【摘要】 背景 復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（RSA）是常見的生殖障礙性疾病，在胚胎植入過程中，子宮內(nèi)膜發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），RSA的發(fā)生與該過程減弱密切相關(guān)。子宮內(nèi)膜來源外泌體及其攜帶的miRNA參與細(xì)胞間通訊，影響細(xì)胞EMT，與RSA關(guān)系密切，但具體作用機(jī)制尚不明確。目的 本研究聚焦于外泌體在細(xì)胞EMT中的功能，通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證子宮內(nèi)膜來源外泌體及其分泌的miRNA-221對(duì)RSA小鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞EMT的調(diào)控作用。方法 2021年10月—2022年5月，選取SPF級(jí)、健康8周齡雌性小鼠24只，隨機(jī)選取12只作為正常對(duì)照組，剩余12只小鼠制作RSA模型，造模結(jié)束后雌雄合籠，妊娠第4日處死雌性小鼠，分離和培養(yǎng)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞并收集外泌體，通過透射電鏡和免疫印跡法（WB）進(jìn)行外泌體鑒定；通過CCK-8、Transwell和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外泌體干預(yù)前后兩組細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力；細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白［E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、基質(zhì)金屬蛋白酶7（MMP-7）、MMP-9］及外泌體標(biāo)志蛋白（CD63、CD81、TSG101）的表達(dá)；外泌體處理后的細(xì)胞EMT標(biāo)志蛋白（CD24- APC、CD44- FITC）的表達(dá)；轉(zhuǎn)染miRNA-221模擬物和抑制物分析外泌體源性miRNA-221對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞EMT的作用，并通過WB和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)進(jìn)行分析。結(jié)果 RSA組小鼠的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞具有異常的EMT，小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞能夠分泌外泌體。添加外泌體的RSA組細(xì)胞增殖率、遷移能力、侵襲能力、CD44+/CD24+表達(dá)水平高于細(xì)胞上清液RSA組（Plt;0.05）。與細(xì)胞上清液RSA組相比，添加外泌體的RSA組細(xì)胞的EMT標(biāo)志蛋白E-cadherin水平降低，間質(zhì)樣標(biāo)志蛋白N-cadherin和Vimentin以及基質(zhì)標(biāo)志蛋白MMP-7、MMP-9蛋白水平升高（Plt;0.05）。RSA組miRNA-221表達(dá)水平低于正常對(duì)照組（Plt;0.05）。與對(duì)照隨機(jī)miRNA相比，miRNA-221模擬物激活了PI3K-AKT通路、NF-κB通路和p38通路（Plt;0.05）。與對(duì)照隨機(jī)miRNA相比，miRNA-221模擬物降低了PTEN mRNA的表達(dá)水平（Plt;0.05），而miRNA-221抑制劑轉(zhuǎn)染則增加了PTEN mRNA的表達(dá)水平（Plt;0.05）。結(jié)論 子宮內(nèi)膜來源外泌體miRNA-221可通過負(fù)向調(diào)控Pten基因，激活PI3K-AKT通路，促進(jìn)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞EMT，影響RSA妊娠結(jié)局。

【關(guān)鍵詞】 復(fù)發(fā)性流產(chǎn)；上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化；外泌體；miRNA-221；Pten基因；PI3K-AKT通路

【中圖分類號(hào)】 R 714.21 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2023.0768

Exosomes Regulate Epithelial Mesenchymal Transition of Endometrial Cells in Mice with Recurrent Spontaneous Abortion

LI Mengyuan，LI Guanshan，HAN Qian，LI Siyao，ZHENG Shuchang，XIN Mingwei，YIN Xiaodan，WANG Jingshang，WU Ying，HE Junqin*

Department of Traditional Chinese Medicine，Beijing Obstetrics and Gynecology Hospital，Capital Medical University，Beijing Maternal and Child Health Care Hospital，Beijing 100026，China

*Corresponding author：HE Junqin，Professor/Doctoral supervisor；E-mail：hejunqin@ccmu.edu.cn

