摘 要：【目的】通過(guò)對(duì)毛竹Phyllostachys edulis在20% PEG 6000干旱脅迫下不同時(shí)段（0、6、12、24、48 h）的幼苗進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，研究了在干旱脅迫應(yīng)答中調(diào)控細(xì)胞壁形成的差異miRNAs，篩選出與細(xì)胞壁形成相關(guān)的差異miRNAs及其靶基因，旨在為竹子在細(xì)胞壁方面的適應(yīng)性進(jìn)化提供重要的理論依據(jù)，同時(shí)也為竹子的分子育種提供潛在的候選基因資源?！痉椒ā坎捎蒙镄畔W(xué)的方法對(duì)干旱處理的毛竹葉片進(jìn)行差異分析，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)和雙熒光素酶試驗(yàn)驗(yàn)證其表達(dá)模式及靶向作用?！窘Y(jié)果】在15個(gè)樣品中發(fā)現(xiàn)了408個(gè)miRNAs，包括51個(gè)已知的miRNA、357個(gè)新預(yù)測(cè)的miRNA和7 105個(gè)預(yù)測(cè)的靶基因。在干旱脅迫下，共有52個(gè)差異表達(dá)的miRNAs，挖掘到3個(gè)差異表達(dá)miRNAs：novel_miR116、novel_miR276和novel_miR2，對(duì)應(yīng)靶基因在京都基因組百科全書(shū)（KEGG）上富集到與細(xì)胞壁形成密切相關(guān)的通路上；PH02Gene11396編碼類固醇5-α-還原酶（Det2），PH02Gene36673、PH02Gene36674、PH02Gene21400編碼阿魏酸-5-羥基化酶（F5H）；PH02Gene50651編碼生長(zhǎng)素反應(yīng)蛋白（AUX/IAA）；目標(biāo)miRNA的整體表達(dá)量隨著干旱脅迫程度的加深而降低，靶基因的表達(dá)量則隨著干旱脅迫程度的加深而升高；目標(biāo)miRNA與靶基因混合后的雙熒光酶活性顯著低于miRNA空載體與靶基因混合的酶活性，同一煙草葉片上右側(cè)注射miRNA -mRNA的熒光強(qiáng)度明顯低于左側(cè)注射miRNA空載體-mRNA的熒光強(qiáng)度。【結(jié)論】本研究篩選出了3個(gè)目標(biāo)miRNA和4個(gè)靶基因，揭示了以下的負(fù)調(diào)控靶向關(guān)系：novel_miR116與PH02Gene11396、novel_miR276與PH02Gene36673/PH02Gene36674、novel_ miR2與PH02Gene50651。這些目標(biāo)miRNAs可能通過(guò)調(diào)控油菜素內(nèi)酯、木質(zhì)素單體和生長(zhǎng)素反應(yīng)蛋白的表達(dá)，從而影響細(xì)胞壁的形成。

關(guān)鍵詞：毛竹；miRNA；細(xì)胞壁形成；干旱脅迫；靶基因

中圖分類號(hào)：S792.39；S722.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-923X（2025）02-0153-12

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021YFD2200504_4）。

Identification and differential analysis of miRNAs associated with cell wall formation in Phyllostachys edulis under drought stress

GAO Yuanmeng1，2， LIN Xiaofang1，2， YANG Yang1，2， LI Ying1，2， LI Xueping1，2

（1.International Center for Bamboo and Rattan， Beijing 100102， China； 2.Key Laboratory of National Forestry and Grassland Administration/Beijing for Bamboo and Rattan Science and Technology， Beijing 100102， China）

