摘 "要：微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一類非編碼核糖核酸（ribonuclei acid，RNA）小分子，長度約為22個核苷酸。本研究對沙子嶺豬和大約克夏豬背最長肌組織表達譜芯片和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析，旨在揭示這兩個豬種的miRNA與信使RNA（messenger RNA，mRNA）的差異表達特征及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。試驗通過小RNA測序共鑒定出307個miRNA，其中9個顯著差異表達（5個上調(diào)，4個下調(diào)），并分別在沙子嶺豬和大約克夏豬中鑒定出4個和5個特異性miRNA；轉(zhuǎn)錄組分析顯示鑒定出553個差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs），其中341個上調(diào)，212個下調(diào)。整合分析發(fā)現(xiàn)8個差異表達miRNA（differentially expressed miRNAs，DEMs）與59個DEGs形成70對調(diào)控關(guān)系，構(gòu)建了關(guān)鍵共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)?；虮倔w論（gene ontologo，GO）富集分析表明，靶基因顯著參與肌肉收縮調(diào)控、脂肪酸氧化等生物過程；京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析揭示絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路、FoxO（Forkhead box O，F(xiàn)oxO）信號通路和鐵死亡等代謝調(diào)控途徑的顯著富集，其中MAPK14基因同時參與內(nèi)分泌抵抗與免疫調(diào)控，ACOX1基因在丙酸和碳代謝中發(fā)揮雙重作用。這些發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)解析了沙子嶺豬與大約克夏豬肌肉組織在電生理特性、能量代謝和分子調(diào)控水平的關(guān)鍵差異，為解析豬種質(zhì)特性形成的分子機制提供了新見解。

關(guān)鍵詞：背最長??；miRNA芯片；Solexa測序沙子嶺豬；約克夏豬

中圖分類號：S813.1 文獻標志碼：A 文章編號：1001-0769（2025）01-0044-06

骨骼肌發(fā)育與肉質(zhì)性狀的形成受多層分子調(diào)控，其中信使RNA（messenger RNA，mRNA）與微小RNA（microRNA，miRNA）的分子作用機制日益受到關(guān)注。沙子嶺豬作為中國地方豬種的典型代表，以耐粗飼、肉質(zhì)細嫩著稱；而大約克夏豬作為我國引進的瘦肉型品種，則以高瘦肉率和優(yōu)良生長性能而聞名于世[1]。這兩個豬種在肌纖維類型、肌內(nèi)脂肪（intramuscular fat，IMF）含量及代謝通路上存在顯著差異，但其骨骼肌發(fā)育的分子調(diào)控機制尚未完全闡明。

近年來，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)miRNA通過靶向調(diào)控肌肉發(fā)育的相關(guān)基因，如肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MYH）家族和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族在骨骼肌分化與脂代謝中具有關(guān)鍵作用[2]。miR-27a/b和miR-378等已被證實可通過抑制脂肪沉積影響胴體性狀[3]，而let-7 miRNA家族則參與Wnt、PI3K-Akt等信號通路的調(diào)控[4]。然而，現(xiàn)有研究多聚焦單一分子或組織類型，對豬種間mRNA-miRNA互作網(wǎng)絡(luò)的系統(tǒng)性分析仍較匱乏。

本研究以兩種斷奶仔豬（沙子嶺豬與大約克夏豬）背最長肌為對象，整合表達譜芯片與miRNA測序數(shù)據(jù)，通過篩選兩個品種間差異表達的mRNA與miRNA，并解析其富集的信號通路及功能關(guān)聯(lián)，構(gòu)建關(guān)鍵miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，揭示品種特異性肌肉發(fā)育的分子基礎(chǔ)，以期為豬遺傳改良及肉質(zhì)性狀分子標記的挖掘提供理論依據(jù)。

