【摘要】目的 "探究解旋酶樣轉(zhuǎn)錄因子（HLTF）對(duì)血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞（CF）中纖維化功能和表型影響及作用機(jī)制。方法 "分離培養(yǎng)原代小鼠CF，用濃度為1 μmol/L的AngⅡ處理CF，分為正常組和AngⅡ組。同時(shí)分別用腺病毒轉(zhuǎn)染下調(diào)或上調(diào)HLTF的表達(dá)，將細(xì)胞進(jìn)一步分為下調(diào)對(duì)照＋AngⅡ組和下調(diào)HLTF＋AngⅡ組及上調(diào)對(duì)照＋AngⅡ組和上調(diào)HLTF＋AngⅡ組。采用CCK-8法和細(xì)胞劃痕檢測(cè)細(xì)胞的增殖和遷移能力。RNA測(cè)序篩選相關(guān)差異基因。免疫印記檢測(cè)HLTF、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）和R-spondin1（Rspo1）蛋白水平。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)膠原蛋白Ⅰ（COL1A1）mRNA水平。免疫熒光染色檢測(cè)α-SMA水平。結(jié)果 "AngⅡ誘導(dǎo)CF后HLTF蛋白及COL1A1 mRNA水平升高，CF增殖及遷移能力增加，且免疫熒光染色顯示α-SMA表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.05）。下調(diào)HLTF＋AngⅡ組與下調(diào)對(duì)照組比，CF中HLTF、α-SMA蛋白及COL1A1 mRNA均降低，CF增殖及遷移能力減弱（P＜0.05）。相反上調(diào)HLTF進(jìn)一步促進(jìn)AngⅡ誘導(dǎo)CF中HLTF、α-SMA蛋白及COL1A1 mRNA表達(dá)，促進(jìn)CF的增殖和遷移能力（P＜0.05）。此外，RNA測(cè)序顯示在下調(diào)HLTF后差異基因中Rspo1改變最顯著。同時(shí)免疫印記結(jié)果表明，AngⅡ誘導(dǎo)的CF中HLTF下調(diào)或上調(diào)，Rspo1蛋白水平相應(yīng)降低或升高。結(jié)論""下調(diào)HLTF可緩解AngⅡ誘導(dǎo)的CF纖維化功能和表型轉(zhuǎn)換，且可能通過(guò)下調(diào)Rspo1改善心臟纖維化。

【關(guān)鍵詞】解旋酶樣轉(zhuǎn)錄因子；心臟成纖維細(xì)胞；血管緊張素Ⅱ；心臟纖維化

【DOI】10.16806/j.cnki.Ⅰissn.1004-3934.2025.02.000

【Abstract】Objective "To investigate the effect and mechanisms of helicase-like transcription factor （HLTF） on fibrosis"function and phenotype in angiotensin Ⅱ （AngⅡ）-induced cardiac fibroblasts （CF）. Methods "Primary mouse CFs were isolated and cultured，and"treated with"1 μmol/L AngⅡ. Cells were divided into normal group and AngⅡ"group. Additionally，adenoviral transfection was used to modulate HLTF expression，resulting in additional groups： downregulation control+AngⅡ group，HLTF downregulation+AngⅡ group，upregulation control+AngⅡ"group and HLTF upregulation+AngⅡ"group."Cell proliferation and migration were assessed using the CCK-8 assay and wound healing assay. RNA sequencing identified differentially expressed genes. Western blot was used to analyze the protein levels of HLTF，α-smooth muscle actin （α-SMA）"and R-spondin1（Rspo1）."Quantitative real-time PCR assessed mRNA levels of collagen"typeⅠ（COL1A1）. Immunofluorescence staining was used to assess"α-SMA expression. Results""AngⅡ"stimulation increased HLTF protein and COL1A1 mRNA levels，enhanced CF proliferation and migration，and elevated α-SMA expression as shown by immunofluorescence staining（P＜0.05）."Compared with the control group，the HLTF downregulation+AngⅡ group showed reduced levels of HLTF，α-SMA protein，and COL1A1 mRNA，as well as decreased CF proliferation and migration （P＜0.05）."Conversely，HLTF upregulation promoted"AngⅡ-induced HLTF，α-SMA protein，and COL1A1 mRNA expression，further enhancing CF proliferation and migration （P＜0.05）.RNA sequencing revealed that Rspo1 was the most significantly altered gene after HLTF downregulation."Western blot confirmed that HLTF downregulation or upregulation correspondingly decreased or increased Rspo1 protein levels in AngⅡ-treated CFs."Conclusion HLTF downregulation can alleviate AngⅡ-induced fibrosis"function and phenotype transformation"in CF，potentially"by suppressing Rspo1，thereby improving cardiac fibrosis.