Abstract：【Objective】Through high-throughput transcriptome sequencing of seedlings of Phyllostachys edulis under 20% PEG 6000 drought stress at different time periods （0， 6， 12， 24， 48 h）， we investigated the differential miRNAs that regulate the cell wall formation in response to the drought stress， and screened for the differential miRNAs and their target genes. This study aims to provide an important theoretical basis for the adaptive evolution of bamboo in terms of cell wall， as well as potential candidate gene resources for molecular breeding of bamboo.【Method】Differential analysis of drought-treated moso bamboo leaves was carried out by bioinformatics， and the expression patterns and targeting roles were verified by real-time fluorescence quantification and dual-luciferase assay.【Result】408 miRNAs were identified in 15 samples， including 51 known miRNAs， 357 newly predicted miRNAs and 7 105 predicted target genes. A total of 52 differentially expressed miRNAs were found under drought stress， and three differentially expressed miRNAs were unearthed： novel_miR116， novel_miR276 and novel_miR2， corresponding to target genes enriched on the Kyoto Encyclopedia of the Genome（KEGG） to pathways closely related to cell wall formation； PH02Gene11396 encodes steroid 5-α-reductase （Det2）， PH02Gene36673， PH02Gene36674， and PH02Gene21400 encode ferulic acid-5-hydroxylase （F5H）； and PH02Gene50651 encodes growth hormoneresponsive protein （AUX/IAA）； the overall expression of the target miRNA decreased with the deepening of drought stress， while the expression of the target gene increased with the deepening of drought stress； the dual luciferase activity of the target miRNA mixed with the target gene was significantly lower than that of the miRNA empty vector mixed with the target gene， and the fluorescence intensity of the right injected miRNA-mRNA was significantly lower than the fluorescence intensity of the left injected miRNA empty vectormRNA on the same tobacco leaf.【Conclusion】Three target miRNAs and four target genes were screened in this study， revealing the following negative regulatory targeting relationships： novel_miR116 with PH02Gene11396， novel_miR276 with PH02Gene36673/ PH02Gene36674， novel_miR2 with PH02Gene50651. these target miRNAs may affect cell wall formation by regulating the expression of oleoresin lactones， lignin monomers， and growth hormone response proteins.

Keywords： Phyllostachys edulis； miRNA； cell wall formation； drought stress； target gene

毛竹Phyllostachys edulis是我國(guó)種植面積最大、利用價(jià)值最高的竹種，作為禾本科Poaceae剛竹屬Phyllostachys的單軸散生型常綠喬木狀竹類植物，其生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)量高、可再生能力強(qiáng)，是木材的絕佳替代品[1-3]。竹材的性質(zhì)與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和組成密切相關(guān)，其機(jī)械強(qiáng)度由細(xì)胞壁的纖維素含量和微纖絲角度決定，影響抗拉和抗壓能力[4]。彈性模量則由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的比例決定，影響材料的彈性和變形能力[5-6]。細(xì)胞壁的密度和木質(zhì)素含量決定了竹材的硬度，而木質(zhì)素和多糖類物質(zhì)的交聯(lián)情況影響其韌性[7]。竹材的耐久性則依賴于細(xì)胞壁的化學(xué)組成，特別是木質(zhì)素和抽提物的含量[8-9]。這些細(xì)胞壁特性共同決定了竹材在各種應(yīng)用中的表現(xiàn)和耐用性。

在面對(duì)非生物脅迫時(shí)，植物會(huì)產(chǎn)生一系列的應(yīng)答反應(yīng)，其中非常重要的一點(diǎn)是細(xì)胞壁特性會(huì)發(fā)生很大的改變[10-11]。有研究表明，在面對(duì)干旱脅迫時(shí)，構(gòu)成細(xì)胞壁成分的木質(zhì)素、纖維素、多糖等物質(zhì)的含量會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化[12-15]，導(dǎo)致為毛竹提供機(jī)械支持的細(xì)胞壁會(huì)發(fā)生一定程度的硬化[16]。此外，還有許多細(xì)胞壁酶參與了植物對(duì)水分脅迫的應(yīng)答反應(yīng)[17-18]。

