DOI：10.3969/j.issn.10001565.2025.02.006

摘" 要：小分子生物硫醇在生物體內(nèi)扮演著至關(guān)重要的角色，當(dāng)其濃度異常時(shí)會引發(fā)各種疾病.因此，開發(fā)用于檢測生物體內(nèi)硫醇水平變化的新方法對于人類生命健康具有重要意義.由于熒光探針法具有操作簡單、選擇性高、靈敏度高、響應(yīng)快速等特點(diǎn)，本文以2，4-二硝基苯磺?；鳛樽R別基團(tuán)，異佛爾酮衍生物為熒光團(tuán)，設(shè)計(jì)合成了一種近紅外硫醇熒光探針DCI-AC-NBS.該探針與硫醇發(fā)生“親核取代-環(huán)化”反應(yīng)后生成熒光性能優(yōu)良的香豆素類物質(zhì)DCI-COU.該探針對硫醇具有選擇性高、檢出限低和斯托克斯位移大等優(yōu)點(diǎn)，并可用于實(shí)時(shí)監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)硫醇水平的變化，為生物體內(nèi)硫醇檢測提供新思路.

關(guān)鍵詞：熒光探針；生物硫醇；生物成像

中圖分類號：O316""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A""" 文章編號：10001565（2025）02015708

A fluorescent probe for biothiols based on isophorone

JIANG Ningning， ZHOU Keyan， LIU Hongmei， LI Xiaoxing， YANG Yutao

（Key Laboratory of Medicinal Chemistry and Molecular Diagnosis Ministry of Education，College of Chemistry and Materials Science， Hebei University， Baoding 071000， China）

Abstract： Small molecule biothiols play vital roles in living organisms， and abnormal concentrations can lead to various diseases. Therefore， developing new methods to detect biothiol levels is very important for human health. Fluorescent probes， known for their simple operation， high selectivity， high sensitivity， and fast response， are particularly useful for this purpose. In this study， a near-infrared fluorescent probe， DCI-AC-NBS， was designed and synthesized for biothiols detection， incorporating a 2，4-dinitrobenzenesulfonyl group as the recognition moiety and an isophorone derivative as the fluorophore. Through a nucleophilic substitution-cyclization reaction between DCI-AC-NBS and biothiols， a coumarin derivative， DCI-COU， was produced， exhibiting excellent fluorescence properties. The DCI-AC-NBS has the advantages of high selectivity， a low detection limit， and a large Stokes shift for biothiols， making it suitable for real-time monitoring of intracellular biothiol level changes， thereby providing a new approach for in vivo biothiol detection.

Key words： fluorescent probe; biothiols; bioimaging

收稿日期：20241112;修回日期：20241207

基金項(xiàng)目：

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（22177025）;河北大學(xué)教育部藥物化學(xué)與分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任基金項(xiàng)目（MCMDZR-2024003）

第一作者：江寧寧（2001—），女，河北大學(xué)在讀碩士研究生，主要從事熒光探針及其生物傳感方向研究.E-mail：18334534763@163.com.

通信作者：李曉幸（1984—），女，河北大學(xué)實(shí)驗(yàn)師，主要從事熒光探針及其生物傳感方向研究. E-mail：lixiaoxing.1984@163.com

楊瑜濤（1984—），女，河北大學(xué)副研究員，主要從事熒光探針的構(gòu)建及其識別機(jī)制方向研究. E-mail：yutaoyang2016@163.com

小分子生物硫醇主要包括半胱氨酸（Cys）、高半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（GSH），它們在生物體內(nèi)發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［1-3］，參與細(xì)胞信號傳導(dǎo)、維持氧化還原平衡、蛋白質(zhì)合成與功能調(diào)節(jié)等生命過程，維護(hù)生物體的健康［4-7］. 然而，當(dāng)生物硫醇的濃度異常時(shí)會引起各種疾病，如心血管疾病、癌癥和阿爾茨海默病等 ［8-11］.因此，硫醇的檢測在臨床診斷和疾病預(yù)防中具有重要意義，迫切需要開發(fā)一種新型的用于檢測小分子生物硫醇的新方法［12-14］ .

