DOI：10.3969/j.issn.10001565.2025.02.008

摘" 要：以4-溴二苯甲酮、4，4′-二甲氧基二苯甲酮、對硝基芐溴（Br-BNO2）和疊氮基乳糖（LT）等為原料，經(jīng)親核取代、鈴木偶聯(lián)和click反應等構建了一種四苯乙烯（TPE）為骨架，并能高效產(chǎn)生活性氧（ROS）的光動力學治療（PDT）試劑LT-TPE-DB-BNO2. 采用分光光度法和共聚焦熒光顯微鏡探究LT-TPE-DB-BNO2在血清和不同pH值溶液中的穩(wěn)定性及細胞內外產(chǎn)生ROS的能力；利用MTT法和活死細胞雙染法測定其對HeLa與BRL-3A細胞活力的影響. 結果表明： 在不同pH值溶液及血清中LT-TPE-DB-BNO2表現(xiàn)出優(yōu)良的穩(wěn)定性；在黑暗條件下，LT-TPE-DB-BNO2對HeLa和BRL-3A細胞的活力影響很??；在氙燈輻照下，LT-TPE-DB-BNO2高效產(chǎn)生ROS，使HeLa細胞的活力下降88.3%，表明LT-TPE-DB-BNO2是高效的PDT試劑.

關鍵詞： 四苯乙烯骨架；光動力學治療試劑；抗腫瘤活性

中圖分類號：O632.6""" 文獻標志碼：A""" 文章編號：10001565（2025）02017609

Synthesis and in vitro antitumor activity of photodynamic therapy reagent based on tetraphene skeleton

FANG Kexin， LIU Haitong， WANG Shuxiang

（Key Laboratory of Medicinal Chemistry and Molecular Diagnosis Ministry of Education， College of Chemistry and Materials Science， Hebei University， Baoding 071000， China）

Abstract： A photodynamic therapy （PDT） reagent， LT-TPE-DB-BNO2 for reactive oxygen species （ROS） generation based on tetraphene （TPE）， was synthesized from 4-bromobenzoylbenzene， 4，4’-dimethoxybenzophenone， p-nitrobenzyl bromide （Br-BNO2） and azide lactose （LT） by nucleophilic substitution， suzuki coupling and click reaction. The stability of LT-TPE-DB-BNO2 in serum and at different pH value， and the ability of ROS generation were investigated by spectrophotometry and confocal fluorescence microscopy. The effects of LT-TPE-DB-BNO2 on the viability of HeLa and BRL-3A cells were investigated by MTT method and live and dead cell double staining method. The results showed that LT-TPE-DB-BNO2 was stable in serum and at different pH value. In the dark condition，it had a little effect on the activity of HeLa and BRL-3A cells. Under irradiation by xenon lamp， ROS was produced by LT-TPE-DB-BNO2， and the activity of HeLa cells was reduced by 88.3%， indicating that LT-TPE-DB-BNO2 is a highly efficient PDT reagent.

Key words： tetraphene skeleton; photodynamic therapy （PDT） reagent; antitumor activity

收稿日期：20241101;修回日期：20241212

基金項目：

國家自然科學基金資助項目（22177026）

第一作者：房可欣（1999—），男，河北大學在讀碩士研究生，主要從事抗腫瘤藥物研究. E-mail：472415134@qq.com

通信作者：王書香（1965—），男，河北大學教授， 博士，博士生導師，主要從事抗腫瘤藥物研究. E-mail：wsx@hbu.edu.cn

癌癥是威脅人類健康的重大疾病之一，光動力學治療（PDT）是一種新穎的非侵入性、無創(chuàng)治療方法. PDT通過光敏劑在光照下與氧氣作用產(chǎn)生活性氧（ROS），從而殺滅腫瘤細胞，因其創(chuàng)傷輕、副作用小和不易產(chǎn)生耐藥性

等優(yōu)點備受關注［1］. 傳統(tǒng)的光敏劑在水介質中因π-π堆積發(fā)生淬滅導致產(chǎn)生ROS的效率降低，限制了PDT臨床效果［2-3］. 因此，開發(fā)具有聚集誘導發(fā)光（AIE）效應的光敏劑，可有效解決傳統(tǒng)光敏劑在水介質中產(chǎn)生ROS效果差的問題，為提高PDT的治療效果和推動其臨床應用提供了一個新途徑［4］.但是，此類PDT試劑對腫瘤細胞沒有選擇性，對正常細胞也有較強的光毒性.