MicroRNA（miRNA）在細(xì)胞壁生物合成過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[19-20]。一系列研究表明，在擬南芥Arabidopsis thaliana、楊樹(shù)Populus L.等樹(shù)種中，miRNA均可通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子從而介導(dǎo)細(xì)胞壁的生物合成，如MYB[21]、NAC[22]、TCP[23]等。在毛竹中，近年來(lái)在miRNA調(diào)控細(xì)胞壁形成方面也取得了顯著進(jìn)展。研究表明，miRNA可以調(diào)控參與細(xì)胞壁合成的關(guān)鍵基因，如次生細(xì)胞壁生物合成中的轉(zhuǎn)錄因子基因[24]。特定的miRNA，如miR166，被發(fā)現(xiàn)調(diào)控維管組織分化[25]。此外，多組學(xué)研究揭示了miRNA通過(guò)調(diào)控C3H和MYB家族轉(zhuǎn)錄因子間接影響細(xì)胞壁成分合成基因的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞壁厚度和機(jī)械強(qiáng)度，同樣也構(gòu)建出miRNA-轉(zhuǎn)錄因子的木質(zhì)化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[26]。但對(duì)毛竹中miRNA調(diào)控細(xì)胞壁形成的研究仍處于起步階段，如何在外界環(huán)境不利的條件下，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞壁生物合成從而提高環(huán)境適應(yīng)性還少有研究。進(jìn)一步的深入研究將有助于揭示更多的分子機(jī)制，并推動(dòng)竹子在分子育種和抗逆性改良中的應(yīng)用。

本研究以梯度干旱處理后的毛竹為材料，通過(guò)高通量測(cè)序分析所有樣品中的miRNA表征，重點(diǎn)關(guān)注參與細(xì)胞壁形成調(diào)控的差異表達(dá)的miRNAs，并對(duì)靶基因進(jìn)行功能注釋?；谏镄畔W(xué)預(yù)測(cè)，從miRNA靶基因的功能通路與細(xì)胞壁合成的高相關(guān)性，以及miRNA自身的高表達(dá)量2個(gè)維度出發(fā)，篩選出3個(gè)可能在細(xì)胞壁形成過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用的miRNAs。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR（RT-qPCR）和雙熒光素酶驗(yàn)證miRNA的表達(dá)模式及與預(yù)測(cè)靶基因的靶向作用，以期挖掘在竹子細(xì)胞壁形成過(guò)程中可能發(fā)揮調(diào)控作用的miRNAs，為改善竹子材性和增強(qiáng)其逆境抗性提供理論依據(jù)和候選基因。

1 材料與方法

1.1 植物材料、生長(zhǎng)環(huán)境和處理

毛竹種子采集于廣西壯族自治區(qū)，種植在含有腐殖質(zhì)土∶蛭石（7∶3）的塑料盆中，培養(yǎng)條件為25 ℃光照16 h/18 ℃黑暗8 h。

在毛竹幼苗生長(zhǎng)至3個(gè)月大時(shí)，利用20%的聚乙二醇6000（PEG 6000）模擬干旱處理。在澆灌后的0、6、12、24以及48 h的時(shí)間點(diǎn)，選取相同位置的葉片作為樣品。在采集樣品的過(guò)程中，每組3株毛竹幼苗的葉片被合并作為一個(gè)試驗(yàn)樣品。樣品采集后，立即將其置于液氮中快速冷凍，以保持樣品完好無(wú)損。完成冷凍的葉片樣品隨后被存放在-80 ℃的低溫冰箱中，以便后續(xù)試驗(yàn)分析。

每個(gè)樣品3次生物學(xué)重復(fù)：0 h干旱處理（P11、P12、P13），6 h干旱處理（P21、P22、P23），12 h干旱處理（P31、P32、P33），24 h干旱處理（P41、P42、P43），48 h干旱處理（P51、P52、P53）。