心臟纖維化是對(duì)應(yīng)激或損傷的病理反應(yīng)，幾乎發(fā)生在心肌梗死、肥厚型心肌病、擴(kuò)張型心肌病和糖尿病心肌病等所有類型的心臟疾病中[1]。心臟纖維化可以增加左心室的僵硬度，破壞心臟傳導(dǎo)，損害心臟收縮和舒張功能。纖維化的存在與心血管死亡率和全因死亡率獨(dú)立相關(guān)[2]。心臟成纖維細(xì)胞（cardiac fibroblast，CF）是纖維化過(guò)程的主要參與者。在初始損傷和促纖維化刺激下，靜止的CF被激活并隨后分化為肌成纖維細(xì)胞（myofibroblast，myoFbs），表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA），表現(xiàn)出增加的增殖和分泌特性，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)和膠原的沉積，導(dǎo)致心室壁僵硬，心臟功能進(jìn)行性損害，最終進(jìn)展為不可逆的心力衰竭[3]。盡管抗血管緊張素藥物、醛固酮拮抗劑等已用于心臟纖維化重構(gòu)的治療，但目前心臟纖維化疾病仍缺乏基于循證醫(yī)學(xué)證據(jù)的有效治療方法。

解旋酶樣轉(zhuǎn)錄因子（helicase-like transcription factor，HLTF）是轉(zhuǎn)換/蔗糖非發(fā)酵（switch/sucrose non-fermenting，SWI/SNF）家族成員之一，具有三磷酸腺苷依賴性解旋酶活性，參與染色質(zhì)重塑、DNA損傷修復(fù)和基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控過(guò)程[4]。此外，HLTF還在泛素-蛋白酶體途徑中發(fā)揮重要作用[5]。在腫瘤研究領(lǐng)域，HLTF因其在抑制腫瘤發(fā)生和維護(hù)基因組穩(wěn)定性方面而受到關(guān)注[6]。已有研究[7]表明HLTF參與新生小鼠心臟中膠原蛋白的生物生成。但HLTF在心臟纖維化中的作用尚不清楚。本研究旨在探討HLTF在心臟纖維化中的作用并探究其潛在機(jī)制。

1 "材料與方法

1.1 "主要試劑與儀器

0.2%膠原酶Ⅱ（德國(guó)BioFroxx公司，2275MG100）；胰蛋白酶（中國(guó)碧云天生物技術(shù)有限公司，C0201）；胎牛血清（美國(guó)Gibco公司，10099-141）；DMEM/F-12細(xì)胞培養(yǎng)基（美國(guó)HyClone公司，SH30023.01）；CCK-8試劑盒（日本同仁，CK04）；SYBR Green Master Mix試劑盒（諾唯贊生物科技有限公司，Q111-02）；血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）（美國(guó)MCE公司，HY-13948）;HLTF抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，14286-1-AP）；α-SMA（美國(guó)Affinity公司，AF1032）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（杭州賢至生物有限公司，AB-P-R 001）；R-spondin1（Rspo1）抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，25348-1-ap）。

1.2 "原代CF的分離與培養(yǎng)

1～3 d齡的SPF級(jí)C57BL/6J小鼠購(gòu)于三峽大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（鄂）2022-0012），經(jīng)武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（WDRM動(dòng)（福）第20240802E號(hào)）。0.1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉乳鼠，75%乙醇中浸泡消毒，迅速取出心臟并用冰Hanks溶液反復(fù)沖洗。將心室組織切成約1 mm3的碎片，0.125%胰蛋白酶4 ℃過(guò)夜后，0.2%膠原酶Ⅱ多次消化后加入含10%胎牛血清的DMEM/F-12完全培養(yǎng)液終止消化。1 200 r/min離心10 min后加入培養(yǎng)液重懸并接種于培養(yǎng)瓶中。1 h后去除非貼壁細(xì)胞，加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液重新培養(yǎng)。24 h后，當(dāng)成纖維細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)，胰蛋白酶消化細(xì)胞并傳代，取第3～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 "心臟纖維化細(xì)胞模型構(gòu)建