目前，熒光探針法具有操作簡單、選擇性高、靈敏度高、響應(yīng)快速等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域［15-18］.研究表明，2，4-二硝基苯磺?；勺鳛榱虼嫉奶禺愋宰R別位點(diǎn)，應(yīng)用于硫醇熒光探針的設(shè)計(jì).目前，已報(bào)道的許多相關(guān)探針的熒光團(tuán)骨架是預(yù)先存在的，其與硫醇發(fā)生親核取代反應(yīng)后，將“保護(hù)”的熒光團(tuán)釋放出來，從而實(shí)現(xiàn)對硫醇的識別與檢測，但卻存在背景熒光干擾等缺點(diǎn)，限制了生物成像和應(yīng)用［19-28］.因此，在前者的基礎(chǔ)上，筆者選擇異佛爾酮衍生物作為熒光團(tuán)，2，4-二硝基苯磺?；鶊F(tuán)作為識別基團(tuán)，構(gòu)建了一種新的生物硫醇熒光探針DCI-AC-NBS.由于2，4-二硝基苯磺酰基團(tuán)具有吸電子特性，熒光團(tuán)的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）效應(yīng)被阻止，導(dǎo)致探針本身不發(fā)熒光.在 Cys/Hcy/GSH 存在下，巰基首先進(jìn)攻2，4-二硝基苯磺?；l(fā)生親核取代反應(yīng)，然后進(jìn)一步發(fā)生分子內(nèi)環(huán)化，原位形成新近紅外熒光團(tuán)香豆素衍生物DCI-COU.該探針具有高選擇性、低檢出限（Cys：36 nmol/L；GSH：32 nmol/L；Hcy：72 nmol/L）、快速響應(yīng)（1 500 s內(nèi)）和大斯托克斯位移（165 nm）等優(yōu)良特性，并具有良好的生物相容性，可用于實(shí)時(shí)監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)硫醇水平的變化.

1" 實(shí)驗(yàn)部分

1.1" 儀器

核磁共振儀 （400 Hz，中科牛津波譜，武漢）；紫外-可見分光光度計(jì) （Cary 60 Agilent， America）；熒光分光光度計(jì) （Cary Eclipse Agilent， America）；高分辨質(zhì)譜儀 （Bruker Daltonik， America）；CO2培養(yǎng)箱 （Thermo Fisher， America）；激光共聚焦顯微鏡 （Zeiss， Germany）.

1.2" 試劑

異佛爾酮、丙二腈、4-羥基-苯甲醛、六次甲基四胺（HMTA）、乙氧甲?；鶃喖谆交ⅲ≒h3P=CHCOOC2H5）、2，4-二硝基苯磺酰氯、哌啶、三氟乙酸（TFA）、三乙胺（TEA）、無水乙醇（EtOH）、乙腈、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、二甲亞砜（DMSO）、乙酸乙酯（EA）、石油醚（PE）、二氯甲烷（DCM）等為合成所需主要試劑，半胱氨酸（Cys）、同型半胱氨酸（Hcy）、谷胱甘肽（GSH）等氨基酸用于光譜測試實(shí)驗(yàn)，以上試劑均為分析純.

1.3" 溶液配制及光譜測定

用 DMSO 制備探針的儲備液，濃度為 2×10-3" mol/L，各種分析物均用去離子水配制，濃度為 2×10-3" mol/L.紫外和熒光光譜均在 PBS-DMSO（10 mmol/L，PBS與DMSO體積比為3∶2，pH=7.4）中檢測獲得，熒光光譜激發(fā)波長為 550 nm，光柵狹縫為 5 nm/5 nm.

1.4" 熒光探針的制備與表征

1.4.1" 化合物 DCI 的合成

將異佛爾酮（3.80 g，27 mmol）與丙二腈（6.00 g，88 mmol）溶于無水乙醇（30 mL）中，并在上述溶液中加入哌啶（200 μL），于 60 ℃下攪拌，待原料反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)物真空濃縮，用乙酸乙酯（20 mLⅹ3）萃取，飽和氯化鈉（20 mL）洗滌，合并有機(jī)相，用無水硫酸鈉干燥，真空濃縮除去溶劑，將粗產(chǎn)物通過快速柱色譜（VPE∶VEA=30∶1）進(jìn)行分離，得到白色針狀物（3.58 g，72%），見圖1.