1.2 總RNA提取、small RNA文庫(kù)構(gòu)建和miRNA表達(dá)量分析

使用總RNA快速提取試劑盒（TR205，北京簡(jiǎn)石生物技術(shù)有限公司），根據(jù)生產(chǎn)廠家的說(shuō)明書(shū)分離總RNA。使用NanoDrop 8000（Thermo Fisher Scientific， Bothell， WA， 美國(guó)）測(cè)定RNA濃度。

為了鑒定miRNAs并將其與干旱脅迫下毛竹細(xì)胞壁形成相關(guān)聯(lián)，在干旱處理0 h（P1）、6 h（P2）、12 h（P3）、24 h（P4）、48 h（P5）后采集毛竹葉片樣品，并構(gòu)建cDNA文庫(kù)，文庫(kù)構(gòu)建嚴(yán)格按照NEB Next Ultra small RNA Sample Library Prep Kit for Illumina試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行。對(duì)合格的文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為Illumina novaseq6000，測(cè)序讀長(zhǎng)為single-end 50 nt（SE50）。對(duì)各樣本中miRNA進(jìn)行表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)，并用TPM算法對(duì)表達(dá)量進(jìn)行歸一化處理[27]。

本研究的原始序列數(shù)據(jù)已上傳至中國(guó)國(guó)家生物信息中心/中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所（GSA：CRA015504）的國(guó)家基因組學(xué)數(shù)據(jù)中心（Nucleic Acids Res 2022）的基因組序列檔案（Genomics，Proteomics Bioinformatics 2021）中，可在https：// ngdc.cncb.ac.cn/gsa公開(kāi)訪問(wèn)。

1.3 已知miRNA的鑒定與未知miRNA預(yù)測(cè)

將比對(duì)到參考基因組的reads與miRBase（v22）數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知miRNA的成熟序列及其上游2 nt與下游5 nt的范圍進(jìn)行比對(duì)，最多允許一個(gè)錯(cuò)配，這樣鑒定到的reads被認(rèn)為是已知miRNA。miRNA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)多位于基因間隔區(qū)、內(nèi)含子以及編碼序列的反向互補(bǔ)序列上，其前體具有標(biāo)志性的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，成熟體的形成是由Dicer/DCL酶的剪切實(shí)現(xiàn)的。

針對(duì)miRNA的生物特征，對(duì)于未鑒定到已知miRNA的序列，利用miRDeep2[28]軟件，結(jié)合比對(duì)到基因組上的位置信息得到可能的前體序列，基于miRNA產(chǎn)生特點(diǎn)mature、star、loop及前體結(jié)構(gòu)能量信息采用貝葉斯模型打分，最終實(shí)現(xiàn)新 miRNA預(yù)測(cè)[29]。

1.4 差異表達(dá)miRNAs的鑒定及靶基因預(yù)測(cè)

檢測(cè)差異表達(dá)miRNAs時(shí)，采用EdgeR軟件進(jìn)行樣品組間的差異表達(dá)分析[30]，獲得2個(gè)生物學(xué)條件之間的差異表達(dá)miRNAs集，使用|log2（FC）|≥1.00、P≤0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。差異倍數(shù)（Fold change，F(xiàn)C）表示兩樣品（組）間表達(dá)量的比值。原有假設(shè)得到的顯著性P值（P-value）可以表示為表達(dá)無(wú)差異的概率。

根據(jù)已知miRNA和新預(yù)測(cè)的miRNA與對(duì)應(yīng)物種的基因序列信息，使用TargetFinder軟件進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)[31]。

1.5 差異表達(dá)miRNAs的靶基因功能富集分析

使用BLAST軟件將預(yù)測(cè)靶基因序列與GO[32]、KEGG[33]數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得靶基因的注釋信息。利用富集因子（Enrichment factor）分析通路的富集程度，并利用Fisher精確檢驗(yàn)方法計(jì)算富集顯著性。

1.6 miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可視化

為了進(jìn)一步探索miRNA的功能，通過(guò)Cytoscape（v3.7.2）生成了miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖[34]。