1 "材料與方法

1.1 試驗動物

試驗豬分別選自湖南正虹科技發(fā)展股份有限公司正虹原種豬場的大約克夏豬和湖南省湘潭沙子嶺豬原種場的沙子嶺豬。所選豬均為25日齡的健康去勢公豬，組內(nèi)為半同胞，每個品種各3頭，飼養(yǎng)條件相同。屠宰后，在胸腰椎間最后一根肋骨處采集背最長肌樣本，用磷酸緩沖鹽（phosphate buffer saline，PBS）溶液沖洗后，速凍于液氮中，以備后續(xù)試驗。

1.2 總RNA提取和文庫構(gòu)建

采用TRIzol法提取總RNA；通過Nanodrop 2000超微量紫外分光光度計對提取的RNA進行濃度和純度的測定；通過Agilent Bioanalyzer 2100和1.5％瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA完整性。每個樣本取1 μL RNA進行文庫構(gòu)建，測序工作由上海生物芯片有限公司采用Illumina Genome Analyzer測序平臺完成。

1.3 miRNA的鑒定和數(shù)據(jù)分析

原始數(shù)據(jù)經(jīng)濾除低質(zhì)量序列、ploy-N和污染序列后，保留長度為18～30 nt的序列。通過Bowtie軟件依次比對Rfam（Vol.14.1）和Repbase（Vol.24.03）數(shù)據(jù)庫，系統(tǒng)剔除核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）、轉(zhuǎn)運RNA（transfer RNA，tRNA）、小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）、小胞質(zhì)RNA（small cytoplasmic RNA，scRNA）及重復(fù)元件等非靶序列。將過濾后的序列通過Bowtie（Vol.1.3.0）比對豬參考基因組（Sus scrofa 11.1），參數(shù)允許最大錯配數(shù)為2（不含空位錯配）。已知miRNA注釋采用miRBase（Vol.22）數(shù)據(jù)庫，新miRNA預(yù)測通過miRDeep2（Vol.2.0.1.2）完成，設(shè)置自由能閾值－20 kcal/mol且前體序列讀深≥10。各樣本miRNA表達量采用可信平臺模塊（Trusted Platform Module，TPM）算法進行標準化?；诟咄繙y序數(shù)據(jù)，以|log2FC（log2 fold change，log2FC）|≥1.0且P＜0.05為標準，篩選DEMs，篩選結(jié)果通過miRBase（Vol.22）注釋miRNA成熟體序列。

1.4 表達譜芯片測定與數(shù)據(jù)分析

采用Affymetrix豬全基因組表達芯片進行基因表達譜分析，每個處理組設(shè)置三個生物學(xué)重復(fù)。使用GeneChip 3' IVT Express試劑盒對6個樣本（總RNA）進行擴增、標記及純化，獲得生物素標記的互補RNA（complementary RNA，cRNA），嚴格按照試劑盒說明書操作。芯片雜交與洗滌通過GeneChip? Hybridization Wash and Stain Kit在Hybridization Oven 645雜交儀和Fluidics Station 450洗染工作站完成。采用Command Console Software 3.1控制GeneChip Scanner 3000掃描儀進行芯片掃描。原始數(shù)據(jù)經(jīng)RMA算法和GeneSpringl軟件（Vol.11.0）進行背景校正及標準化處理，通過DESeq2（Vol.1.10.1）進行各樣本中mRNA的差異分析篩選，篩選標準為|log2FC|＞1.0且P＜0.05。

1.5 miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

聯(lián)合TargetScan（Vol.8.0）、miRDB（Vol.6.0）數(shù)據(jù)庫對注釋后的miRNA進行靶基因預(yù)測；預(yù)測到的靶基因與轉(zhuǎn)錄組測序獲得的差異表達mRNAs（篩選標準：|log2FC|＞1.0且P＜0.05）進行維恩圖分析，獲取顯著共調(diào)控靶基因集。Cytoscape（Vol.3.7.2）構(gòu)建包含DEMs及其共調(diào)控靶基因的互作網(wǎng)絡(luò)。

