），由此可知，4號(hào)（德保古樹1號(hào)）峰值與已知二倍體“金牡丹”相近，可以判斷其為二倍體。21號(hào)（安塘種）峰值與已知二倍體“金牡丹”峰值比值為 1.44，可以初步判斷出21號(hào)（安塘種）樣本為三倍體。在第2批樣本中，分別以田間編號(hào)150 （豐相平1號(hào)）和180（龍脊古樹2號(hào)）2個(gè)茶樹種質(zhì)資源為代表進(jìn)行分析說明（圖3），其他茶樹種質(zhì)資源的分析同理。根據(jù)與對(duì)照樣本“金牡丹”峰值（197.40）和云抗10號(hào)峰值（208.27）的比較，田間編號(hào)150 （豐相平1號(hào)）和180（龍脊古樹2號(hào)）的峰值分別為223.77 （圖3A）和97.36 （圖3B），由此可知，田間編號(hào)150 （豐相平1號(hào)）峰值與已知二倍體 “金牡丹”相近，可以判斷其為二倍體。田間編號(hào)180（龍脊古樹2號(hào)）峰值與已知二倍體 “金牡丹”峰值比值為 0.49，可以初步判斷出田間編號(hào)180（龍脊古樹2號(hào)）樣本為單倍體。

以此作為判斷依據(jù)，共檢測(cè)60份不同茶樹種質(zhì)資源染色體倍性，通過數(shù)據(jù)分析（表3、表4）可知，除了表3中1號(hào)（羅香1號(hào)）、3號(hào)（凌云白毫）、5號(hào)（寧明古樹1號(hào)）、20號(hào)（靈山茶園群體種）、21號(hào)（安塘種）和23號(hào)（姑遼古樹茶）6份種質(zhì)資源為三倍體，表4中180號(hào)（龍脊古樹2號(hào)）為單倍體種質(zhì)資源外，其余53份均為二倍體種質(zhì)資源。在這60份種質(zhì)資源中，未發(fā)現(xiàn)有四倍體茶樹種，三倍體所占比例也較少，大部分以二倍體茶樹為主（占88.3%）。雖然這60份樣本中未檢測(cè)到四倍體及以上的樣本，但檢測(cè)到1個(gè)單倍體種質(zhì)180號(hào)（龍脊古樹2號(hào)），在后續(xù)育種工作中，可以利用180號(hào)（龍脊古樹2號(hào)）為研究材料，經(jīng)過染色體加倍處理，即可在較短時(shí)間內(nèi)獲得茶樹純系，從而創(chuàng)制新的育種材料，這對(duì)于開展茶樹遺傳和茶樹育種研究均具有重要意義。

3 討論

多倍體是指?jìng)€(gè)體細(xì)胞中存在3個(gè)或3個(gè)以上染色體組的個(gè)體。茶樹多為二倍體（二倍體=2x=30），部分為三倍體、四倍體和混倍體［14］。多倍體茶樹一般表現(xiàn)出較高的產(chǎn)量和旺盛的生命力，具有良好的農(nóng)藝和經(jīng)濟(jì)性狀［15］。多倍體的茶樹種質(zhì)資源具有樹勢(shì)強(qiáng)，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)旺盛，葉肉肥厚，葉色濃綠，氣孔大，密度稀，發(fā)芽早，芽頭粗壯，持嫩性好，成品茶外形較粗大，葉片持水力強(qiáng)，耐寒性較強(qiáng)，表現(xiàn)不育性，結(jié)實(shí)率低的特點(diǎn)［4，16-17］，這對(duì)于以收獲芽葉為主要目的的茶樹來說，生產(chǎn)價(jià)值尤為突出。