1.7 目標(biāo)miRNA與靶基因RT-qPCR驗(yàn)證

根據(jù)miRNA的成熟體序列，借助miRNA Design V1.01軟件上設(shè)計(jì)反轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物、正向引物、反向通用引物；按照miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit （by stem-loop）（Vazyme， MQ101）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作，將U6作為miRNA內(nèi)參基因[35]，按照miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme MR101）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析。

利用Primer Premier 5設(shè)計(jì)靶基因RT-qPCR引物，并驗(yàn)證引物的特異性；選用NTB為靶基因內(nèi)參基因[36]，按照2×SYBR qPCR MasterMix（中科瑞泰，RTQ3101）進(jìn)行定量分析，并使用2-ΔΔCt方法計(jì)算miRNA和靶基因的相對(duì)表達(dá)量[36]。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告驗(yàn)證目標(biāo)miRNA同mRNA的靶向作用

利用RNAhybrid軟件，預(yù)測(cè)novel_miR276、novel_miR116、novel_miR2在其靶基因上的結(jié)合位點(diǎn)，然后分別將包含靶位點(diǎn)在內(nèi)的前后100 bp左右的序列和miRNA的前體序列構(gòu)建至pGreenⅡ0800-miRNA、pGreenⅡ-62-SK載體。使用雙熒光素酶報(bào)告試劑盒（Vazyme， DL101）和酶標(biāo)儀測(cè)定螢火蟲(chóng)熒光素酶（Firefly luciferase）報(bào)告基因與海腎熒光素酶（Renilla luciferase）報(bào)告基因活性，最終計(jì)算酶活在對(duì)照組與試驗(yàn)組的變化，并在熒光成像儀中拍攝注射的煙草葉片。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛竹的測(cè)序分析與miRNA表征統(tǒng)計(jì)

干旱處理0 h（P1）、6 h（P2）、12 h（P3）、24 h（P4）、48 h（P5）后采集毛竹葉片，其小RNA（Small RNA）測(cè)序共得到188.58 Mb Clean reads，每個(gè)樣品的Clean data平均值達(dá)12.57 Mb，Q30在95.67%～97.21%。各樣品中共獲得408個(gè)miRNAs，其中已知51個(gè)miRNA，新預(yù)測(cè)357個(gè)miRNA。

各個(gè)樣品的3個(gè)重復(fù)間的相關(guān)性相對(duì)較大，梯度干旱處理時(shí)間相差越大，相關(guān)性越小，如P1與P5的相關(guān)系數(shù)整體小于P4與P5的相關(guān)系數(shù)（圖1A）；每組處理3個(gè)重復(fù)間的樣品miRNA表達(dá)量中位數(shù)基本一致，數(shù)據(jù)分布較集中，波動(dòng)性?。▓D1B）；各個(gè)樣品間的miRNA表達(dá)量密度曲線趨于重合，其表達(dá)模式基本一致（圖1C）；每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)樣品間的miRNA長(zhǎng)度均集中在21 nt和24 nt，其余長(zhǎng)度分布較少（圖1D）。

成熟miRNA長(zhǎng)度主要集中在20～24 nt，已知的miRNA長(zhǎng)度大多集中在21 nt，新預(yù)測(cè)的miRNA大多集中在24 nt（圖2A）。在識(shí)別和切割前體miRNA時(shí)，5′端首位堿基對(duì)U具有很強(qiáng)的偏向性。通過(guò)分析miRNA的堿基偏好性，獲得典型的miRNA堿基比例。已知miRNA的堿基中U、G、 C所占比例較高，新預(yù)測(cè)的miRNA堿基中U、A、G的占比較高；長(zhǎng)度在20～23 nt的miRNA在5′端的首位堿基均對(duì)U有極強(qiáng)的偏好性，長(zhǎng)度在24 nt的已知miRNA在5′端的首位堿基對(duì)G有較強(qiáng)的偏好性，但同等長(zhǎng)度新預(yù)測(cè)的miRNA則對(duì)A有較強(qiáng)的偏好性（圖2B、C）。