【Abstract】 Background Recurrent spontaneous abortion（RSA） is a common reproductive disorder closely linked with the weakened epithelial-mesenchymal transition（EMT） in the endometrium during embryo implantation. Endometrium-derived exosomes and miRNAs they transport are linked with RSA via the involvement in cellular communication and EMT，although the specific mechanisms have not yet fully revealed. Objective Focusing on the function of exosomes in EMT，this study aims to validate the regulatory role of endometrium-derived exosomes and miRNA-221 they transport in EMT of endometrial cells in RSA mice. Methods From October 2021 to May 2022，a total of 24 eight-week-old female mice in the specific pathogen-free（SPF） level were randomly assigned into the control group（n=12） and RSA group（n=12） for modeling. After RSA modeling，male and female mice were housed together. On the 4th day of pregnancy，female mice were sacrificed for isolating endometrial epithelial cells. They were cultured for extracting exosomes，which were identified by transmission electron microscopy and Western blotting. Cell proliferation，invasion，and migration abilities were evaluated using CCK-8 assay，Transwell assay，and fluorescence-activated cell sorting（FACS） before and after exosome interventions. Expression levels of EMT-related genes［E-cadherin，N-cadherin，Vimentin，matrix metalloproteinase 7（MMP-7），matrix metalloproteinase 9（MMP-9）］ and exosome marker proteins［CD63，CD81，tumor susceptibility gene 101（TSG101）］ were measured. Expression levels of EMT marker proteins（CD24-APC，CD44- FITC） in exosome-treated cells were analyzed. Transfection of miRNA-221 mimics and inhibitors was performed to analyze the effects of exosome-derived miRNA-221 on EMT of endometrial epithelial cells in RSA mice. Relevant analyses were conducted using Western blot and dual-luciferase reporter assay. Results Abnormal EMT was observed in the endometrial epithelial cells of mice in RSA group，and the mouse endometrial epithelial cells were able to secrete exosomes. The proliferation rate，migration ability，invasion ability，and CD44+/CD24+ ratio of cells in the RSA group treated with exosomes were significantly higher than those measured in cell supernatant of RSA group without exosome intervention（Plt;0.05）. Compared with those in the cell supernatant of RSA group，induction of exosomes significantly downregulated EMT marker protein E-cadherin，but upregulated stromal marker proteins N-cadherin and Vimentin，as well as matrix marker proteins MMP-7 and MMP-9（Plt;0.05）. The expression level of miRNA-221 in the RSA group was significantly lower than that of the control group（Plt;0.05）. Compared with those transfected with miRNA negative control，transfection of miRNA-221 mimic significantly activated the phosphatidylinositol 3-kinase（PI3K）-AKT pathway，nuclear factor-kappa B（NF-κB）pathway，and p38 pathway（Plt;0.05），but downregulated mRNA level of PTEN（Plt;0.05）. Transfection of miRNA-221 inhibitor significantly upregulated mRNA level of PTEN（Plt;0.05）. Conclusion Endometrium-derived exosomal miRNA-221 negatively regulates the PTEN gene，activates the PI3K-AKT pathway，promotes EMT in endometrial epithelial cells，and influences the pregnant outcome of RSA mice.

【Key words】 Recurrent spontaneous abortion；Epithelial-mesenchymal transition；Exosomes；miRNA-221；PTEN gene；PI3K-AKT pathway

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（RSA）是指與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生2次及以上的自然流產(chǎn)，發(fā)病率為1%～5%［1］。RSA病因復(fù)雜多樣，不明原因RSA占50%～70%［2］。不論何種原因，胚胎植入過程是關(guān)鍵因素之一。胚胎植入是胚胎和子宮內(nèi)膜相互作用和識(shí)別的過程。優(yōu)質(zhì)的胚胎和良好的子宮內(nèi)膜容受性對(duì)于胚胎著床至關(guān)重要，胚胎和內(nèi)膜之間的協(xié)調(diào)是著床的關(guān)鍵。胚胎植入過程中子宮內(nèi)膜滋養(yǎng)層細(xì)胞會(huì)發(fā)生與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移類似的上皮轉(zhuǎn)化行為即上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），這一特有的分化過程若出現(xiàn)異常，將導(dǎo)致胚胎植入失敗、發(fā)育中止，甚至出現(xiàn)多次妊娠丟失，最終形成RSA［3-4］。

外泌體是由多種細(xì)胞分泌的直徑介于30～100 nm的均一膜囊泡。外泌體中含有可溶性蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、miRNA和LncRNA，參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和各種代謝。外泌體還可以作為癌癥、神經(jīng)退行性疾病和腎臟疾病的診斷標(biāo)志物，具有較高的臨床診斷價(jià)值［4-5］。外泌體能夠向受體細(xì)胞傳遞信息并影響受體細(xì)胞的功能［6］。外泌體miRNA的轉(zhuǎn)移對(duì)目標(biāo)基因具有重要的調(diào)節(jié)作用，并被用作受體細(xì)胞的臨床生物標(biāo)志物［7］。近期研究報(bào)道外泌體與生殖系統(tǒng)密切相關(guān)，并可以從輸卵管、卵泡液、子宮液、前列腺、附睪和精液中分離得到。外泌體通過攜帶的內(nèi)容參與細(xì)胞間的交流，對(duì)精子-卵子成熟、受精、著床和胚胎發(fā)育的各個(gè)方面產(chǎn)生重要影響［8］。然而，關(guān)于外泌體在生殖過程中的通路和機(jī)制尚不清楚。

