摘 要：CER1基因在植物表皮蠟質的生長發(fā)育過程中發(fā)揮了重要的調控作用。為研究冬瓜CER1基因的生物學功能，利用同源序列克隆法克隆得到全長為1866 bp的BhCER1基因。該基因編碼621個氨基酸，等電點為8.29，其蛋白質包含55個潛在磷酸化位點。蛋白質結構分析顯示，該蛋白主要由無規(guī)則卷曲和α-螺旋構成。啟動子序列分析表明，BhCER1啟動子中包括與干旱、低溫、鹽脅迫等多種逆境響應相關的調控元件。進化分析表明，冬瓜BhCER1與同為葫蘆科的甜瓜（CmCER1）和黃瓜（CsCER1）親緣關系較近。qRT-PCR結果顯示，BhCER1基因在冬瓜果皮中的表達量最高，其次是果肉、雌花、雄花、葉片、莖，而在根部基本無表達。綜上所述，BhCER1基因可能在冬瓜果實蠟質合成過程中發(fā)揮重要作用，其具體的生物學功能尚待開展深入的系統(tǒng)研究。

關鍵詞：冬瓜；果面蠟質；BhCER1；表達分析

中圖分類號：S642.3 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2025）02-032-08

Cloning and expression analysis of BhCER1 gene involved in wax synthesis in wax gourd

MO Renlian1， 2， HONG Jiesheng2， 3， YAN Jinqiang2， WANG Baochen2， CHENG Xiaoxin2， WU Tao1， JIANG Biao2

（1. College of Horticulture， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， Hunan， China; 2. Vegetable Research Institute， Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Key Laboratory for New Technology Research of Vegetable， Guangzhou 510640， Guangdong， China; 3. South China Normal University， Guangzhou 510631， Guangdong， China）

Abstract： The CER1 gene plays an important role in the development of plant cuticular wax. In order to investigate the biological function of CER1 gene in wax gourd， the full-length of BhCER1 gene with a total length of 1866 bp was cloned using a homologous sequence cloning method. This gene encoded a protein of 621 amino acids with an isoelectric point of 8.29， and contained 55 potential phosphorylation sites. Protein structure analysis indicated the BhCER1 protein primarily consists of random coil and α-helix. Promoter sequence analysis showed that the promoter of BhCER1 contained regulatory elements associated responses to various abiotic stresses ， such as drought， low temperature， and salt stress. Phylogenetic analysis showed that BhCER1 in wax gourd was closely related to CmCER1 in melon and CsCER1 in cucumber， both belonged to the Cucurbitaceae family. The results of qRT-PCR demonstrated that BhCER1 was most highly expressed in the fruit peel， followed by the fruit flesh， female flower， male flower， leaf， and stem， with negligible expression in the root. The above studies suggest that BhCER1 may play an important role in the fruit wax synthesis process of wax gourd. However， further systematic research is need to elucidate its specific biological functions.

Key words： Benincasa hispida; Epidermis wax; BhCER1; Expression analysis

蠟質是植物表皮細胞外的一層疏水屏障，與環(huán)境直接接觸，起到保護器官的作用[1]。在擬南芥中，已經(jīng)鑒定出多種與蠟質合成相關的關鍵基因，包括CER1、WAX2和WIN1/SHN1，以及KCS基因家族的KCS1、KCS2、KCS6和KCS20等[2-8]。在這些基因中，KCS1、KCS6和KCS20是與FAE（脂肪酸延長酶復合體）相關的限速酶基因。FAE是一種多酶復合物，負責催化超長鏈脂肪酸（VLCFAs）的合成。1995年，Aarts等[9]發(fā)現(xiàn)了一個與烷烴生物合成和脫羰反應相關酶的基因CER1，該基因在擬南芥中與莖表皮蠟質的生物合成、花粉育性和植物對生物與非生物脅迫的響應密切相關。研究表明，CER1功能缺失突變體植株表現(xiàn)為莖表面光亮，蠟質中烷烴、仲醇和酮含量顯著下降，而醛含量則上升；CER1過表達則顯著增加了烷烴的積累[10]。