通常鑒定植物多倍體有細(xì)胞學(xué)鑒定、染色體計(jì)數(shù)、形態(tài)學(xué)鑒定、分子水平鑒定等方法［18-19］。其中，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)植物的倍性是目前最快、最有效的分子水平鑒定方法之一。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)植物的倍性操作時(shí)，需要注意保證所用葉片新鮮，易于切碎。此外，不同樣本的染色時(shí)間不同，大多數(shù)植物樣本裂解和染色時(shí)間在30～60 s［20-21］，經(jīng)過摸索，獲得茶樹葉片最佳裂解時(shí)間為60 s，最佳染色時(shí)間為30 s。

該研究采用流式細(xì)胞儀共檢測(cè)了60份茶樹資源的染色體倍性，結(jié)果顯示，只有1號(hào)、3號(hào)、5號(hào)、20號(hào)、21號(hào)和23號(hào)6個(gè)材料為三倍體種質(zhì)資源，180號(hào)（龍脊古樹2號(hào)）為單倍體種質(zhì)資源，其余樣本均為二倍體，占88.3%。經(jīng)過茶樹農(nóng)藝性狀比較，發(fā)現(xiàn)這6個(gè)三倍體茶樹均表現(xiàn)出樹勢(shì)強(qiáng)，葉肉肥厚，葉色濃綠，氣孔大，密度稀，芽頭粗壯，持嫩性好，成品茶外形較粗大，耐寒性較強(qiáng)，結(jié)實(shí)率低，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)旺盛。符合多倍體性狀特點(diǎn)。

該研究中，筆者發(fā)現(xiàn)資源圃編號(hào)為153的資源有一個(gè)變異枝，相對(duì)母樹其表現(xiàn)出營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)旺盛，葉肉肥厚，葉色濃綠，氣孔大，密度稀，發(fā)芽早，芽頭粗壯，持嫩性好的農(nóng)藝特性，抽芽時(shí)間也較母樹早，為了探究其是否在染色體倍性上發(fā)生變異，分別對(duì)150個(gè)母樹和變異枝進(jìn)行采樣和測(cè)定，結(jié)果顯示，母樹測(cè)定熒光值為198.87，變異枝熒光值為209.90，兩者差異不大，均為二倍體。可見，自然條件下，茶樹雖然在表型上發(fā)生了疑似染色體倍性加倍的變異，但染色體倍性發(fā)生變異的概率極低，在茶樹育種中，要獲得多倍體材料仍需依靠人工染色體加倍誘導(dǎo)。

該研究發(fā)現(xiàn)了1個(gè)單倍體茶樹，即180號(hào)（龍脊古樹2號(hào)），其植株表型表現(xiàn)較為矮小，葉片卷曲，葉色深紫，葉片光滑，茸毛少。利用180號(hào)（龍脊古樹2號(hào)）為研究材料，經(jīng)過后續(xù)的染色體加倍技術(shù)處理，即可在較短時(shí)間內(nèi)獲得茶樹的純系材料，不僅有利于茶樹遺傳理論研究，增加選配雜交親本的預(yù)見性，還有利于培育后代性狀一致的有性系茶樹品種，發(fā)展優(yōu)勢(shì)雜種茶樹，提高誘變育種的效果，將為茶樹的遺傳研究提供有利條件，從而推動(dòng)廣西茶樹遺傳理論工作。

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基金項(xiàng)目 廣西重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（桂科AD18281068）；廣西重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（桂科AB19245006）；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系茶葉南寧綜合試驗(yàn)站（nycytxgxcxtd-18-06）； 廣西農(nóng)科院2021—2025年穩(wěn)定資助科研團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（桂科農(nóng)2021YT145）；科技先鋒隊(duì)“強(qiáng)農(nóng)富民”“六個(gè)一”專項(xiàng)行動(dòng)項(xiàng)目（桂農(nóng)科盟202206-2）。

作者簡(jiǎn)介 黃壽輝（1986—），男，廣西南寧人，高級(jí)農(nóng)藝師，碩士，從事作物栽培與育種研究。*通信作者，助理研究員，碩士，從事植物分子育種研究。

收稿日期 2024-09-19；修回日期 2024-10-13