1.4.2" 化合物 DCI-OH 的合成

將4-羥基-苯甲醛（0.12 g，1 mmol）和化合物DCI（0.19 g，1 mmol）溶解于乙腈溶液（6 mL）中，將 10 滴哌啶加入到上述溶液中，于 82 ℃回流攪拌 6 h.反應(yīng)完成后，冷卻至室溫，真空濃縮除去溶劑，通過快速柱色譜分離（VPE∶VEA=15∶1）得到橘色固體（0.17 g，58%）.

1.4.3" 化合物 DCI-CHO-OH 的合成

將化合物DCI-OH（0.58 g，2 mmol）和 HMTA （0.56 g，4 mmol）溶解于 TFA （10 mL）溶液中，于 73 ℃回流攪拌 3 h. 反應(yīng)完成后，冷卻至室溫，加入冰水（30 mL），用二氯甲烷（20 mLⅹ3）萃取，飽和氯化鈉（20 mL）洗滌，合并有機(jī)相，用無水硫酸鈉干燥，真空濃縮除去溶劑，將粗產(chǎn)物通過快速柱色譜（VDCM∶VEA=1∶1）進(jìn)行分離，得到黃色固體（0.29 g，46%）.

1.4.4" 化合物 DCI-AC-OH 的合成

將化合物DCI-CHO-OH（0.16 g，0.50 mmol）和乙氧甲?；鶃喖谆交ⅲ?.26 g，0.75 mmol）加入到甲苯（30 mL）溶液中，在氬氣保護(hù)下加熱到 60 ℃，避光反應(yīng) 4 h.反應(yīng)完成，冷卻至室溫，用二氯甲烷（20 mL×3）萃取，再用飽和氯化鈉（20 mL）洗滌，合并有機(jī)相，真空濃縮除去溶劑.將粗產(chǎn)物通過快速柱色譜（VDCM∶VPE=1∶1）進(jìn)行分離，得到橘色固體（0.16 g，83%）.

1.4.5" 探針DCI-AC-NBS的合成

將化合物DCI-AC-OH（0.10 g，0.25 mmol）與 TEA （0.18 g，0.28 mmol）溶解于 15 mL DMF 中，室溫下攪拌 10 min，然后滴加2，4-二硝基苯磺酰氯（0.48 g，1.65 mmol），在室溫下攪拌反應(yīng) 10 h后，加入水（20 mL）淬滅反應(yīng)，用二氯甲烷（20 mL×3）萃取，再用飽和氯化鈉（20 mL）洗滌，合并有機(jī)相后，用無水硫酸鈉干燥，真空濃縮除去溶劑，將粗產(chǎn)物通過快速柱色譜（VPE∶VEA=5∶1）進(jìn)行分離，得到黃色固體（0.07 g，38%）.熔點(diǎn)：224.4～226.3 ℃， 1H NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ： 9.04 （d， J=1.4 Hz， 1H）， 8.55 （dd， J1=5.6 Hz， J2=1.4 Hz， 1H）， 8.22 （d，J=0.8 Hz， 1H）， 8.11 （d， J=5.8 Hz， 1H）， 7.72 （dd，J1=5.8 Hz， J2=1.0 Hz， 1H）， 7.51 （d， J=10.8 Hz， 1H）， 7.43 （d， J=10.6 Hz， 1H）， 7.30 （d， J=10.0 Hz， 1H）， 7.23 （d，J=10.8 Hz， 1H）， 6.85 （s， 1H）， 6.56 （d， J=10.6 Hz， 1H）， 4.08 （q， J=4.8 Hz， 2H）， 2.58 （s， 2H）， 2.45 （s， 2H）， 1.17 （t， J=4.8 Hz， 3H）， 0.98 （s， 6H）; 13C NMR （100 MHz， DMSO-d6） δ： 170.1， 165.3， 155.0， 151.5， 148.0， 146.8， 136.5， 135.5， 134.9， 133.5， 131.7， 131.6， 130.8， 128.0， 127.6， 126.5， 124.2， 123.6， 121.8， 121.1， 113.6， 112.8， 77.4， 60.4， 42.3， 38.2， 31.6， 27.4， 13.9. HRMS （ESI， m/z）： Calcd for C30H26N4O9S+ （［M+H］+） 619.14987， found： 619.14945.