人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞分泌外泌體，類似于內(nèi)膜受激素調(diào)節(jié)并隨月經(jīng)周期發(fā)生周期性變化［9］。在胚胎著床過程中，外泌體維持母體-胎兒界面的免疫微環(huán)境平衡，并促進(jìn)胚胎著床。有研究表明，子宮內(nèi)膜細(xì)胞EMT過程異常是胚胎著床失敗的原因之一［10-11］。課題組前期臨床研究發(fā)現(xiàn)RSA患者子宮內(nèi)膜細(xì)胞EMT過程出現(xiàn)異常，進(jìn)而導(dǎo)致胚胎著床失?。?1］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞能夠分泌外泌體，外泌體參與EMT過程。外泌體包含多種與EMT密切相關(guān)的miRNA，其中以miRNA-221為主。但是外泌體及miRNA-221在介導(dǎo)細(xì)胞EMT這一過程中的具體作用機(jī)制尚不明確，本研究旨在探尋外泌體來源miRNA-221調(diào)控小鼠子宮內(nèi)膜EMT過程干擾胚胎著床的作用機(jī)制，以期為RSA的臨床診斷和治療提供思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 研究時(shí)間：2021年10月—2022年5月。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康SPF級(jí)8周齡的雌性CBA/J小鼠24只、8周齡雄性DBA/2J小鼠6只、雄性BALB/c小鼠6只，購(gòu)自北京維通麗華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)〔（京）2021-0006〕。所有小鼠在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房飼養(yǎng)（SPF級(jí)），12 h光照，12 h黑暗，自由攝食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，雌性CBA/J小鼠與雄性BALB/c小鼠交配被用作正常對(duì)照組，雌性CBA/J小鼠與雄性DBA/2J小鼠交配建立RSA模型，每組各12只。造模結(jié)束后各組小鼠每晚18：00按雌雄2∶1合籠，每天早晨8：00觀察陰道栓及引導(dǎo)圖片觀察精蟲，發(fā)現(xiàn)陰道栓或精蟲者為妊娠第1日。本研究獲得首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（IRB00006761-2019062）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備：冷凍離心機(jī)（Fresco21）、酶標(biāo)儀（Varioskan LUX）、超微量分光光度計(jì)（NanoDrop 2000），均購(gòu)自Thermo（美國(guó)）；電泳槽（1655132）、電泳儀（1654102），均購(gòu)自Bio-RAD（美國(guó)）；水平脫色搖床（其林貝爾，型號(hào)：TS-2）；熒光定量PCR儀［ABI Step One Plus（美國(guó)），型號(hào)：4376592］；倒置熒光顯微鏡［Leica（德國(guó)），型號(hào)：DMi8］；120 kV透射電鏡［Hitachi（日本），型號(hào)：HT7800］；NovoCyte流式細(xì)胞儀［ACEA（美國(guó)），型號(hào)：2010046］；渦旋振蕩儀（其林貝爾，型號(hào)：QL-902）；Centrifuge［Eppendorf（德國(guó)），型號(hào)：5415D］。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)試劑：DMEM/F-12（11320033）、0.25%胰酶（25200-114）、Trizol reagent（15596026）均購(gòu)自Life Technologies（美國(guó)）；磷酸鹽緩沖液（PBS）（C10010500BT）、DPBS溶液（14190250）、胎牛血清（10099141）、膠原酶Ⅱ（17101015）、OPTI MEM（31985070）均購(gòu)自Gibco（美國(guó)）；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）（34-8342-82），購(gòu)自Thermo（美國(guó)）；蛋白酶抑制劑（11697498001），購(gòu)自Roche（瑞士）；CCK-8試劑盒（C0038），購(gòu)自碧云天生物；ExoRNeasy Serum/Plasma Kit（77044）、ExoRNeasy Midi and Maxi Kits（77064）購(gòu)自Qiagen（德國(guó)）；PKH67（MIDI67），購(gòu)自Sigma（美國(guó)）；Reverse Transcription System（A2790），購(gòu)自Promega（美國(guó)）；MiDETECTA Track miRNA qRT-PCR start kit（C10712-1）、miDETECT A Track Mus-miR Primer，購(gòu)自廣州銳博；無核酶水（P1193），購(gòu)自Promega（美國(guó)）；Anti-CD63 antibody（ab217345）、Anti-CD81 antibody（ab109201）、Anti-TSG101 antibody（ab125011）、Anti-GAPDH antibody（ab8245），購(gòu)自Abcam（英國(guó)）；Anti-Snail1 antibody（3879）、Anti-E-cadherin antibody（14472）、Anti-N-cadherin antibody（13116）、Anti-Vimentin antibody（5741），購(gòu)自CST（美國(guó)）；TGF-β1（MA1-21595），購(gòu)自Thermo Fisher Scientific（美國(guó)）；Goat anti-Mouse-HRP antibody（CW0102M）、Goat anti-Rabbit-HRP antibody（CW0103M），購(gòu)自北京康為；CD44 Monoclonal Antibody-FITC（11-0441-86）、CD24 Monoclonal Antibody-APC（17-0247-42），購(gòu)自eBioscience（美國(guó)）；NC膜，0.45 μm孔徑（HF13502XSS）、ECL（WBKLS0500），購(gòu)自Millipore（美國(guó)）；miR-221模擬物和miR-221抑制劑購(gòu)自Thermo Fischer Scientific（美國(guó)）（檢測(cè)ID：MC10337、MH10337）。甲醇（10014118）國(guó)藥；BSA（0332）、Acrylamide（0341）、Bis-Acrylamide（0172）、APS（0486）、Tween-20（0777），購(gòu)自Amresco（美國(guó)）；UltraPureTM TEMED（15524010）購(gòu)自Invitrogen（美國(guó)）；PowerUpTM SYBR? Green Master Mix（A25742）、SYBR Green（4309155），購(gòu)自ABI（美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞分離、培養(yǎng)：將妊娠第4天的雌性CBA/J小鼠在無菌條件下斷頭處死后取子宮，將子宮縱向剪為2～3 mm小塊，加0.25%胰酶，在4 ℃和室溫條件各消化1 h；加入含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F-12培養(yǎng)基中和胰酶。將組織以室溫