在細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)為60%～70%時(shí)，加入含AngⅡ（1"μmol/L）的細(xì)胞完全培養(yǎng)基繼續(xù)在37 ℃下95%空氣和5% CO2培養(yǎng)箱中培育24 h。

1.4 "腺病毒轉(zhuǎn)染

HLTF下調(diào)的短發(fā)夾RNA腺病毒（Ad-shHLTF）及其對(duì)照病毒（Ad-shRNA）和HLTF上調(diào)病毒（Ad-HLTF）及其對(duì)照病毒（Ad-con）由上海吉?jiǎng)P基因公司構(gòu)建。當(dāng)CF為50%～60%融合時(shí)，以病毒感染復(fù)數(shù)為50的Ad-shHLTF或Ad-shRNA分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞4 h。隨后，棄去含有腺病毒的上清，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。Ad-HLTF或Ad-con同上述方法轉(zhuǎn)染CF。免疫印跡法檢測(cè)HLTF的表達(dá)，確定病毒是否轉(zhuǎn)染成功。

1.5 "細(xì)胞分組

分離培養(yǎng)原代小鼠CF后，根據(jù)是否加入1 μmol/L的AngⅡ刺激，分為正常組和AngⅡ組。根據(jù)是否下調(diào)HLTF表達(dá)，分為下調(diào)對(duì)照＋AngⅡ組（Ad-shRNA＋AngⅡ組）和下調(diào)HLTF＋AngⅡ組（Ad-shHLTF＋AngⅡ組）。另外根據(jù)是否上調(diào)HLTF表達(dá)，分為上調(diào)對(duì)照＋AngⅡ組（Ad-con＋AngⅡ組）和上調(diào)HLTF＋AngⅡ組（Ad-HLTF＋AngⅡ組）。

1.6 "細(xì)胞增殖和遷移檢測(cè)

通過(guò)CCK-8試劑盒評(píng)估不同組CF的增殖能力。將細(xì)胞以2×103/孔接種于96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)12 h貼壁，根據(jù)不同分組病毒轉(zhuǎn)染24 h后加入AngⅡ繼續(xù)處理24 h，每孔加入10μL CCK-8試劑后37 ℃培養(yǎng)箱孵育3 h，隨后利用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm的光密度（optical density，OD）值。

細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞密度為70%～80%時(shí)，用無(wú)菌槍頭在孔板劃痕定位并拍照，根據(jù)需要加入含1"μmol/L"AngⅡ及1%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，在同一位置拍照以作對(duì)比，每組采集6個(gè)視野，Image J軟件分析統(tǒng)計(jì)劃痕面積。細(xì)胞遷移率＝（0 h劃痕面積－24 h劃痕面積）/0 h劃痕面積。

1.7 "細(xì)胞免疫熒光染色

細(xì)胞種于6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)至密度為50%～60%時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組、目的給予相應(yīng)處理（病毒轉(zhuǎn)染、AngⅡ）后，棄原培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液漂洗3次，甲醛固定和Triton X-100通透后，用α-SMA（1∶200）的一抗孵育4 ℃過(guò)夜，隨后二抗孵育2 h，磷酸鹽緩沖液漂洗后DAPI染核，熒光顯微鏡隨機(jī)采集每個(gè)樣本的熒光圖像。運(yùn)用Image J軟件分析各組細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度。