為此，以4，4′-二甲氧基二苯甲酮、4-溴二苯甲酮、對硝基芐溴（Br-BNO2）和疊氮基乳糖（LT）等為原料，構建了一種四苯乙烯（TPE）為骨架，并能高效產(chǎn)生ROS的PDT試劑（LT-TPE-DB-BNO2）.通過在TPE骨架上引入2個甲氧基作電子供體、氰基和硝基作電子接受體，形成D-A體系，有利于LT-TPE-DB-BNO2產(chǎn)生ROS，利用LT增加其生物相容性，利用-BNO2基團提高PDT試劑的選擇性，降低其對正常細胞的毒副作用. 采用分光光度法和共聚焦熒光顯微鏡測定LT-TPE-DB-BNO2在血清和不同pH值溶液中的吸光度變化，以探究生理環(huán)境對其穩(wěn)定性的影響，以及胞內外產(chǎn)生ROS的能力，采用活死細胞雙染法和MTT法探究LT-TPE-DB-BNO2對BRL-3A和HeLa細胞活力的影響，為腫瘤的PDT治療提供新思路.

1 "實驗部分

1.1" 試劑與儀器

合成過程中所用試劑與溶劑均為分析純. Bruker AVANCE 600核磁共振波譜儀（德國Bruker）；UV-3600紫外可見分光光度計（日本SANYO公司）；Apex Ultra高分辨質譜儀（Bruker Daltonik）；FS5熒光光譜儀（Edinburgh Instruments）；M4多功能酶標儀（美國Molecular Devices）.

1.2" LT-TPE-DB-BNO2的合成

按圖1所示路線，經(jīng)親核取代、鈴木偶聯(lián)和click反應，制備PDT試劑LT-TPE-DB-BNO2.

1.3" LT-TPE-DB-BNO2的紫外可見及熒光光譜測定

將6.84 mg的LT-TPE-DB-BNO2溶于THF和H2O（體積比1∶1）的混合液，配成1 mmol/L的母液.用PBS（pH=7.4）緩沖液稀釋成10 μmol/L溶液，測定其紫外可見和熒光光譜.

1.4" LT-TPE-DB-BNO2的穩(wěn)定性測定

1.4.1" LT-TPE-DB-BNO2在血清中的穩(wěn)定性

將0.5 mL濃度為1 mmol/L的LT-TPE-DB-BNO2溶液和24.5 mL的PBS（pH=7.4）緩沖液與25.0 mL體積分數(shù)為10%的新生胎牛血清混合，得到10 μmol/L的LT-TPE-DB-BNO2溶液，黑暗條件下，分別孵育0、1、2、3、4、5、6、7、8 h后，測定其紫外可見光譜和吸光度.

1.4.2" LT-TPE-DB-BNO2在不同pH溶液的穩(wěn)定性

用pH為2～8的磷酸氫二鈉-檸檬酸和pH為9～12的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液配制LT-TPE-DB-BNO2（10 μmol/L）溶液，測定其在不同pH溶液的紫外可見光譜和吸光度.

1.5" LT-TPE-DB-BNO2的光動力學性質測定

1.5.1" 胞外產(chǎn)生ROS能力

將164.15 mg的9，10-蒽二基-雙（亞甲基）二甲酸（ABDA）用二甲基亞砜（DMSO）溶解并配成40 mmol/L的ABDA溶液. 用DMSO溶解55.32 mg的LT-TPE-DB-BNO2，配置成4 mmol/L的母液. 分別將0.25 mL的ABDA和LT-TPE-DB-BNO2母液混合，用PBS（pH=7.4）緩沖液定容至100 mL，用氙燈（0.1 W/cm2）照射0、20、40、60、80、100、120 s后，測定其紫外吸收光譜和吸光度.

1.5.2" 胞內產(chǎn)生ROS能力

將HeLa細胞在黑暗條件下孵育24 h，棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液清洗2次，加入100 μL 10 μmol/L的LT-TPE-DB-BNO2溶液，培養(yǎng)箱中孵育4 h后，加入10 μL的2′，7′-二氯熒光素二乙酸酯（10 μmol/L），再孵育20 min，除去培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次，用氙燈（0.1 W/cm2）輻照1 min，測定其熒光強度（λex=488 nm，λem=510～560 nm）.