2" 結(jié)果與討論

2.1" 探針DCI-AC-NBS對生物硫醇的光學(xué)性能

首先，通過熒光分光光度法考察了DCI-AC-NBS對生物硫醇的選擇性.在含有DCI-AC-NBS（10 mmol/L）的 PBS-DMSO（PBS與DMSO體積比為3∶2，pH=7.4）溶液中加入 100 μmol/L 的 Cys、Hcy、GSH 和 200 μmol/L 的其他分析物（如精氨酸、組氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、硒代半胱氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨基酸、纈氨酸、異亮氨酸、硫化氫），如圖 2a熒光光譜顯示，其他分析物的熒光強(qiáng)度沒有明顯變化，而加入生物硫醇后，705 nm處的熒光強(qiáng)度明顯增加.上述研究結(jié)果表明，DCI-AC-NBS對生物硫醇具有較高的選擇性.同時(shí)，分別對DCI-AC-NBS與生物硫醇（Cys、Hcy、GSH）之間的反應(yīng)進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖 2b所示.在加入生物硫醇后，DCI-AC-NBS快速開啟響應(yīng)，在 1 500 s內(nèi)達(dá)到最大值，說明DCI-AC-NBS可以快速識別硫醇.隨后，研究了不同 pH 對DCI-AC-NBS識別硫醇的影響.選擇不同 pH 值（3～12）的 PBS-DMSO（PBS與DMSO體積比3∶2）作為緩沖條件，以 GSH 為例進(jìn)一步展開研究.如圖 2c所示，在 pH 值為3～9，DCI-AC-NBS本身保持穩(wěn)定不變；但當(dāng)加入 GSH 且 pH 值處于 7.4～11 時(shí)，其熒光強(qiáng)度顯著提升，說明DCI-AC-NBS可以在較寬的 pH 值范圍內(nèi)識別硫醇.

接下來，在含有體積分?jǐn)?shù)40% DMSO的PBS 緩沖溶液（10 mmol/L，pH 7.4）中測試了DCI-AC-NBS對生物硫醇（以 GSH 為例）響應(yīng)的紫外和熒光滴定光譜（圖2d）.如圖 2d所示，DCI-AC-NBS在 400 nm處有最大吸收峰.隨著 GSH濃度（0～24 μmol/L）的增加，400 nm處的吸收峰逐漸降低，在 540 nm處出現(xiàn)了新的吸收峰，在 442 nm處出現(xiàn)等吸收點(diǎn)，這表明形成了新的化合物（圖2e）.圖 2e是與之相對應(yīng)的 GSH 熒光滴定光譜，DCI-AC-NBS本身幾乎沒有熒光，隨著 GSH 濃度的增加，在 540 nm波長的激發(fā)下，位于 705 nm處發(fā)射峰的熒光強(qiáng)度升高了 76 倍. 隨后，根據(jù)DCI-AC-NBS識別 GSH 的熒光滴定光譜圖，繪制出了DCI-AC-NBS檢測GSH的工作曲線（圖2f）.如圖 2f所示，溶液的熒光強(qiáng)度與 GSH 的濃度（0～18 μmol/L）之間存在良好

的線性關(guān)系，線性方程為 Y=43.103 6X+19.759 84，R2=0.995 07，k=43.103 6.將空白探針掃描 10 次，通過 705 nm處的熒光強(qiáng)度計(jì)算出方差 σ，利用 3σ/k 公式計(jì)算出最低檢測限為 32 nmol/L.同樣，Cys 和 Hcy 的檢測限分別為 36 nmol/L 和 72 nmol/L，表明DCI-AC-NBS對生物硫醇有較低的檢出限和較高的靈敏度.

2.2" 探針DCI-AC-NBS識別硫醇的機(jī)理

對DCI-AC-NBS識別硫醇的反應(yīng)機(jī)理提出假設(shè)，如圖 3a所示.硫醇的巰基攻擊2，4-二硝基苯磺酰基團(tuán)引起裂解反應(yīng)，發(fā)生分子內(nèi)環(huán)化，形成最終產(chǎn)物DCI-COU.隨后，對DCI-COU進(jìn)行了質(zhì)譜（HR-MS）表征，如圖 3b所示，充分驗(yàn)證了本文所提出的反應(yīng)機(jī)理的正確性.