1.6 差異表達分析和富集分析

通過DESeq2（Vol.1.10.1）進行各樣本中mRNA的差異分析篩選，篩選標準為|log2FC|＞1.0且P＜0.05。參照DAVID和KOBAS 2.0數(shù)據(jù)庫對miRNA靶基因結(jié)果進行GO富集分析和KEGG通路富集分析，顯著富集的標準均為P＜0.05。

1.7 實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR驗證分析

采用SYBR Green熒光染料法對樣本進行實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）驗證。試驗設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，以豬U6 snRNA、甲硫氨酸t(yī)RNA（Met-tRNA）及5S RNA作為內(nèi)參基因，每個樣本進行3次重復(fù)。引物序列見表1和表2。采用2?ΔΔCt法計算相對表達量，組間差異通過SPSS Vol.26.0進行獨立樣本t檢驗（P＜0.05為顯著差異）。

2 "結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析

原始數(shù)據(jù)（raw reads）經(jīng)去接頭和低質(zhì)量讀長過濾后，兩個cDNA文庫分別獲得31 862 145 " "（大約克夏豬）條和37 186 633（沙子嶺豬）條有效序列（clean reads），其中已知miRNA注釋比例分別達78.6％和77.78％（表3），表明測序數(shù)據(jù)以miRNA為主。少量序列被注釋為核仁小RNA（small nucleolar RNA，snoRNA）、核內(nèi)小RNA（small nuclear RNA，snRNA）、rRNA和假基因（pseudogene）等非靶向RNA，占比較低（＜5％），表明實驗數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠。

2.2 miRNA和mRNA的差異表達分析

在沙子嶺豬和大約克夏豬的背最長肌樣本中共鑒定出307個miRNA，其中298個miRNA為大約克夏豬與沙子嶺豬共表達的，兩個品種中分別有5個（大約克夏豬）和4個（沙子嶺豬）miRNA為品種特異性表達miRNA。以大約克夏豬為對照，篩選出9個顯著差異表達的DEMs，包含5個上調(diào)的和4個下調(diào)的。

在沙子嶺豬和大約克夏豬背最長肌中的mRNA表達模式中，以大約克夏豬為對照組，共篩選出553個差異表達基因（DEGs），其中上調(diào)基因341個（62％），下調(diào)基因212個（38％）。

2.3 miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及其靶基因富集分析

將預(yù)測到的DEMs靶基因與轉(zhuǎn)錄組測序獲得的539個DEGs進行韋恩圖分析（Venn diagram），共獲取8個DEMs的59個基因，形成了70對調(diào)控關(guān)系（表4）。對現(xiàn)有的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)靶基因進行GO功能富集分析，結(jié)果顯示，生物過程顯著富集于肌肉收縮調(diào)控、肌肉系統(tǒng)過程調(diào)節(jié)及脂肪酸氧化等通路；細胞組分主要富集于細胞器膜內(nèi)在成分和離子通道復(fù)合體，其中電壓門控通道相關(guān)基因，如TF基因，呈顯著差異表達。在分子功能層面，蛋白激酶活性、電壓門控通道活性及磷酸肌醇結(jié)合等功能顯著富集，提示沙子嶺豬和大約克夏豬在肌肉電生理特性方面存在重要調(diào)控差異。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，差異基因顯著富集于MAPK信號通路、FoxO信號通路及鐵死亡等代謝調(diào)控通路。其中，MAPK14基因同時參與內(nèi)分泌抵抗和Fcε受體I信號通路調(diào)控，而ACOX1基因在丙酸代謝與碳代謝通路中均發(fā)揮重要作用。

2.4 RT-qPCR驗證

為驗證測序結(jié)果，隨機選取4個差異miRNA（ssc-miR-127、ssc-let-7e、ssc-miR-204、ssc-miR-29a）及8個DEGs（GADD45G、MYH1、MAPK14、SYMPK、SRPX、NRAP、EEA1和IL17RD）進行RT-qPCR驗證，結(jié)果顯示其表達趨勢與測序數(shù)據(jù)高度一致。