1.6" 細胞活力的測定

將90 μL的HeLa細胞懸液（2×104/mL）接種于96孔板，孵育24 h. 取出，吸出培養(yǎng)基，加入100 μL濃度為0、0.1、1、2、5、10 μmol/L的LT-TPE-DB-BNO2溶液，孵育6 h，用氙燈（0.1 W/cm2）輻照5 min，再孵育24 h.取出，加入MTT溶液（終濃度為0.5 μg/mL），再孵育4 h.取出，去掉液體，加100 μL的DMSO，震蕩，測定570 nm處的吸光度.

按上述方法測定在黑暗條件下BRL-3A細胞的活力，以及用氙燈輻照0、1、3、5、7 min時BRL-3A和HeLa細胞的活力.

1.7" 活死細胞雙染實驗

將2 mL的HeLa細胞懸液（3×104/mL）置于培養(yǎng)箱中孵育24 h. 待細胞貼壁，取出，吸出培養(yǎng)基，加入2 mL的LT-TPE-DB-BNO2（10 μmol/L）溶液，孵育6 h，取出，用氙燈（0.1 W/cm2）輻照5 min，再孵育18 h. 收集細胞，PBS清洗，胰酶消化. 使用含血清培養(yǎng)基終止消化后，棄上清液（重復2次），加200 μL的Calcein-AM染料，在黑暗條件下孵育15 min，離心，棄上清液，加入200 μL的PI染料，在黑暗條件下孵育5 min，離心，棄上清液，PBS洗滌，用共聚焦熒光成像法對活死細胞進行檢測. 按同樣方法檢測在黑暗條件下HeLa細胞的活力.

2" 結果與討論

2.1" LT-TPE-DB-BNO2及其中間體的結構表征

采用NMR、HRMS等方法對LT-TPE-DB-BNO2及中間體的結構進行表征.

3-溴-4-（p-硝基芐氧基）苯甲醛 （1）"" 將2.00 g 3-溴-4-羥基苯甲醛、15 mL乙腈、2.36 g 4-硝基溴化芐和2.06 g K2CO3混合，回流3 h. 冷卻，過濾，柱層析（VPE∶VEA=2∶1），

得白色固體2.95 g（產(chǎn)率88.5%），即化合物1. 熔點162.3～163.7 ℃.1H NMR （CDCl3， 600 MHz） δ：9.88 （s， 1 H）， 8.30 （d， J=8.4 Hz， 2 H）， 8.15 （d， J=1.8 Hz， 1 H）， 7.83 （dd， J= 8.4， 1.8 Hz， 1 H）， 7.70 （d， J=8.4 Hz， 2 H）， 7.05 （d， J=8.4 Hz， 1 H）， 5.36 （s， 2 H）. 13C NMR （CDCl3， 150 MHz）δ： 190.48， 158.65， 147.18， 143.68， 134.02， 131.09， 131.00， 128.02， 123.70， 114.05， 111.88， 69.36. HRMS： C14H10BrNNaO4計算值357.968 5，實驗值357.968 1.

2′-（p-硝基芐氧基）- 5′-甲酰基-1，1′-聯(lián)苯-2-羧酸 （2）" 將1.00 g化合物1、0.69 g 4-乙?；脚鹚?、1.25 g NaHCO3、0.69 g Pd（Ph3）4、40 mL DMF和10 mL水混合，氮氣氛下，120 ℃反應2 h. 冷卻，DCM萃取，水洗，干燥，蒸除溶劑. 加入4 mL的1，4-二氧六環(huán)和20 mL體積分數(shù)30％的硫酸溶液，90 ℃反應12 h. 冷卻，調節(jié)pH值至6，DCM萃取，水洗，干燥，蒸除溶劑，柱層析（VDCM∶VMeOH=10∶1），

得棕色固體0.45 g（產(chǎn)率71.1%），即化合物2. 熔點125.1～125.7 ℃. 1H NMR （DMSO-d6，600 MHz） δ： 12.63 （s， 1 H）， 9.94 （s， 1 H）， 8.18 （d， J=8.8 Hz， 2 H）， 7.93～7.91 （m， 2 H）， 7.74 （s， 1 H）， 7.66 （t， J=7.2 Hz， 1 H）， 7.54～7.51 （m， 3 H）， 7.39 （d， J=7.2 Hz， 1 H）， 7.27 （d， J=8.6 Hz， 1 H）， 5.36 （s， 2 H）. 13C NMR （DMSO-d6， 150 MHz） δ： 191.43， 159.97， 146.82， 144.50， 136.56， 133.20， 130.98， 130.74， 130.62， 129.55， 129.46， 129.20， 127.93， 127.28， 123.33， 112.21， 68.68， 62.83， 48.57. HRMS： C21H15NNaO6計算值400.079 2，實驗值400.079 8.

