關鍵詞：煙草；HSP70熱激蛋白：生物信息學；溫度脅迫；基因表達

中圖分類號：S572：Q786 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2025）02-0022-07

煙草（Nicotiana tabacum）是我國重要的經(jīng)濟作物。從大田中收獲的新鮮煙葉要成為可利用的具有優(yōu)良品質的商品煙葉，必須經(jīng)過合理的烘烤，而烘烤特性的好壞直接決定其經(jīng)濟價值的高低?？緹熒喜咳~組織結構致密，水分含量少，導致色素降解較慢且降解不完全。生產上一般通過延長烘烤時間或者升高烘烤溫度來使色素降解完全，但延長烘烤時間和提高溫度會導致煙葉細胞破裂，內含物流出并附著在煙葉上面，造成熱掛灰現(xiàn)象，給烤后產量、品質帶來極為不利的影響。因此，如何提高煙葉細胞在烘烤過程中的穩(wěn)定性至關重要。HSP70是熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）家族的重要成員，廣泛存在于植物細胞膜、細胞質、葉綠體、線粒體等組織中，其表達水平在溫度或其他脅迫條件刺激下會迅速增強，以使細胞免受脅迫和修復脅迫造成的傷害。HSP能夠提高植物耐熱性，一方面是通過增強HSP在生物膜上的富集防止膜脂受熱變性，從而增強細胞膜結構的穩(wěn)定性；另一方面是通過對變性蛋白的重組裝或折疊減少蛋白變性或修復已受損的蛋白，從而維持細胞的穩(wěn)定性。

HSP70-2是HSP70家族的成員之一，在辣椒、馬鈴薯上的研究表明其有響應溫度脅迫的功能，但在煙草上還未見相關研究報道。為明確HSP70-2在煙草上是否有響應溫度脅迫的功能，以及與溫度脅迫的關系，本研究通過生物信息學分析對NtHSP70-2基因的生物學功能進行預測，同時進行高溫和低溫脅迫處理，分析其表達量變化，明確溫度脅迫與NtHSP70-2表達的關系，以期為后續(xù)應用于提高煙葉細胞在烘烤過程中的穩(wěn)定性奠定理論基礎。

1材料與方法

1.1供試材料種植與脅迫處理

供試煙草品種為K326。選取籽粒飽滿的種子，于2023年3月28日在育苗盤中播種，5月22日煙苗長至六葉一心時移栽入人工氣候培養(yǎng)箱進行適應性培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為光照12h、晝夜溫度28/15℃。移栽4d后進行溫度脅迫處理，設置高溫38℃、低溫4℃，并于脅迫2、12、24h時對其根、莖、葉進行取樣保存，以不脅迫（0h）樣品為對照（CK）。本實驗所需材料及場地均由貴州省煙草品質研究重點實驗室提供。

1.2實驗方法

1.2.1 NtHSP70-2基因的克隆 對K326煙葉進行RNA提取，反轉錄得到cDNA，并以該cDNA為模板。利用SnapGene軟件設計引物5’-ATGGC-CGGGAAAGGAGAAGG-3’、5’-TTAGTCCACCTC-CTCAATCTTAGGACC-3’，引物合成委托擎科生物公司進行。參照文獻[17]的方法克隆NtHSP70-2基因的CDS序列。

1.2.2 NtHSP70-2基因生物信息學分析 NtH-SP70-2基因編碼蛋白的理化性質、結構域、二級結構、三級結構、亞細胞定位、跨膜預測、啟動子作用元件分析利用在線網(wǎng)站進行，具體信息見表1。

1.2.3 NtHSP70-2基因表達量測定 采用TriZol法對采集的煙苗各部位樣品進行RNA提取，參照RNAprep Pure Plant Kit（TIANGEN）的操作步驟進行。使用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix（TIANGEN）反轉錄試劑盒合成cDNA，所有操作步驟均在冰上完成，以防止RNA降解。利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）測定NtHSP70-2的表達量，每個樣品3次重復。使用的引物以及PCR反應體系分別見表2、表3。PCR反應程序為：94℃3min;95℃5s，56.9℃10s，72℃15s，40個循環(huán)。以L25基因作為內參基因，計算Ct值，然后采用2-^ΔΔCt法計算基因相對表達量。每個樣品進行3次技術重復。