1.8 "實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

TRIzol試劑提取細(xì)胞中的總RNA，并用分光光度計(jì)檢測(cè)吸光度比值（A260/A280），計(jì)算RNA濃度，隨后根據(jù)試劑盒說(shuō)明將mRNA逆轉(zhuǎn)成cDNA。使用SYBR Green qPCR Master Mix體系進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）。以GAPDH作為內(nèi)參。最后采用2-ΔΔCt方法分析數(shù)據(jù)。膠原蛋白Ⅰ（COL1A1）、GAPDH引物序列如下：COL1A1正向5’-GACCCTAACCAAGGCTGCAA-3’，反向5’-GACATTAGGCGCAGGAAGGT-3’，GAPDH正向5’-GAGAGTGTTTCCTCGTCCCGTA-3’，反向5’-CCTCACCCCATTTGATGTTAGT-3’。

1.9 "免疫印記檢測(cè)

使用RIPA裂解緩沖液裂解CF提取蛋白。取適量蛋白原液用二喹啉甲酸法進(jìn)行蛋白定量。用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同分子量的蛋白分離，用電轉(zhuǎn)化法將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h后轉(zhuǎn)移至一抗中4 ℃搖床過(guò)夜。加入相應(yīng)的二抗室溫孵育1 h后，使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑將目的條帶顯影，通過(guò)Image J軟件對(duì)蛋白灰度值進(jìn)行分析。以GAPDH作為內(nèi)參。

1.10 "統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism（版本8.2.1）和SPSS 19.0進(jìn)行非配對(duì)t檢驗(yàn)或單因素方差分析。計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，以P＜0.05判定為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 "結(jié)果

2.1 "AngⅡ誘導(dǎo)CF中HLTF表達(dá)上調(diào)并且伴隨細(xì)胞功能紊亂

與正常組相比，AngⅡ處理顯著提高了CF中HLTF蛋白表達(dá)水平，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外COL1A1"mRNA表達(dá)明顯升高（P＜0.05）（圖1A～C）。CCK-8結(jié)果顯示，AngⅡ組CF的增殖能力顯著增強(qiáng)（P＜0.05）（圖1D），并且劃痕試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了AngⅡ組CF遷移能力的增強(qiáng)（P＜0.05）（圖1E～F）。免疫熒光染色也顯示AngⅡ組中α-SMA表達(dá)明顯，提示CF向myoFbs表型轉(zhuǎn)化（圖1G～H）。

2.3""上調(diào)HLTF促進(jìn)AngⅡ誘導(dǎo)的CF的功能紊亂

同時(shí)筆者研究了HLTF上調(diào)對(duì)CF纖維化功能影響。Western blot結(jié)果顯示，與Ad-con＋AngⅡ組相比，Ad-HLTF＋AngⅡ組中HLTF、α-SMA蛋白表達(dá)升高，差異有顯著性（P＜0.05）（圖3A～C）。同時(shí)COL1A1 mRNA也顯著增加（P＜0.05）（圖3D）。CCK-8結(jié)果表明，Ad-HLTF＋AngⅡ組CF增殖能力增強(qiáng)（P＜0.05）（圖3E），并且劃痕試驗(yàn)驗(yàn)證了HLTF上調(diào)后AngⅡ誘導(dǎo)的CF遷移能力增強(qiáng)（P＜0.05）（圖3F～G）。免疫熒光染色也證明Ad-HLTF＋AngⅡ組中α-SMA表達(dá)升高，提示其向myoFbs表型轉(zhuǎn)化進(jìn)一步加強(qiáng)（圖3H～I(xiàn)）。

3 "討論

心臟纖維化是幾乎所有心臟疾病進(jìn)展中的重要病理過(guò)程，導(dǎo)致心臟室壁僵硬和功能下降，從而加劇心力衰竭及不良結(jié)局[8]。在纖維化過(guò)程中，CF通過(guò)增殖和分化為myoFbs，促進(jìn)膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)的沉積[3，9]。多種細(xì)胞因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、AngⅡ、血小板衍生生長(zhǎng)因子等是導(dǎo)致心臟纖維化的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)力[10]。盡管對(duì)纖維化機(jī)制已有較深入研究，但目前仍缺乏有效的特異性治療藥物，這需要進(jìn)一步探索纖維化的關(guān)鍵調(diào)控因素[11]。