（E）-5′-（3-（4′-（2，2-二（p-甲氧基苯基）-1-苯乙烯基）-4-（1，1′-聯(lián)苯））-4，4-二氰基丁基-1，3-二烯-1-基）-2′-（p-硝基芐氧基）-1，1′-聯(lián)苯-2-羧酸（6）" 將1.50 g 4，4′-二甲氧基二苯甲酮和2.10 g 4-溴二苯甲酮溶于60 mL THF，冰水浴，氯氣氛下，加入3.39 mL TiCl4和4.05 g Zn粉，回流12 h. 用水淬滅后，DCM萃取，干燥，過濾，柱層析（VPE∶VEA=50∶1），得白色固體0.54 g（產(chǎn)率18.6%），即4，4′-（2-（4-溴苯基）-2-苯乙烯）-1，1-二甲氧基苯［5］（3）. 將1.00 g化合物3、0.42 g 4-乙酰基苯硼酸、0.89 g碳酸氫鈉、0.49 g Pd（Ph3）4、80 mL DMF/H2O（VDMF∶VH2O=1∶1）混合，氮氣氛下，120 ℃攪拌反應2 h. 冷卻，DCM萃取，水洗，干燥，過濾，柱層析（VPE∶VEA=5∶1），得黃色固體0.90 g（產(chǎn)率83.5%），即4′-（2，2-二（4-甲氧基苯基）-1-苯乙烯基）-4-（1，1′-聯(lián)苯）-1-酮［5］ （4）. 將0.50 g化合物4、0.65 g丙二腈、1.13 g乙酸銨、5 g硅膠混合，100 ℃反應5 h. 柱層析（VPE∶VEA=5∶1），得黃色固體0.31 g（產(chǎn)率56.7%），即2-（1-（4′–（2，2-二（4-甲氧基苯基）-1-苯基亞甲基）-4-（1，1′-聯(lián)苯）亞乙基）丙二腈［5］ （5）. 將0.50 g化合物5、0.44 g化合物2和7.6 mg哌啶溶于25 mL異丙醇，70 ℃反應24 h.冷卻，過濾，柱層析（VDCM∶VMeOH=10∶1），

得橙紅色固體0.61 g（產(chǎn)率74.2%），即化合物6. 熔點：167.8～168.8 ℃. 1H NMR （DMSO-d6， 600 MHz） δ： 8.15 （d， J=8.4 Hz， 2 H）， 7.86 （d， J=7.8 Hz， 2 H）， 7.55 （d， J=8.4 Hz， 3 H）， 7.47 （s， 1 H）， 7.42 （d， J=15.6 Hz， 1 H）， 7.29 （s， 2 H）， 7.18 （s， 1 H）， 7.17 （d， J=15.6 Hz， 1 H）， 7.12 （t， J=7.8 Hz， 2 H）， 7.08 （d， J=8.4 Hz， 2 H）， 7.01 （d， J=8.4 Hz， 2 H）， 6.99～6.93 （m， 4 H）， 6.89 （d， J=8.4 Hz， 2 H）， 6.73 （d， J=8.4 Hz， 2 H）， 6.71 （d， J=8.4 Hz， 2 H）， 5.28 （s， 2 H）， 3.69 （d， J=5.4 Hz， 6 H）. 13C NMR （DMSO-d6， 150 MHz） δ： 171.62， 171.08， 158.28， 158.22， 157.81， 148.54， 147.53， 144.63， 144.11， 143.65， 143.31， 140.82， 138.53， 138.47， 136.81， 136.26， 136.22， 133.16， 132.66， 132.62， 132.10， 131.73， 131.70， 131.45， 130.72， 130.47， 130.38， 129.53， 129.37， 128.20， 128.14， 127.82， 127.25， 127.16， 126.34， 126.28， 123.72， 123.08， 113.76， 113.19， 113.07， 112.31， 80.81， 69.23， 55.14， 55.12. HRMS： C60H43N3NaO7 計算值940.299 3，實驗值940.299 4.