2結果與分析

2.1 NtHSP70-2基因的克隆

NtHSP70-2基因的CDS開放閱讀框長度為1947bp，編碼648個氨基酸。運用NCBI設計引物，以煙草品種K326 cDNA為模板擴增CDS目標片段，進行膠回收后連接感受態(tài)，涂板篩選陽性克隆，測序發(fā)現(xiàn)擴增的目標片段與NCBI數(shù)據(jù)庫下載的目標序列一致（圖1）。

2.2 NtHSP70-2基因生物信息學分析

2.2.1NtHSP70-2編碼蛋白的理化性質及亞細胞定位分析利用ProtParam在線網(wǎng)站分析Nt HSP70-2基因編碼蛋白的理化性質，結果（表4）顯示，NtH-SP70-2蛋白的分子式為C₃₁₁₅H₅₀₁₂N₈₆₀O₉₉₁S₂₃，分子量為71.10 kDa，理論等電點（pI）為5.13，脂肪系數(shù)為83.13，為穩(wěn)定性蛋白。氨基酸成分分析結果（表5）表明，其富含酸性氨基酸（ Asp+Glu，100個）和強堿性氨基酸（Arg+Lys，82個）；丙氨酸（Ala）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、賴氨酸（Lys）含量較高，分別為8.9%、8.3%、8.2%、8.2%，色氨酸（Trp）、組氨酸（His）含量較低，分別為0.5%和0.8%。蛋白親疏水性預測表明，平均親水性指數(shù)為-0.403，且在氨基酸組成上也是親水性氨基酸的數(shù)量多于疏水性氨基酸，因此該蛋白為親水性蛋白。

亞細胞定位分析結果顯示，NtHSP70-2蛋白定位于線粒體中（表4），屬于線粒體sHSP。線粒體sHSP在非生物脅迫下通常可以重組裝受損蛋白，以此對細胞發(fā)揮保護作用。

2.2.2 NtHSP70-2蛋白結構分析 采用HMME數(shù)據(jù)庫對NtHSP70-2保守結構域和跨膜結構進行分析，結果顯示：NtHSP70-2不存在跨膜結構域；只有一個保守結構域（圖2A），位于第9位至第618位氨基酸，而且在第521位到第541位氨基酸間存在卷曲螺旋結構，屬于HSP70超家族。

利用PRABI對NtHSP70-2蛋白的二級結構進行在線預測，結果（圖2B）發(fā)現(xiàn)該蛋白二級結構包含α-螺旋（alpha helix）、無規(guī)卷曲（random coil）、延伸鏈（extended strand）和β-轉角（betaturn），分別占42.59%、31.64%、18.21和7.56%。利用UNIPROT對NtHSP70-2三級結構進行分析，結果如圖2C所示，表明該蛋白與辣椒CaHSP70-2蛋白結構相似，推測其與CaHSP70-2有相似的功能。

2.2.3 NtHSP70-2基因啟動子順式作用元件分析 啟動子元件是影響基因表達的重要因素之一，對啟動子元件進行分析有助于挖掘基因的功能和表達調控機制。通過PlantCARE數(shù)據(jù)庫，對NtHSP70-2基因起始密碼子上游2000bp啟動子序列進行分析，結果（表6）表明，Nt HSP70-2基因啟動子序列除含有TATA-Box、CCAAT基本元件外，還存在非生物脅迫響應元件和激素響應元件，包括赤霉素響應元件（P-box）、茉莉酸響應元件（CGTCA-motif）、脫落酸反應性作用元件（ABRE）、應激響應元件（STER）、干旱響應相關元件（MYB），以及響應低溫、高鹽、干旱脅迫的順式作用元件（DRE core）和響應逆境脅迫的元件（MYB-like sequence）。其中STER、ABRE、DREcore、MYB-like sequence、CGTCA-motif等順式作用元件都可以響應溫度脅迫，因此推測NtHSP70-2基因可以響應溫度脅迫。

2.2.4 NtHSP70-2蛋白同源序列比對 煙草是茄科作物，因此我們從茄科作物數(shù)據(jù)庫下載了辣椒、番茄、茄子、馬鈴薯的HSP70-2蛋白序列，利用DNAMAN將煙草NtHSP70-2與這些作物的HSP70-2蛋白進行同源序列比對，結果（圖3）表明，NtHSP70-2序列與辣椒、馬鈴薯、番茄、茄子的HSP70-2序列相似度分別為94.70%、94.70%、93.75%、94.40%，相似性較高，推測它們可能有著相似的功能。