1 000 r/min離心5 min，離心半徑10 cm，收集細(xì)胞懸液。然后加入0.5%膠原酶Ⅱ溶液在37 ℃消化30 min。消化后的細(xì)胞懸液經(jīng)過200目和400目細(xì)胞篩進(jìn)行篩選，細(xì)胞用PBS洗滌2次。最后，將細(xì)胞以2×105/孔的密度接種于DMEM/F-12培養(yǎng)基中培養(yǎng)；并通過流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞特性。

1.2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：將初級(jí)培養(yǎng)的小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用0.25%胰蛋白酶消化，并分散到6孔板中培養(yǎng)16～18 h。根據(jù)5 μL/mL的比例向細(xì)胞上清液中添加純化的外泌體，未經(jīng)純化的細(xì)胞上清液用作對(duì)照，TGF-β1（10 ng/mL）用作陽性對(duì)照。在添加外泌體后的24、48、72 h和96 h收集細(xì)胞，進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：將小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞置于6孔板，細(xì)胞密度為1×106/孔。在細(xì)胞培養(yǎng)18～24 h細(xì)胞鋪滿板底后，用200 μL的槍頭垂直于孔板作細(xì)胞劃痕。吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗板3次。通過加入含有2% FBS的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，并在不同時(shí)間點(diǎn)拍照記錄細(xì)胞遷移情況，根據(jù)照片收集數(shù)據(jù)并進(jìn)行結(jié)果分析。

1.2.4 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：在培養(yǎng)皿中放置小室，上室預(yù)涂基質(zhì)膠，向上室加入300 μL無血清培養(yǎng)基。經(jīng)胰酶消化并用DPBS洗滌2次后，小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基重懸，并加入每個(gè)Transwell小室。然后，將Transwell小室插入含有10% FBS完全培養(yǎng)基的24孔板的下室中，常規(guī)孵育。48 h后收集上室，用0.1%結(jié)晶紫室溫下染色10 min后拍照計(jì)數(shù)。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)：通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定上皮特異性細(xì)胞表面標(biāo)記物CD24和CD44的表達(dá)。將細(xì)胞收集并用100 μL的DPBS懸浮。向細(xì)胞中加入CD44- FITC和CD24- APC抗體，室溫避光下染色15 min。將細(xì)胞以

1 000 r/min離心5 min，去除未結(jié)合的抗體，隨后用DPBS洗滌3次，用100 μL的DPBS重新懸浮樣本，并用流式檢測(cè)CD44和CD24的表達(dá)。

1.2.6 小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞來源外泌體分離與純化：收集培養(yǎng)的小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞上清液，300×g離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新管中，再以2 000×g離心10 min。然后，將上清液以10 000×g離心30 min。將上清液轉(zhuǎn)移到超速離心管中，并以100 000×g離心90 min。最后，用100 μL DPBS溶解沉淀物，獲得外泌體。

1.2.7 電鏡下的外泌體檢測(cè)：純化的外泌體室溫下用戊二醛固定10 min，然后用冷卻的PBS洗滌3次。然后，加入2%的硝酸鉛固定于4 ℃ 2 h。使用冷卻的PBS洗滌3次，然后用50%、70%、80%和90%梯度乙醇分別脫水20 min。樣品隨后用丙酮脫水2次，并用冷卻的PBS洗滌3次。最后，用醋酸鉛染色10 min，用透射電鏡觀察外泌體。

1.2.8 外泌體細(xì)胞染色追蹤：將經(jīng)消毒的玻璃片放入12孔板中，并加入小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)18 h。使用PHK 76染色試劑盒染色DPBS-外泌體，具體步驟如下：將1 mL稀釋液C和4 μL PKH67混合，并在室溫下靜置5 min，然后添加2 mL BSA終止染色，并使用外泌體血清/血漿提取試劑盒重新提取外泌體。將標(biāo)記的外泌體加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，室溫下孵育10 min，細(xì)胞培養(yǎng)上清液用作對(duì)照。將標(biāo)記的外泌體和細(xì)胞上清液對(duì)照加入小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中孵育30 min。細(xì)胞用冷卻的DPBS洗滌3次，然后用DAPI進(jìn)行核染色，并用指甲油封口，用熒光顯微鏡拍攝。