（E）-2-丙炔基-5′-（3-（4′-（2，2-二（4-甲氧基苯基）-1-苯乙烯基）-4-（1，1′-聯(lián)苯基））-4，4-二氰基丁基-1，3-二烯-1-基）-2′-（4-硝基芐基氧基）-4-（1，1′-聯(lián)苯）-2-羧酸甲酯 （7）" 將0.40 g化合物6、0.08 g溴丙炔、0.09 g K2CO3和20 mL乙腈混合，氮氣氛下，室溫攪拌12 h. 過濾，柱層析（VDCM ∶VMeOH=20∶1），

得紅色固體0.35 g（產(chǎn)率82.8%），即化合物7. 熔點：124.0～125.1 ℃. 1H NMR （DMSO-d6， 600 MHz） δ： 8.17 （d， J=8.4 Hz， 2 H）， 7.88 （d， J=7.8 Hz， 3 H）， 7.76 （d， J=8.4 Hz，1 H）， 7.69 （t， J=7.8 Hz， 1 H），7.65 （s， 1 H）， 7.62 （d， J=8.4 Hz， 2 H）， 7.58～7.53 （m， 3 H）， 7.46 （d， J=8.4 Hz， 2 H）， 7.41 （d， J=7.2 Hz， 1 H）， 7.18～7.16 （m， 2 H）， 7.18 （d， J=15.6 Hz， 1 H）， 7.12 （t， J=7.2 Hz， 1 H）， 7.09 （d， J=8.4 Hz， 2 H）， 7.03～7.01 （m， 3 H）， 6.94 （d， J=8.4 Hz， 2 H）， 6.89 （d， J=9.0 Hz， 2 H）， 6.73 （d， J=8.4 Hz， 2 H）， 6.71 （d， J=8.4 Hz， 2 H）， 5.29 （s， 2 H）， 4.66 （s， 2 H）， 3.69 （d， J=3.6 Hz， 6 H）， 3.45 （s， 1 H）. 13C NMR （DMSO-d6， 150 MHz） δ： 171.08， 166.08， 158.30， 158.23， 157.81， 148.67， 147.58， 144.62， 144.11， 143.63， 143.42， 140.83， 138.53， 138.24， 136.82， 136.25， 136.21， 132.67， 132.64， 132.61， 132.09， 131.79， 131.45， 130.69， 130.32， 130.23， 129.84， 129.52， 128.15， 128.10， 127.81， 127.24， 127.03， 126.33， 126.27， 123.77， 123.03， 113.76， 113.18， 113.07， 112.33， 80.79， 77.48， 74.82， 69.13， 55.14， 55.11， 52.16， 26.94. HRMS： C63H45N3NaO7計算值978.315 0，實驗值 978.317 7.

LT-TPE-DB-BNO2" "將0.20 g化合物7和0.09 g疊氮基乳糖溶于6 mL THF，氮氣氛下，加入0.05 g CuSO4·5H2O和0.03 g Vc，55 ℃反應10 h. 冷卻，乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗滌，無水Na2SO4干燥，蒸除溶劑，柱層析（VDCM∶VMeOH=4∶1），