2.3" 探針DCI-AC-NBS的細(xì)胞成像

以 HepG2 細(xì)胞為模型，將細(xì)胞以1×105個(gè)/mL接種于6孔板中，在CO2培養(yǎng)箱中孵育12 h，使用不同濃度的探針DCI-AC-NBS（0、1、3、5、10、20 μmol/L）對細(xì)胞進(jìn)行孵育，隨后使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞對探針的攝取能力.如圖 4a所示，隨著探針DCI-AC-NBS濃度的增大，細(xì)胞的攝取能力隨之增大. 隨后，將 HepG2 細(xì)胞分為5組：Control 組、NEM（N-乙基馬來酰亞胺，生物硫醇清除劑）組、NEM+Cys組、NEM+Hcy組、NEM+GSH組，以密度為 5×104 個(gè)/mL接種于共聚焦小皿中，接種量為 2 mL，在 CO2 培養(yǎng)箱中孵育 24 h待用.當(dāng)細(xì)胞貼壁后進(jìn)行共聚焦顯微鏡成像.如圖 4b所示，Control組細(xì)胞只需使用DCI-AC-NBS孵育30 min，即可觀察到明顯的紅色熒光信號.NEM組細(xì)胞使用NEM（200 μmol/L）清除細(xì)胞中的部分生物硫醇后，再使用DCI-AC-NBS進(jìn)行孵育，發(fā)現(xiàn)熒光信號明顯消失.最后，為了證明DCI-AC-NBS可以檢測外源性生物硫醇，先用 NEM 清除NEM+Cys組、NEM+Hcy組、NEM+GSH組細(xì)胞中的部分生物硫醇，再分別與Cys、Hcy和GSH（100 μmol/L）一起孵育30 min，最后，用DCI-AC-NBS孵育 30 min后進(jìn)行成像，發(fā)現(xiàn)熒光信號更加明顯.上述結(jié)果表明，DCI-AC-NBS可用于動(dòng)態(tài)監(jiān)測活細(xì)胞中的生物硫醇.

λex=561 nm， λem=640～745 nm，比例尺：10 μm，數(shù)據(jù)以平均值士標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示（n=3），" ****P＜0.000 1，**P＜0.01，ns沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

生物硫醇作為一種重要的體內(nèi)抗氧化劑，在細(xì)胞氧化還原過程中發(fā)揮著重要作用.因此，筆者將過氧化氫（H2O2）引入細(xì)胞中，模擬氧化應(yīng)激狀態(tài)，將 HepG2 細(xì)胞分為3組：Control 組、H2O2 組、H2O2+ALA（硫辛酸，H2O2 的清除劑）組進(jìn)行共聚焦顯微鏡成像.如圖 5 所示，Control組細(xì)胞使用DCI-AC-NBS孵育30 min，可以觀察到有明顯的紅色熒光；H2O2組細(xì)胞使用外源 H2O2（50 μmol/L ）進(jìn)行處理，再使用DCI-AC-NBS孵育30 min，觀察到紅色熒光減弱；然而，當(dāng)H2O2+ALA組細(xì)胞使用 H2O2 和 ALA （500 μmol/L）分別處理細(xì)胞 30 min，再用DCI-AC-NBS孵育 30 min后，熒光信號又明顯回升.這些結(jié)果進(jìn)一步表明，DCI-AC-NBS可用于細(xì)胞內(nèi)硫醇水平變化的實(shí)時(shí)監(jiān)測.

λex=561 nm， λem=640～745 nm，比例尺：10 μm，數(shù)據(jù)以平均值士標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示（n=3），****P＜0.000 1，*P＜0.1

3" 總結(jié)

本文設(shè)計(jì)合成了一種新型的熒光增強(qiáng)型近紅外生物硫醇熒光探針DCI-AC-NBS，用于生物硫醇的檢測和生物成像.通過核磁共振氫譜、高分辨質(zhì)譜等手段，發(fā)現(xiàn)在生物硫醇作用下，DCI-AC-NBS發(fā)生親核取代-環(huán)化反應(yīng)，生成強(qiáng)熒光物質(zhì)DCI-COU.該探針對生物硫醇的檢測具有高選擇性和高靈敏度，并成功用于活細(xì)胞中生物硫醇的檢測和熒光成像，有望在相關(guān)疾病的診斷中發(fā)揮積極作用.