2.2 毛竹響應(yīng)干旱脅迫的差異表達(dá)miRNAs分析

與對(duì)照組（P1-0 h）相比，處理組（P2-6 h、P3-12 h、P4-24 h和P5-48 h）共檢測(cè)到52個(gè)差異表達(dá)miRNAs。在52個(gè)差異表達(dá)miRNAs中，4組比較中不存在共同的差異miRNA，在P1與P3、P4、P5組比較中存在9個(gè)共同的差異miRNA，在P1與P2、P3、P4組的比較中存在2個(gè)共同的差異miRNA（圖3A）。相比較來(lái)說(shuō)，每組處理的下調(diào)miRNA數(shù)量均多于上調(diào)miRNA數(shù)量，下調(diào)模式的差異miRNA數(shù)量總體超過(guò)上調(diào)差異miRNA數(shù)量24個(gè)（圖3B）。

根據(jù)GO富集分析結(jié)果（圖4A），靶基因參與生物過(guò)程（Biological Process， BP）、細(xì)胞成分（Cellular component， CC）和分子功能（Molecular function， MF）3類。在生物過(guò)程類別中，大多數(shù)靶基因富集于細(xì)胞過(guò)程（GO：0009987）、代謝過(guò)程（GO：0008152）、單個(gè)有機(jī)體過(guò)程（GO：0044699）、生物調(diào)控（GO：0065007）和刺激響應(yīng)（GO：0050896）。在細(xì)胞成分類別中，大多數(shù)靶基因富集在細(xì)胞（GO：0005623）、細(xì)胞部分（GO：0044464）、細(xì)胞器（GO：0043226）和膜部分（GO：0044425）。此外，在分子功能類別中，大多數(shù)靶基因富集在結(jié)合（GO：0005488）、催化活性（GO：0003824）、轉(zhuǎn)座子活性（GO：0005215）和核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性（GO：0001071）。

對(duì)于KEGG富集分析（圖4B），所有差異表達(dá)miRNAs靶基因最密切相關(guān)的代謝途徑是丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝（ko00250）、囊泡運(yùn)輸中的SNARE相互作用（ko04130）、類固醇的生物合成（ko00905）、硫代謝（ko00920）和植物晝夜節(jié)律（ko04712）。

2.3 基于miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)的差異表達(dá)miRNAs篩選

深入分析miRNA的靶基因KEGG富集通路發(fā)現(xiàn)，油菜素內(nèi)酯生物合成（ko00905）、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（ko00940）和苯丙酮的生物合成（ko04075）富集到大量基因且存在與細(xì)胞壁生物合成密切相關(guān)的靶基因。在油菜素內(nèi)酯生物合成通路中PH02Gene11396編碼類固醇5-α-還原酶（Det2）；在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，PH02Gene36673、PH02Gene36674、PH02Gene21400編碼阿魏酸-5-羥基化酶（F5H）；在苯丙酮的生物合成通路中PH02Gene50651編碼生長(zhǎng)素反應(yīng)蛋白（AUX/IAA）。

根據(jù)miRNA與mRNA之間的潛在關(guān)系，結(jié)合GO和KEGG功能注釋，初步篩選出在細(xì)胞壁生物合成中發(fā)揮作用的3個(gè)miRNA，即novel_ miR116、novel_miR276和novel_miR2進(jìn)行后續(xù)研究，通過(guò)繪制miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，最終選擇novel_miR276-PH02Gene36674/PH02Gene36673/ PH02Gene21400、novel_miR116-PH02Gene11396和novel_miR2-PH02Gene50651（圖5）進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證。具體靶位點(diǎn)序列見(jiàn)表1。