得橙色固體0.19 g（產(chǎn)率66.2%），即化合物LT-TPE-DB-BNO2.熔點156.0～161.6 ℃. 1H NMR （DMSO-d6， 600 MHz） δ： 8.15 （d， J=8.4 Hz， 2 H）， 8.03 （s， 1 H）， 7.89 （d， J=7.8 Hz， 3 H）， 7.71 （d， J=8.4 Hz， 1 H）， 7.68～7.65 （m， 1 H）， 7.64～7.63 （m， 3 H）， 7.59 （d， J=8.4 Hz， 2 H）， 7.53 （t， J=7.8 Hz， 1 H）， 7.51 （d， J=15.6 Hz， 1 H）， 7.43 （d， J=8.4 Hz， 2 H）， 7.38 （d， J=7.2 Hz， 1 H）， 7.18 （m， 2 H）， 7.14～7.07 （m， 3 H）， 7.13 （d， J=15.6 Hz， 1 H）， 7.03～7.00 （m， 3 H）， 6.94 （d， J=8.4 Hz， 2 H）， 6.90 （d， J=9.0 Hz， 2 H）， 6.74 （d， J=8.4 Hz， 2 H）， 6.71 （d， J=9.0 Hz， 2 H）， 5.24 （s， 2 H）， 5.18～5.12 （m， 3 H）， 5.05 （s， 1 H）， 4.84 （s， 1 H）， 4.72 （s， 1 H）， 4.68 （s， 1 H）， 4.58～4.52 （m， 4 H）， 4.31 （d， J=7.8 Hz， 1 H）， 4.21 （d， J=7.2 Hz， 1 H）， 4.09～4.05 （m， 1 H）， 3.91～3.87 （m， 1 H）， 3.78 （d， J=11.4 Hz， 1 H）， 3.69 （d， J=1.2 Hz， 6 H）， 3.63 （s， 1 H）， 3.61～3.59 （m， 1 H）， 3.56～3.45 （m， 4 H）， 3.33～3.27 （m， 4 H）， 3.05～3.03 （m， 1 H）. 13C NMR （DMSO-d6， 150 MHz） δ： 170.93， 166.23， 157.88， 157.78， 157.54， 146.88， 144.16， 143.95， 143.68， 141.80， 141.15， 141.14， 140.36， 138.17， 138.15， 137.55， 135.57， 135.56， 132.24， 132.11， 132.04， 132.02， 131.51， 131.48， 131.46， 130.81， 130.78， 130.40， 129.88， 129.46， 127.92， 127.63， 126.69， 126.61， 126.34， 126.15， 126.12， 125.41， 123.36， 113.30， 113.17， 112.65， 107.71， 105.36， 103.84， 102.52， 102.51， 102.48， 102.46， 99.83， 80.65， 80.60， 80.45， 79.35， 75.52， 74.97， 74.93， 74.89， 73.28， 73.01， 70.60， 68.56， 68.06， 67.26， 60.47， 60.33， 59.13， 57.57， 54.93， 54.91， 49.56. HRMS： C77H70N6NaO18計算值1 389.463 9，實驗值 1 389.461 5.

2.2" LT-TPE-DB-BNO2的光學性質

為探究LT-TPE-DB-BNO2的穩(wěn)定性和產(chǎn)生ROS的激發(fā)波長，對LT-TPE-DB-BNO2的

光譜性質進行測定，結果如圖2所示：LT-TPE-DB-BNO2在400 nm處具有最大吸收（圖2a），最大發(fā)射波長為655 nm（圖2b）.

為探討血液循環(huán)過程中血清中的蛋白等物質對LT-TPE-DB-BNO2療效的影響，采用分光光度法對其在血清中的穩(wěn)定性進行測定，結果如圖3所示：將其與血清共孵育0～8 h，體系的紫外可見吸收光譜基本沒有發(fā)生變化，說明血清中的蛋白等物質不影響LT-TPE-DB-BNO2的穩(wěn)定性.

酸性是實體瘤微環(huán)境的重要特征，腫瘤部位的胞外pH值為6.0～7.0［6-7］，溶酶體內pH值為3.8～6.6［8-9］. 為探究酸堿性對LT-TPE-DB-BNO2穩(wěn)定性的影響，測定不同pH值PBS緩沖液中LT-TPE-DB-BNO2的紫外可見吸收光譜，結果如圖4所示：pH值2～10，LT-TPE-DB-BNO2的紫外可見吸收光譜基本沒有變化；只有當pH值大于10的較強堿性條件下，其吸光度才出現(xiàn)明顯下降，表明LT-TPE-DB-BNO2在生理條件下是穩(wěn)定的.

2.3" LT-TPE-DB-BNO2的光動力學性質

為探究LT-TPE-DB-BNO2在光照條件下胞外產(chǎn)生ROS的能力，將其與ABDA混合，用氙燈（0.1 W/cm2）照射0、20、40、60、80、100、120 s后測定體系的紫外吸收情況，以孟加拉玫瑰紅（RB）［10］做參比，結果如圖5所示：隨光照時間的延長，LT-TPE-DB-BNO2與ABDA混合液的吸收強度降低，且降低程度遠高于ABDA+RB；將混合液照射120 s后，吸收強度接近于0，表明ABDA幾乎被ROS完全降解. 說明LT-TPE-DB-BNO2是有效的胞外PDT試劑，在可見光照射下有效產(chǎn)生ROS，且產(chǎn)生ROS的能力高于RB.