參" 考" 文" 獻(xiàn)：

［1］" DONG J N， LU G W， TU Y Y， et al. Recent research progress of red-emitting/near-infrared fluorescent probes for biothiols［J］. New J Chem， 2022， 46（23）： 10995-11020. DOI： 10.1039/D1NJ06244A.

［2］" 周柯巖，楊瑜濤，李華肖，等. 一種檢測生物硫醇的熒光探針［J］. 河北大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2020， 40（1）： 27-32. DOI： 10.3969/j.issn.1000-1565.2020.01.005.

［3］"" 孟美榮， 陰彩霞. 一種熒光增強(qiáng)型的GSH熒光探針［J］. 河北大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2019， 39（1）： 49-55. DOI： 10.3969/j.issn.1000-1565.2019.01.009.

［4］"" PRESSMAN， MD P， BRIDGE W J， ZARKA M H， et al. Dietary γ-glutamylcysteine： Its impact on glutathione status and potential health outcomes［J］. J Diet Suppl， 2022， 19（2）： 259-270. DOI： 10.1080/19390211.2020.1856266.

［5］"" MADHU M， SANTHOSHKUMAR S， TSENG W B， et al. Optical nanoprobes for aminothiols sensing in real-world samples［J］. Sens Actuat Rep， 2022， 4： 100123. DOI： 10.1016/j.snr.2022.100123.

［6］"" JIANG S， WANG S， ZHAO Z， et al. A ratiometric fluorescent probe for the detection of biological thiols based on a new supramolecular design［J］. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc， 2023， 303： 123167. DOI： 10.1016/j.saa.2023.123167.

［7］"" 林利霞，郭春青，王利斌，等. 一種含SNAP-tagTM底物的硫醇熒光探針［J］. 河北大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2024， 44（5）： 504-512. DOI： 10.3969/j.issn.1000 1565.2024.05.007.

［8］"" RUDRESHKUMAR K J， MAJUMDAR V， NAGARAJA D， et al. Relevance of plasma levels of free homocysteine and methionine as risk predictors for ischemic stroke in the young［J］. Clin Nutr， 2018， 37（5）： 1715-1721. DOI： 10.1016/j.clnu.2017.07.005.

［9］" REN A S， QIAO L G， LI K C， et al. Thiol-chromene click reaction-triggered mitochondria-targeted ratiometric fluorescent probe for intracellular biothiol imaging［J］. Anal Bioanal Chem， 2024， 416（28）： 6223-6235. DOI： 10.1007/s00216-024-05506-3.

［10］" LIU Z X， ZHOU W L， LI J J， et al. High-efficiency dynamic sensing of biothiols in cancer cells with a fluorescent β-cyclodextrin supramolecular assembly［J］. Chem Sci， 2020， 11（18）： 4791-4800. DOI： 10.1039/D0SC00414F.

［11］"" GHOLAMI M D， NIHAL S， LIU Q， et al. A universal stimuli-responsive biosensor for disease biomarkers through their cysteine residues： A proof of concept on carcinoembryonic antigen （CEA） biomarker ［J］. Sensor Actuat B-Chem， 2023， 393： 134208. DOI： 10.1016/j.snb.2023.134208.

［12］"" 周思儀，丁旭，趙永梅，等. 基于黃酮的長波長熒光探針用于檢測體外和體內(nèi)生物硫醇（英文） ［J］. 有機(jī)化學(xué)， 2023， 43（01）： 178-185. DOI： 10.6023/cjoc202206016.

［13］"" WANG W， WANG K， WANG X T， et al. A novel selective probe for detecting glutathione from other biothiols based on the concept of Fluorescence Fusion ［J］. Anal Chim Acta， 2021， 1177： 338786. DOI： 10.1016/j.aca.2021.338786.