2.3不同溫度脅迫下NtHSP70-2基因的組織表達分析

對高溫和低溫脅迫下煙苗根、莖、葉中Nt H-SP70-2的相對表達量進行測定，結果（圖4）表明：NtHSP70-2基因在煙苗根、莖、葉中均有表達，葉中的表達量最高，其次是莖，根中的表達量最低：38℃高溫和4℃低溫脅迫均能誘導NtH-SP70-2上調表達，且在根、莖、葉中的變化趨勢一致，均在處理12h時達到最高，且高溫脅迫下的上調幅度高于低溫脅迫。推測NtHSP70-2基因可能在提高煙草耐熱性和抗寒性方面發(fā)揮重要作用。

3討論與結論

煙草是我國重要的經(jīng)濟作物，煙草產業(yè)在我國國民經(jīng)濟中占據(jù)重要地位。在實際生產中，由于上部煙葉組織結構致密，烘烤過程中常常出現(xiàn)色素降解不完全的現(xiàn)象，而采用傳統(tǒng)延長烘烤時間或者升高溫度的方法又會導致細胞破裂而形成掛灰煙。因此，提高煙葉對溫度的耐受性對其烤后品質與產量的提高有著重要的意義。

HSP70廣泛存在于植物中，現(xiàn)已在擬南芥中鑒定出19個HSP70家族成員，在玉米中鑒定出32個HSP70家族成員，在煙草中鑒定出61個HSP70家族成員。通過對這些物種HSP70成員的鑒定發(fā)現(xiàn)，它們大多屬于酸性蛋白質，定位于細胞質、內質網(wǎng)、葉綠體、線粒體中，啟動子區(qū)都有響應溫度脅迫的順勢作用元件STER、ABRE、DRE core、MYB-like等。本研究也發(fā)現(xiàn)NtHSP70-2是酸性蛋白，定位于線粒體中，啟動子區(qū)包含STER、ABRE、DRE core、MYB-like sequence等順式作用元件，說明NtHSP70-2可能也具有響應溫度脅迫的功能；同源序列比對結果表明，NtHSP70-2與同屬茄科的辣椒、馬鈴薯、番茄、茄子HSP70-2序列相似性較高，相似度在93.75%～94.70%之間。前人對番茄、茄子的研究已發(fā)現(xiàn)HSP70具有響應溫度脅迫的功能，因此推測NtHSP70可能也在提高煙草對溫度脅迫的耐受性上發(fā)揮重要作用。

前人研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫下，百合LIHSP70表達量迅速增加，可以提高植株對高溫的耐受性；對萵苣幼苗進行高溫脅迫，其Hsp70表達量迅速增加；低溫脅迫下，小桐子JcHsp70s基因表達量顯著上升，脅迫48h后JcHsp70-8、JcH-sp70-15基因表達量相較于24h時有所下降；蠟梅花E-CpHSP70-1基因過表達可提高蠟梅植株的耐熱性；熱和冷脅迫均可以提高玉米HSP70基因表達量。本研究結果表明，38℃高溫和4℃低溫脅迫下，煙草根、莖、葉中的NtH-SP70-2基因表達量迅速增加，在處理12h時達到最高，之后有所降低，總體趨勢與前人研究一致，但表達量達到最高的時間點與前人研究不一致，這可能是不同作物HSP基因間的差異造成的。

綜合來看，NtHSP70-2蛋白是酸性穩(wěn)定蛋白，定位于線粒體，不存在跨膜結構；NtHSP70-2啟動子區(qū)含有多種溫度響應順式元件，而且在煙苗根、莖、葉中的表達均受高、低溫脅迫誘導上調，推測其可以響應溫度脅迫，有助于提高煙草對溫度脅迫的耐受性。另外，田間收獲的煙葉需要烘烤才能發(fā)揮商品屬性，而烘烤特性反映的是烘烤過程中煙葉水分和色素的變化。HSP70在其他作物上有調控水分和色素的功能，NtH-SP70-2基因能夠響應溫度脅迫，其是否也具有調控煙葉烘烤過程中色素與水分變化的功能，后續(xù)可通過創(chuàng)制該基因過表達和敲除突變體來進一步驗證。