為探討LT-TPE-DB-BNO2在光照條件下胞內產(chǎn)生ROS的能力，將其與HeLa細胞共孵育，以DCFH-DA作探針，用氙燈（0.1 W/cm2）輻照1 min，利用共聚焦熒光顯微鏡測定胞內產(chǎn)生ROS能力，結果如圖6所示：黑暗狀態(tài)下，胞內幾乎檢測不到DCF信號；光照1 min后，可觀察到強烈的DCF信號，這主要是因為在光照條件下LT-TPE-DB-BNO2產(chǎn)生的ROS作用于DCFH-DA造成的；將ROS清除劑VC與LT-TPE-DB-BNO2、HeLa細胞共同孵育后再照射1 min，胞內的熒光信號非常微弱，即VC有效地抑制LT-TPE-DB-BNO2在光照條件下產(chǎn)生ROS.以上結果表明LT-TPE-DB-BNO2是有效的胞內PDT試劑.

2.4" LT-TPE-DB-BNO2的體外抗腫瘤活性

為探究LT-TPE-DB-BNO2對腫瘤細胞活力的影響，以HeLa細胞為模型，采用MTT法測定黑暗條件、光照不同時間（1、3、5、7 min），及不同濃度（0、0.1、1.0、2.0、5.0、10.0 μmol/L）LT-TPE-DB-BNO2作用下的HeLa細胞活力，結果如圖7所示：在黑暗條件下，LT-TPE-DB-BNO2幾乎不影響HeLa細胞的活力；將HeLa細胞與LT-TPE-DB-BNO2共孵育后，用氙燈（0.1 W/cm2）照射5 min，細胞活力隨LT-TPE-DB-BNO2濃度增大而減小，當濃度增加到10.0 μmol/L時，HeLa細胞活力下降63.4%. 將HeLa細胞與LT-TPE-DB-BNO2（10.0 μmol/L）共孵育后，利用氙燈照射不同時間，細胞活力隨照射時間延長而降低，當輻照時間增大到7 min時，細胞活力下降88.3%. 以上結果表明，在氙燈照射下，LT-TPE-DB-BNO2產(chǎn)生的ROS可有效滅殺腫瘤細胞.

為觀察光照條件下LT-TPE-DB-BNO2導致HeLa細胞凋亡的情況，采用活死細胞雙染法探究細胞狀況，結果如圖8所示：在黑暗條件下，HeLa細胞生存狀況良好（綠色熒光）；經(jīng)光照處理后，顯示出大量HeLa細胞死亡（紅色熒光）.說明可利用LT-TPE-DB-BNO2采用PDT方式導致腫瘤細胞凋亡.

為探究LT-TPE-DB-BNO2對正常細胞的影響，以BRL-3A細胞為模型，采用MTT法分別測定黑暗條件下和光照不同時間（1、3、5、7 min）及不同濃度（0、0.1、1.0、2.0、5.0、10.0 μmol/L）LT-TPE-DB-BNO2作用下BRL-3A細胞的活力，結果如圖9所示：黑暗條件下，LT-TPE-DB-BNO2幾乎不影響B(tài)RL-3A細胞的活力；光照5 min，細胞活力隨其濃度增大略有降低；當LT-TPE-DB-BNO2濃度增大到10.0 μmol/L時，細胞活力仍然維持在83.7%. 將其與BRL-3A細胞輻照不同時間，細胞的活力隨照射時間延長略有降低，當輻照時間達到7 min時，仍有79.5%的細胞存活. 結果表明LT-TPE-DB-BNO2對正常細胞的光毒性較小.

3" 結論

以4-溴二苯甲酮、4，4′-二甲氧基二苯甲酮、對硝基芐溴和疊氮基乳糖等為原料，所合成的PDT試劑LT-TPE-DB-BNO2在血清中及不同pH值（2～10）條件下表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性；在光照下展現(xiàn)出遠高于RB的ROS產(chǎn)生能力；在黑暗條件下，LT-TPE-DB-BNO2幾乎不影響HeLa和BRL-3A的細胞活力；在氙燈照射下，LT-TPE-DB-BNO2產(chǎn)生的ROS使HeLa細胞的活力降低88.3%，體現(xiàn)出強的光毒性，但對正常細胞具有較低的光毒性.總之，LT-TPE-DB-BNO2是一種高效的、具有發(fā)展?jié)摿Φ目鼓[瘤PDT試劑.

參" 考" 文" 獻：

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（責任編輯：梁俊紅）