1.2.9 熒光定量PCR：收集小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液，并進(jìn)行外泌體純化。使用外泌體RNA分離及純化劑提取純化的外泌體RNA。逆轉(zhuǎn)錄提取的RNA，并使用熒光定量PCR測(cè)量外泌體RNA中不同miRNA的表達(dá)（miRNA引物由廣州銳博合成）。使用Trizol方法提取總細(xì)胞RNA，并按說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，利用SYBR Green法進(jìn)行熒光定量PCR測(cè)量基因表達(dá)。

1.2.10 miRNA轉(zhuǎn)染RSA小鼠子宮上皮細(xì)胞：將小鼠子宮上皮細(xì)胞用少量的OPTI MEM培養(yǎng)基洗滌，然后向每個(gè)6 cm培養(yǎng)皿中加入1 mL的OPTI MEM培養(yǎng)基。接著，將5 μL的miRNA-221和對(duì)照的隨機(jī)miRNA分別加入到250 μL的OPTI MEM培養(yǎng)基中，并將6 μL/樣品的Lipofecta mine RNAi MAX加入到另一個(gè)250 μL/樣品的OPTI MEM培養(yǎng)基管中。將試管放置在室溫下靜置5 min，然后再在室溫下混合30 min。將混合物加入指示的細(xì)胞培養(yǎng)皿中孵育6 h。更換為完全培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2孵化箱中孵育。轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞，進(jìn)行熒光定量和免疫印跡法（Western blotting，WB）實(shí)驗(yàn)。

1.2.11 WB檢測(cè)miRNA-221轉(zhuǎn)染后RSA細(xì)胞EMT標(biāo)志蛋白及相關(guān)通路蛋白：使用100 μL和1 mL RIPA緩沖液裂解外泌體和細(xì)胞樣品，冰上放置15 min后以

12 000 r/min離心15 min。離心后，上清液用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。將蛋白質(zhì)濃度調(diào)整至接近的濃度，加入5×還原樣品緩沖液，最終樣品濃度為1 mg/mL，在裝載前煮沸10 min進(jìn)行變性。然后，加載樣品到12%凝膠中進(jìn)行電泳。蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并在室溫下用5% BSA-TBST在室溫脫色搖床上緩慢搖晃40 min進(jìn)行封閉。經(jīng)過3次TBST洗滌后，膜在4 ℃過夜與不同的一抗抗體孵育。此外，在用TBST洗滌后，膜在室溫下與指示的HRP標(biāo)記的二抗孵育1 h。按說明使用ECL使蛋白質(zhì)顯影、定影。

1.2.12 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)：將293T細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化后，以大約2×105的細(xì)胞密度均勻分散于6孔板中，孵育18 h。然后，細(xì)胞與miRNA-221 mimic、miRNA-221 inhibitor或?qū)φ针S機(jī)miRNA以及pGL3-Pten 3' UTR-WT或pGL3-Pten 3' UTR-Mut共同轉(zhuǎn)染48 h。然后，將細(xì)胞收集并懸浮于96孔板中。使用Du-al-Glo Luciferase Assay System按照說明書進(jìn)行熒光檢測(cè)。向每孔加入70 μL的螢火蟲熒光素酶底物，室溫下避光反應(yīng)20 min，以獲取熒光素?zé)晒庵?。然后，在加入底物后，收集?nèi)參的熒光值。計(jì)算樣本螢火蟲熒光值與內(nèi)參熒光值的比值，作為每個(gè)樣品的最終值，然后比較不同樣品間熒光值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 27.0及GraphPad Prism 9.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以（x-±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RSA小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞顯示異常的EMT

CCK-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，RSA組第2～4天細(xì)胞增殖能力降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見表1。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，RSA組細(xì)胞的遷移能力低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見表1、圖1A。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，RSA組細(xì)胞的侵襲能力低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見圖1B。流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，RSA組EMT標(biāo)志蛋白陽性率（CD44+/CD24+）低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見表1、圖1C。WB檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，RSA組細(xì)胞的EMT標(biāo)志性蛋白：E-cadherin表達(dá)水平增加，N-cadherin、Vimentin表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見表1、圖1D；RSA組細(xì)胞黏附蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-7、MMP-9表達(dá)水平低于正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。

2.2 小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞能夠分泌外泌體

收集原代培養(yǎng)的小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞上清液進(jìn)行外泌體分離，并通過透射電鏡觀察外泌體（圖2A）。WB檢測(cè)到外泌體標(biāo)記蛋白CD63、CD81和TSG101表達(dá)（圖2B）。外泌體經(jīng)PKH87熒光標(biāo)記后，加入培養(yǎng)基中可觀察到明亮的綠色熒光（圖2C）。