HLTF屬于SWI/SNF家族，作為染色質(zhì)重塑和泛素化途徑的調(diào)控因子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞DNA修復(fù)、復(fù)制和轉(zhuǎn)錄等過(guò)程中具有重要作用[4]。既往有研究[12]表明，HLTF作為一種腫瘤抑制基因，在多種癌癥如結(jié)腸癌、胃癌、食管癌和肺癌中往往通過(guò)甲基化而表達(dá)下調(diào)。Liu等[13]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β刺激結(jié)直腸癌細(xì)胞系時(shí)，HLTF及Smad相關(guān)蛋白表達(dá)增加，提示HLTF可能通過(guò)TGF-β-Smad信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞遷移與侵襲。此外，HLTF在肝細(xì)胞癌中的上調(diào)通過(guò)激活ERK/MAPK信號(hào)通路，增強(qiáng)了癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力[14]。在心臟領(lǐng)域，Helmer等[7]的研究顯示，沉默新生小鼠中的HLTF導(dǎo)致心肌間質(zhì)和血管周圍膠原纖維網(wǎng)絡(luò)混亂，改變了心肌組織結(jié)構(gòu)，表明HLTF可能在心臟組織的結(jié)構(gòu)和功能維持中扮演關(guān)鍵角色。然而，關(guān)于HLTF在心臟纖維化中的作用尚未有系統(tǒng)的研究。本研究首次系統(tǒng)性地探討了HLTF在AngⅡ誘導(dǎo)的CF纖維化中的作用。結(jié)果顯示，AngⅡ處理顯著增加了CF中HLTF、COL1A1和α-SMA的表達(dá)，促進(jìn)了細(xì)胞的增殖、遷移及其向myoFbs的表型轉(zhuǎn)化。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，下調(diào)HLTF可降低AngⅡ誘導(dǎo)的CF增殖、遷移及膠原沉積，從而緩解纖維化；相反，上調(diào)HLTF則促進(jìn)了這些纖維化特征的增強(qiáng)。這些都證實(shí)HLTF是調(diào)控心臟纖維化的關(guān)鍵分子。

為探究HLTF調(diào)控纖維化機(jī)制，筆者通過(guò)RNA測(cè)序篩選出Ad-shRNA＋AngⅡ組和Ad-shHLTF＋AngⅡ組差異基因，其中Rspo1表達(dá)最為突出，且與HLTF水平正相關(guān)，提示Rspo1是HLTF調(diào)控的潛在靶分子。Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了Rspo1的表達(dá)隨HLTF的改變而變化。Rspo1是一種重要的分泌性蛋白，在調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用，通過(guò)與受體結(jié)合，增強(qiáng)Wnt信號(hào)通路及促進(jìn)β-catenin的穩(wěn)定和核內(nèi)積累，從而調(diào)控下游基因的表達(dá)[15-16]。在腎臟和肝臟纖維化研究[17-19]中，Rspo1已被證明通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)膠原沉積和纖維化進(jìn)程。而Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活在心臟纖維化中的作用同樣至關(guān)重要[20]。小鼠主動(dòng)脈縮窄模型顯示，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活促進(jìn)了CF的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，而抑制β-catenin可減少Cola1、Col3a1和Postn等纖維化標(biāo)志物的表達(dá)，顯著改善心臟功能，并減少間質(zhì)纖維化[21]。Nayakanti等[22]發(fā)現(xiàn)抑制Wnt信號(hào)可通過(guò)下調(diào)FOSL1和FOSL2的轉(zhuǎn)錄活性減輕心臟纖維化和肥大，從而改善心臟功能。

綜上所述，本研究證實(shí)了下調(diào)HLTF可緩解AngⅡ誘導(dǎo)的CF纖維化功能和表型轉(zhuǎn)換，且可能通過(guò)下調(diào)Rspo1調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路改善心臟纖維化。這一發(fā)現(xiàn)為理解成纖維細(xì)胞在心臟纖維化及心臟重構(gòu)中的作用機(jī)制提供了新的視角，并為治療心臟纖維化提供了新的研究思路。然而，本研究也存在一定的局限性，HLTF與Rspo1之間的具體機(jī)制研究尚不夠深入。未來(lái)的研究可能需要采用免疫共沉淀、下拉實(shí)驗(yàn)等方法來(lái)明確二者之間的相互關(guān)系。

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收稿日期：2024-09-02