2.4 目標(biāo)miRNAs及靶基因的RT-qPCR驗(yàn)證

將上述3個(gè)差異表達(dá)miRNAs進(jìn)行表達(dá)分析，結(jié)果表明，novel_miR116在干旱脅迫的條件下，總體表達(dá)量與對(duì)照組相比是下降的，總體趨勢(shì)是先上升后下降（圖6A），與RNA-seq測(cè)序的結(jié)果一致。在P2、P3、P4處理中，miRNA的表達(dá)趨勢(shì)是上升的，其靶基因的表達(dá)量是下降的（圖6B），表明了其負(fù)調(diào)控作用；novel_miR276在干旱脅迫的條件下，總體表達(dá)量與對(duì)照組相比是下降的，除P2處理外，整體趨勢(shì)是先上升后下降（圖6C）。因其對(duì)應(yīng)多個(gè)靶基因，總體趨勢(shì)并不完全相符（圖6D～F）。novel_miR2在干旱脅迫的條件下，總體表達(dá)量與對(duì)照組相比是下降的，整體趨勢(shì)是先上升后下降，對(duì)應(yīng)靶基因在干旱脅迫條件下，總體表達(dá)量與對(duì)照組相比下降明顯（圖6G～H）。因此，在不同的干旱脅迫階段，miRNA與其靶基因存在不同程度的負(fù)調(diào)控作用。

2.5 雙熒光素酶試驗(yàn)揭示miRNAs特異性結(jié)合靶基因

與對(duì)照組（EV+靶基因）相比，試驗(yàn)組的酶活性均顯著降低（圖7A～D）。在熒光成像儀下，同一葉片上左側(cè)注射空載體（EV+靶基因）的熒光強(qiáng)度均明顯高于右側(cè)注射（miRNA-mRNA）的熒光強(qiáng)度（圖7E～H），進(jìn)一步證實(shí)了novle_miR116、novel_miR276、novel_miR2及其預(yù)測(cè)靶基因的靶向調(diào)控作用，這3個(gè)miRNA（novel_ miR116、novel_miR276、novel_miR2）分別與4個(gè)目標(biāo)基因（PH02Gene11396、PH02Gene36673、PH02Gene36674、PH02Gene50651）特異性結(jié)合。

3 討論與結(jié)論

3.1 討 論

干旱是影響植物生長(zhǎng)、發(fā)育和作物生產(chǎn)力的最普遍的環(huán)境壓力，miRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控是植物應(yīng)對(duì)干旱脅迫的重要機(jī)制[37]。許多干旱誘導(dǎo)的miRNA已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在植物中通過(guò)影響生長(zhǎng)發(fā)育、滲透脅迫耐受性、抗氧化防御、植物激素介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)和延遲衰老的調(diào)節(jié)基因來(lái)增加對(duì)干旱脅迫的耐受性[38-39]。干旱期miRNAs的主要靶標(biāo)是編碼轉(zhuǎn)錄因子基因，參與植物激素信號(hào)生長(zhǎng)素和ABA信號(hào)通路[40-42]，本研究篩選到的novel_miR2同樣位于生長(zhǎng)素信號(hào)通路中。