2.3 子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞外泌體可誘導(dǎo)EMT

將外泌體添加到RSA原代培養(yǎng)的小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中，并使用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖。結(jié)果顯示，添加外泌體的RSA組細(xì)胞增殖率高于細(xì)胞上清液RSA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見表2。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，添加外泌體的RSA組細(xì)胞遷移能力高于細(xì)胞上清液RSA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見圖3A、表2。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，添加外泌體的RSA組細(xì)胞侵襲能力高于細(xì)胞上清液RSA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見圖3B、表2。使用CD24和CD44抗體標(biāo)記細(xì)胞，通過流式檢測(cè)到EMT表面標(biāo)志物的表達(dá)（圖3C），結(jié)果顯示，添加外泌體的RSA組CD44+/CD24+表達(dá)水平高于細(xì)胞上清液RSA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見表2。通過WB檢測(cè)其他EMT標(biāo)志蛋白，結(jié)果顯示，與細(xì)胞上清液RSA組相比，添加外泌體的RSA組細(xì)胞的EMT標(biāo)志蛋白E-cadherin水平降低，間質(zhì)樣標(biāo)志蛋白N-cadherin和Vimentin以及基質(zhì)標(biāo)志蛋白MMP-7、MMP-9蛋白水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見圖3D、表2。

2.4 來自小鼠子宮內(nèi)上皮細(xì)胞的外泌體含有各種miRNA

對(duì)正常對(duì)照組和RSA組收集到的子宮內(nèi)上皮細(xì)胞上清液進(jìn)行外泌體分離、純化和膜蛋白特異性鑒定。結(jié)果顯示，兩組樣品的外泌體中均檢測(cè)到CD63和CD81蛋白的表達(dá)，未檢測(cè)到內(nèi)參蛋白GAPDH的表達(dá)，見圖4。然后，將純化的外泌體進(jìn)行RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR檢測(cè)miRNA。結(jié)果顯示，兩組外泌體中均可檢測(cè)到多種miRNA，RSA組miRNA-221、miRNA-720、miRNA-34a表達(dá)水平均低于正常對(duì)照組，miRNA-133a、miRNA-158-5P、miRNA-365、miRNA-215表達(dá)水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見表3。

2.5 子宮內(nèi)上皮細(xì)胞外泌體miRNA-221誘導(dǎo)EMT

為進(jìn)一步研究miRNA-221在小鼠子宮內(nèi)上皮細(xì)胞EMT過程中的功能，合成miRNA-221模擬物（miR-221 mimic）、miRNA-221抑制劑（miR-221 inhibi）和對(duì)照隨機(jī)miRNA（Scrambled miR）。將miRNA轉(zhuǎn)染至RSA小鼠子宮內(nèi)上皮細(xì)胞后檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞EMT的影響。利用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，結(jié)果表明，與對(duì)照隨機(jī)miRNA轉(zhuǎn)染相比，miRNA-221模擬物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，而miRNA-221抑制劑轉(zhuǎn)染的細(xì)胞增殖能力減弱，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見表4。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照隨機(jī)miRNA相比，miRNA-221模擬物能夠促進(jìn)小鼠子宮內(nèi)上皮細(xì)胞的遷移和入侵能力，而miRNA-221抑制劑則能夠抑制細(xì)胞遷移和侵襲能力，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見圖5A、5B和表4。為進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA-221對(duì)細(xì)胞EMT表型的影響，將轉(zhuǎn)染miRNA的細(xì)胞收集并用CD24和CD44抗體標(biāo)記，通過流式檢測(cè)細(xì)胞表面兩種蛋白的變化，結(jié)果顯示，與隨機(jī)miRNA相比，miRNA-221轉(zhuǎn)染增加CD24和CD44的表達(dá)，而miRNA-221抑制劑則降低了CD24和CD44的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見圖5C、表4。

2.6 miRNA-221通過靶向Pten基因負(fù)調(diào)控PI3K-AKT通路誘導(dǎo)細(xì)胞EMT

為進(jìn)一步研究miRNA-221在小鼠子宮內(nèi)上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)EMT的信號(hào)通路，將miRNA-221模擬物、miRNA-221抑制劑和對(duì)照隨機(jī)miRNA轉(zhuǎn)染至RSA組收集的子宮內(nèi)上皮細(xì)胞。與對(duì)照隨機(jī)miRNA相比，miRNA-221模擬物降低了RSA組中E-cadherin的水平，上調(diào)了N-cadherin、Vimentin的水平，同時(shí)MMP- 7和MMP-9蛋白水平也增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；miRNA-221抑制劑產(chǎn)生了相反的調(diào)控作用，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見圖6A、表5。

本研究還檢測(cè)了不同信號(hào)通路的活化情況，與對(duì)照隨機(jī)miRNA相比，miRNA-221模擬物激活了PI3K-AKT通路、NF-κB通路和p38通路（Plt;0.05）；而三組IL-6通路和EGFR通路比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05），見圖6A、6B和表5。

本研究選擇了PI3K-AKT通路進(jìn)行下一步的研究。為進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA-221模擬物對(duì)PI3K-AKT通路的激活，使用通路特異性抑制劑對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，并顯示PF-04691502能夠抑制miRNA-221模擬物對(duì)EMT蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，細(xì)胞侵襲結(jié)果也證明PF-04691502能夠抑制miRNA-221模擬物介導(dǎo)的細(xì)胞侵襲，見圖6C、6D和表6、7。