3 "討論

脂肪型豬種（中國地方品種）與瘦肉型豬種（歐洲品種）在肌肉特征上存在顯著差異[5]。以沙子嶺豬為代表的脂肪型豬種相較于瘦肉型品種具有更高的肌內(nèi)脂肪[6]。肌內(nèi)脂肪作為肉質(zhì)的重要遺傳指標，可顯著提高肉品的嫩度、多汁性、風(fēng)味和持水能力[7]，同時降低滴水損失和蒸煮損失[8]。沙子嶺豬作為華中地區(qū)代表性品種，于2014年被中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部列為重要遺傳資源保護品種，具有適應(yīng)亞熱帶氣候、耐粗飼、早熟及肉質(zhì)細嫩等特點[9]。

本研究發(fā)現(xiàn)，多個miRNA在沙子嶺豬和大約克夏豬骨骼肌中差異表達，如miR-210和miR-183可能通過調(diào)控骨骼肌肌細胞增殖與分化參與骨骼肌發(fā)育[10-11]。其中，let-7e（屬于10個亞型的let-7家族[4]）和miR-127在大約克夏豬中的表達量是沙子嶺豬的2倍，尤其是miR-127在差異miRNA中豐度最高。盡管其在豬骨骼肌生長發(fā)育中的功能尚未明確，但已有研究證實let-7家族可通過抑制血小板反應(yīng)蛋白抑制劑-1和金屬蛋白酶組織抑制因子-1等抗血管生成因子促進腫瘤血管生成[12]。而與之前研究不同的是[13]，本研究發(fā)現(xiàn)miR-210、miR-183和miR-204在沙子嶺豬背最長肌中高表達，提示這些miRNA可能參與保育豬肌肉功能調(diào)控。

在本研究中轉(zhuǎn)錄組測序所鑒定出的539個差異基因中，共有59個差異基因受到DEMs的調(diào)控，靶基因富集分析結(jié)果表明，大約克夏與沙子嶺斷奶仔豬在肌生成和脂肪代謝方面可能存在顯著差異。GO富集分析顯示，靶基因顯著富集在涉及肌肉收縮調(diào)控、肌肉系統(tǒng)過程調(diào)節(jié)和脂肪酸氧化等多個肌生成相關(guān)通路。KEGG通路分析顯示，5個差異基因（ELK4/GADD45G/MKNK1/IGF1R/MAPK14）富集于MAPK信號通路。該通路不僅是骨骼肌成肌細胞分化的關(guān)鍵調(diào)控通路[14]，還可通過調(diào)控細胞連接相關(guān)通路與脂代謝通路的交互作用影響肌內(nèi)脂肪沉積[15-16]。其中，Gadd45a基因編碼一種小型肌核蛋白，以刺激蛋白質(zhì)分解、減少蛋白質(zhì)合成、減少線粒體、抑制合成代謝信號傳導(dǎo)的方式改變骨骼肌基因表達，可最終導(dǎo)致肌纖維萎縮[17]。此外，也有研究表明，胰島素樣生長因子Ⅰ受體基因編碼的受體蛋白可結(jié)合胰島素和胰島素樣生長因子Ⅰ，通過抑制FoxO轉(zhuǎn)錄因子來維持肌肉質(zhì)量和線粒體功能[18]。

4 "結(jié)論

沙子嶺豬與大約克夏豬背最長肌中miRNA及mRNA表達存在顯著差異，共篩選出9個差異miRNA（DEMs）和553個差異基因（DEGs），并構(gòu)建了包含8個DEMs與59個DEGs的共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（70對互作關(guān)系）。差異表達基因進行了miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建以及miRNA靶基因的搜尋，對上述靶基因進行GO和KEGG富集分析，篩選出了多個與豬骨骼肌生成相關(guān)且可能受到miRNA調(diào)控的關(guān)鍵基因。其關(guān)鍵調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及通路可為豬種遺傳改良及肉質(zhì)性狀的分子育種提供理論依據(jù)。

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