miRNA雖然不能編碼蛋白質(zhì)，但是具有調(diào)控靶基因的作用，當(dāng)受到逆境脅迫時(shí)，miRNA可通過(guò)結(jié)合靶基因mRNA來(lái)抑制其表達(dá)從而保護(hù)自身和相關(guān)信號(hào)通路[43]。miRNA對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控方式主要有3種，即miRNA介導(dǎo)切割靶基因、抑制翻譯和轉(zhuǎn)錄沉默[44-46]。一般miRNA主要通過(guò)剪切降解靶基因或者抑制其翻譯達(dá)到調(diào)控的目的[47]，miRNA與靶基因之間的調(diào)控關(guān)系是植物基因表達(dá)復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的一個(gè)重要組成部分。這種調(diào)控機(jī)制是極其復(fù)雜的，這種多對(duì)多的關(guān)系使得miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)具有高度的復(fù)雜性和動(dòng)態(tài)性。miRNA的表達(dá)模式在不同的組織和發(fā)育階段是特異性的，miRNA不僅調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率，還可能影響其他調(diào)控分子（如轉(zhuǎn)錄因子、長(zhǎng)非編碼RNA等）的活性，形成多層次的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。miRNA的生物合成和成熟過(guò)程涉及多個(gè)步驟，包括轉(zhuǎn)錄、剪切、出核和成熟等，這些過(guò)程中的任何變化都可能影響miRNA的最終功能。miRNA過(guò)表達(dá)的情況下，靶基因表達(dá)受抑制，但可能會(huì)激活鄰近基因的表達(dá)[48-49]，這可能也是不易得到與預(yù)期結(jié)果相符miRNA的原因之一。前人研究發(fā)現(xiàn)，除了極少數(shù)的miRNAs能夠正調(diào)控靶基因外[50]，絕大多數(shù)的miRNAs對(duì)靶基因的調(diào)控均為負(fù)調(diào)控[51]。

在本研究中，novel_miR116-PH02Gene11396、novel_miR276-PH02Gene36673/PH02Gene36674、novel_miR2-PH02Gen50651均為負(fù)調(diào)控。Det2基因在擬南芥、亞麻L(zhǎng)inum usitatissimum、楊樹(shù)等植物中均被發(fā)現(xiàn)參與細(xì)胞壁調(diào)控[52-53]；F5H基因是細(xì)胞壁主要成分之一木質(zhì)素的重要合成單體；生長(zhǎng)素響應(yīng)因子在參與細(xì)胞壁調(diào)控中的作用在竹子中已被證實(shí)，因此本研究推測(cè)novel_miR116、novel_miR276、novel_miR2可能通過(guò)影響油菜素內(nèi)酯、木質(zhì)素單體和生長(zhǎng)素響應(yīng)因子表達(dá)，從而起到調(diào)控細(xì)胞壁形成的作用。

細(xì)胞壁的形成調(diào)控機(jī)理復(fù)雜，涉及基因眾多，細(xì)胞壁各成分含量、沉積方向、結(jié)晶度、聚合度的改變均能夠影響細(xì)胞壁的理化特性。本研究盡管通過(guò)RT-qPCR和雙熒光素酶試驗(yàn)驗(yàn)證了目標(biāo)miRNA與其靶基因的關(guān)系，但對(duì)這些miRNA在細(xì)胞壁形成中的具體功能和機(jī)制仍缺乏深入研究。進(jìn)一步的功能驗(yàn)證試驗(yàn)是必要的，后續(xù)將進(jìn)一步利用基因敲除或過(guò)表達(dá)等功能驗(yàn)證方法研究miRNA的調(diào)控功能，從而完善細(xì)胞壁形成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

3.2 結(jié) 論

本研究從干旱脅迫下的15個(gè)毛竹樣品中鑒定出408個(gè)長(zhǎng)度集中在20～24 nt的miRNAs，其中共52個(gè)差異表達(dá)miRNAs，基于生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，從miRNA靶基因的功能通路與細(xì)胞壁合成的高相關(guān)性，以及miRNA自身的高表達(dá)量2個(gè)維度出發(fā)，篩選出3個(gè)可能在細(xì)胞壁形成過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用的miRNAs。分別是novel_miR116、novel_miR276、novel_miR2，RT-qPCR和雙熒光素酶試驗(yàn)分析揭示了以下的負(fù)調(diào)控靶向關(guān)系：novel_miR116與PH02Gene11396、novel_miR276與PH02Gene36673/PH02Gene36674、novel_miR2與PH02Gene50651。這些目標(biāo)miRNAs可能通過(guò)調(diào)控油菜素內(nèi)酯、木質(zhì)素單體和生長(zhǎng)素反應(yīng)蛋白的表達(dá)，從而影響細(xì)胞壁的形成。

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[本文編校：吳 彬]