為研究miRNA-221如何影響PI3K-AKT通路，通過Target Scan網(wǎng)站（https：//www.targetscan.org/）預(yù)測(cè)miRNA-221的靶基因，并確定PTEN作為一個(gè)重要的PI3K-AKT通路負(fù)調(diào)控因子，是miRNA-221的預(yù)測(cè)靶基因。在轉(zhuǎn)染miRNA-221模擬物、miRNA-221抑制劑和隨機(jī)miRNA后，通過熒光定量PCR檢測(cè)PTEN的表達(dá)，結(jié)果顯示miRNA-221模擬物降低了PTEN mRNA的表達(dá)水平，而miRNA-221抑制劑轉(zhuǎn)染則增加了其表達(dá)水平（表5）。預(yù)測(cè)miRNA-221與3'UTR區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn)（圖6E），利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，miRNA-221模擬物降低了Pten-WT-Luc熒光素強(qiáng)度，對(duì)突變基因型沒有顯著影響，見表8。

3 討論

在胚胎植入過程中，受激素和細(xì)胞因子的影響，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞顯示出一系列分子變化，如EMT，進(jìn)一步為妊娠的啟動(dòng)創(chuàng)造了有利的環(huán)境。然而，增加的外泌體的分子生物學(xué)功能以及與RSA的關(guān)系尚待確定。本研究發(fā)現(xiàn)與正常妊娠的小鼠相比，RSA小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞EMT過程減弱。此外，含有miRNA-221的外泌體通過負(fù)調(diào)控Pten基因激活PI3K-AKT通路，進(jìn)一步促進(jìn)RSA組子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞EMT的發(fā)生。

EMT的特征包括細(xì)胞間黏附的喪失，頂基底極性的下調(diào)，細(xì)胞骨架的重組以及MMPs的表達(dá)［12-13］。EMT已經(jīng)被廣泛證明是腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，并與患者預(yù)后不良呈正相關(guān)［14-15］。然而，這些特征在侵襲性癌細(xì)胞和胚胎植入過程中的侵襲性胚胎細(xì)胞行為之間是相似的。已經(jīng)有研究表明，在胚胎植入過程中，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞經(jīng)歷EMT過程，使其具有間充質(zhì)特征，并由于細(xì)胞極性的喪失，在植入窗口期更容易接受胚胎［16］。植入窗口期內(nèi)EMT過程的激活失敗可能是胚胎植入失敗和流產(chǎn)的原因之一。EMT的特征是E-cadherin的表達(dá)低下，細(xì)胞骨架重構(gòu)為紡錘狀形態(tài)，而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin和vimentin的表達(dá)升高［17］。因此，E-cadherin的缺失被認(rèn)為是EMT過程的標(biāo)志性事件。體內(nèi)研究顯示，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的EMT在胚胎植入的第5天發(fā)生，且僅在有已植入胚胎的情況下發(fā)生［18］。

多項(xiàng)研究表明，外泌體在胚胎植入過程中起著重要作用。在囊胚著床前階段，可以在子宮液中檢測(cè)到高水平的外泌體，這些外泌體參與細(xì)胞黏附和凋亡［19］。來源于滋養(yǎng)層細(xì)胞的外泌體衍生的miRNAs也在人類囊胚的培養(yǎng)液和活檢的滋養(yǎng)層細(xì)胞中被鑒定。這些miRNAs的靶基因被預(yù)測(cè)參與細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖［7］。此外，據(jù)預(yù)測(cè)，內(nèi)膜外泌體衍生的miRNAs可能通過多個(gè)信號(hào)通路靶向參與內(nèi)膜容受性和胚胎植入的基因，包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、腫瘤壞死因子α、JAK-STAT通路等，這些通路是蛻膜化和植入的調(diào)節(jié)因子［20］。胚胎外泌體是否富含這些miRNAs目前還不十分清楚。研究表明，來自子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的含miRNA的外泌體可能被囊胚的滋養(yǎng)層細(xì)胞或子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞內(nèi)吸，從而介導(dǎo)子宮內(nèi)膜與胚胎的相互作用，并影響胚胎植入［21］。LI等［22］發(fā)現(xiàn)，內(nèi)膜上皮可以通過外泌體的幫助調(diào)節(jié)胚胎基因表達(dá)。研究人員還對(duì)來自16名女性不同內(nèi)膜狀態(tài)（增生和分泌期）的內(nèi)膜分泌物中的外泌體miRNA進(jìn)行了測(cè)序，發(fā)現(xiàn)miRNA-30d在分泌期，特別是著床期，與其他時(shí)期相比顯著增高。多項(xiàng)研究表明，孕婦的子宮內(nèi)膜可以通過相關(guān)的外泌體miRNAs調(diào)節(jié)與囊胚前期胚胎相關(guān)的基因表達(dá)，從而促進(jìn)胚胎著床。由于外泌體富含miRNAs，可以推測(cè)胚胎外泌體會(huì)選擇性地調(diào)控內(nèi)膜上皮的轉(zhuǎn)錄組，并指引著床。多種miRNAs，如miRNA-429、miRNA-30a-3P和miRNA-126a-3P，已被證明可以調(diào)節(jié)內(nèi)膜上皮細(xì)胞的EMT過程，從而影響胚胎受精［23］。在一項(xiàng)miRNA譜的研究中，ECC1細(xì)胞包含219個(gè)miRNA基因的轉(zhuǎn)錄本，而所示的外泌體包含227個(gè)轉(zhuǎn)錄本，并且外泌體含有13個(gè)在細(xì)胞中未檢測(cè)到的獨(dú)特的miRNA轉(zhuǎn)錄本［24］。源自內(nèi)膜的外泌體miRNAs通過調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層中EMT的功能促進(jìn)胚胎著床。進(jìn)一步研究表明，miRNA-1290在外泌體中富集，并通過靶向LHX6促進(jìn)IL-6和IL-8的表達(dá)，進(jìn)一步影響子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的遷移；滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR8/SVneo產(chǎn)生的外泌體miRNA-1290也可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞HEC-1-A的EMT過程［25］。在這項(xiàng)研究中，從小鼠內(nèi)膜上皮細(xì)胞分泌的外泌體能夠誘導(dǎo)EMT。通過熒光定量PCR檢測(cè)正常對(duì)照組和RSA組的外泌體，發(fā)現(xiàn)多個(gè)miRNA的水平在兩組樣本中有顯著差異，如miRNA-221、miRNA-133a、miRNA-158-5P、miRNA-23a、miRNA-720、miRNA-27b、miRNA-365、miRNA-215、miRNA-34a，本研究最終選擇了與細(xì)胞EMT相關(guān)的miRNA-221進(jìn)行進(jìn)一步研究，本研究結(jié)果顯示，來自小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的外泌體miRNA-221誘導(dǎo)了小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的EMT，促進(jìn)了細(xì)胞的遷移和侵襲能力。相反，抑制miRNA-221會(huì)抑制EMT、細(xì)胞遷移和侵襲能力，表明miRNA-221是影響內(nèi)膜EMT過程的重要因素。