［14］"" SZWACZKO K. Fluorescent coumarin-based probe for detection of biological Thiols ［J］. Curr Org Chem， 2023， 27（15）： 1329-1335. DOI： 10.2174/0113852728247683231006064932.

［15］"" DALY B， LING J， DE SILVA A P. Current developments in fluorescent PET （photoinduced electron transfer） sensors and switches［J］. Chem Soc Rev， 2015， 44（13）： 4203-4211. DOI： 10.1039/C4CS00334A.

［16］"" JUN J V， CHENOWETH D M， PETERRSSON E J. Rational design of small molecule fluorescent probes for biological applications［J］. Org Biomol Chem， 2020， 18（30）： 5747-5763. DOI： 10.1039/D0OB01131B.

［17］" YANG M W， FAN J L， DU J J， et al. Small-molecule fluorescent probes for imaging gaseous signaling molecules： current progress and future implications［J］. Chem Sci， 2020， 11（20）： 5127-5141. DOI： 10.1039/d0sc01482f.

［18］"" 段新瑞， 孟天姣. 有機(jī)小分子熒光探針的設(shè)計(jì)及其在酶類腫瘤標(biāo)志物檢測中的研究進(jìn)展［J］. 河北大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2021， 41（5）： 535-544. DOI： 10.3969/j.issn.1000-1565.2021.05.010.

［19］" ZHU Y D， PAN H T， SONG Y Y， et al. Mitochondria-targeted fluorescent probe for rapid detection of thiols and its application in bioimaging［J］. Dyes Pigm， 2021， 191： 109376. DOI： 10.1016/j.dyepig.2021.109376.

［20］" CHEN D G， YANG J L， DAI J， et al. A low background D-A-D type fluorescent probe for imaging of biothiols in living cells［J］. J Mater Chem B， 2018， 6（32）： 5248-5255. DOI： 10.1039/c8tb01340c.

［21］" CHEN S， HOU P， SUN J W， et al. A new long-wavelength emission fluorescent probe for imaging biothiols with remarkable Stokes shift［J］. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc， 2020， 241： 118655. DOI： 10.1016/j.saa.2020.118655.

［22］" YIN C X， ZHANG W J， LIU T， et al. A near-infrared turn on fluorescent probe for biothiols detection and its application in living cells［J］. Sens Actuat B Chem， 2017， 246： 988-993. DOI： 10.1016/j.snb.2017.02.176.

［23］" XU K X， HE L W， YANG Y Z， et al. A PET-based turn-on fluorescent probe for sensitive detection of thiols and H2S and its bioimaging application in living cells， tissues and zebrafish［J］. New J Chem， 2019， 43（7）： 2865-2869. DOI： 10.1039/C8NJ04926B.

［24］" YAN D L， LIU L K， LIU Q， et al. Red-emitting coumarin-derived fluorescent probe for thiol detection and indirect recognition of β-Lactamase［J］. Microchem J， 2024， 206： 111622. DOI： 10.1016/j.microc.2024.111622.

［25］" CHEN J， WANG Z S， SHE M Y， et al. Precise synthesis of GSH-specific fluorescent probe for hepatotoxicity assessment guided by theoretical calculation［J］. ACS Appl Mater Inter， 2019， 11（36）： 32605-32612. DOI： 10.1021/acsami.9b08522.

［26］" LI P， SHI X H， XIAO H B， et al. Two-photon imaging of the endoplasmic reticulum thiol flux in the brains of mice with depression phenotypes［J］. Analyst， 2018， 144（1）： 191-196. DOI： 10.1039/c8an01626g.

［27］" YIN J， KWON Y， KIM D， et al. Cyanine-based fluorescent probe for highly selective detection of glutathione in cell cultures and live mouse tissues［J］. J Am Chem Soc， 2014， 136（14）： 5351-5358. DOI： 10.1021/ja412628z.

［28］" CHEN H， TANG Y H， REN M G， et al. Single near-infrared fluorescent probe with high-and low-sensitivity sites for sensing different concentration ranges of biological thiols with distinct modes of fluorescence signals［J］. Chem Sci， 2016， 7（3）： 1896-1903. DOI： 10.1039/c5sc03591k.

（責(zé)任編輯：梁俊紅）