來自間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體通過激活胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）和p38 MAPK通路來促進(jìn)血管生成［26］。類似地，黑色素瘤源自的外泌體將受體酪氨酸激酶MET轉(zhuǎn)移給骨髓干細(xì)胞，使其能夠支持腫瘤血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移［27］。如何針對(duì)或利用這樣的外泌體在胚胎植入和RSA中仍然未知，需要進(jìn)一步研究。在預(yù)測(cè)的靶基因中，本研究著重研究了腫瘤抑制基因PTEN，其通過去磷酸化PIP3抑制PI3K活性，從而負(fù)向調(diào)節(jié)AKT通路的活性。PI3K-AKT通路被廣泛證明在癌細(xì)胞中介導(dǎo)EMT，可能通過直接作用于與EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子來實(shí)現(xiàn)。作為一個(gè)堿基螺旋環(huán)轉(zhuǎn)錄因子，Twist可以強(qiáng)烈誘導(dǎo)EMT，而活化的Akt會(huì)上調(diào)Twist1的磷酸化表達(dá)［26］。Slug和Snail均屬于相同的轉(zhuǎn)錄因子家族，具有鋅指結(jié)構(gòu)。Slug和Snail可以通過結(jié)合E-cadherin啟動(dòng)子的E-box上游來誘導(dǎo)EMT，并抑制E-cadherin基因的表達(dá)［28］。PI3K-AKT的活化可以通過促進(jìn)糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）的泛素化而降低Snail的降解。WEI等［29］發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt的活化導(dǎo)致GSK-33β的降解，并導(dǎo)致Slug的表達(dá)，最終導(dǎo)致EMT的誘導(dǎo)。本研究的WB結(jié)果顯示，miRNA-221模擬物可以增加P-p38、P-Akt的表達(dá)水平，表明PI3K-AKT被活化。雙熒光酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明，PTEN作為PI3K-AKT抑制基因是miRNA-221的靶基因。

綜上，來源于內(nèi)膜上皮細(xì)胞的外泌體攜帶的miRNA-221通過負(fù)向調(diào)節(jié)Pten基因激活了PI3K-AKT通路，從而促進(jìn)了EMT的發(fā)生，這個(gè)過程可以影響妊娠結(jié)局，這一發(fā)現(xiàn)為RSA的機(jī)制和改善妊娠結(jié)局提供了新的思路。

作者貢獻(xiàn)：李夢(mèng)元負(fù)責(zé)提出研究思路，設(shè)計(jì)研究方案及論文起草；李冠杉負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)；韓倩、李思瑤及鄭舒暢負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)的收集與整理；辛明蔚、王景尚、武穎負(fù)責(zé)繪圖與展示；尹曉丹進(jìn)行論文修訂；何軍琴負(fù)責(zé)最終版本修訂，對(duì)論文負(fù)責(zé)。

本文無利益沖突。

李夢(mèng)元https：//orcid.org/0000-0003-0089-8423

何軍琴https：//orcid.org/0000-0002-3223-7710

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（收稿日期：2023-10-10；修回日期：2024-03-30）

（本文編輯：賈萌萌）