在其他作物中，也開展了CER1基因的相關功能研究。Wu等[11]通過同源克隆獲得了番茄SlCER1-1基因，發(fā)現(xiàn)沉默該基因會減少正構烷烴和支鏈烷烴的含量，并增強葉片和果實角質層的滲透性。Wang等[12]從甘藍型油菜中分離了擬南芥CER1的同源基因BnCER1-2，其過表達導致葉片表皮蠟質顯著增加。奧娜等[13]通過比較野生型和突變體大蔥的AfCER1表達量發(fā)現(xiàn)，突變體葉片中AfCER1的表達水平較高，推測其調節(jié)作用與擬南芥CER1過表達時相似。在葫蘆科作物中，王文嬌[14]通過同源克隆獲得了黃瓜的蠟質合成基因CsCER1和CsWAX2，研究發(fā)現(xiàn)，其過表達影響了超長鏈烷烴的生物合成，使過表達植株的莖蔓表面光亮，且植株的整體抗旱能力顯著提升。以上蠟質相關基因的克隆與功能研究為深入探索基因的生物學作用提供了重要參考。

冬瓜是葫蘆科重要的蔬菜作物，其果皮表面存在較厚的蠟質層，在果實抵御病蟲害、耐烈日灼曬等方面發(fā)揮著重要作用，同時對冬瓜的品質和貯藏也意義重大。盡管植物表皮蠟質的功能及其代謝的分子機制在模式植物擬南芥中已有較為深入的研究，但冬瓜果實表面蠟質的形成原因及其調控機制尚未見相關報道。通過同源克隆，獲得擬南芥蠟質合成相關基因CER1在冬瓜中的同源基因BhCER1，并對其進行了生物信息學分析。同時，研究了該基因在成熟果實不同組織部位的表達模式，初步探討了BhCER1與冬瓜表皮蠟質形成的關系。研究結果為進一步解析冬瓜果皮蠟質的合成及調控機制提供了重要基礎，同時也為深入探究BhCER1基因的生物學功能奠定了理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2024年6－10月在廣東省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所白云基地進行。試驗田地勢平坦，土壤肥力均勻。供試植物材料為冬瓜高代自交系B227，由廣東省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所提供。供試材料于7月底在72孔穴盤中育苗，8月中旬定植到廣東省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所白云試驗基地，定植后及時澆水，幼苗在自然光照條件下生長，并采用常規(guī)田間管理。采集B227的根、莖、葉、雌花（開花當天）、雄花（開花當天）、成熟果實的不同組織（果肉、果皮），每個樣品取3個生物學重復，液氮速凍后轉移到-80 ℃的冰箱中存放，供試驗使用。

1.2 方法

1.2.1 BhCER1的克隆和測序 在擬南芥數(shù)據(jù)庫（https：//www.arabidopsis.org/）中檢索獲得擬南芥CER1蛋白（AT1G02205）的氨基酸序列，并以其為模板，在冬瓜B227基因組數(shù)據(jù)庫（http：//cucurbitgenomics.org/v2/organism/3）中進行BLAST序列比對，獲取冬瓜同源蛋白BhCER1（Bhi01G000103）。以2葉1心期冬瓜B227幼嫩葉片為材料，利用TransZol Up Plus RNA Kit試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）提取總RNA。隨后利用TransScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）進行反轉錄，合成單鏈cDNA。通過SnapGene軟件設計針對BhCER1基因編碼區(qū)序列（Coding Sequence，CDS）的特異性引物（表1），并以反轉錄所得的冬瓜cDNA為模板，利用PrimeSTAR?MaxDNA聚合酶（Takara公司）進行PCR擴增，PCR反應體系如下：反轉錄cDNA約50 ng，PrimeSTAR Max Premix（2×）DNA聚合酶12.5 μL，正反向引物各0.5 μL（引物濃度均為10 μmol·L-1），加無菌水至總體積50 μL。PCR反應在Bio-RadS1000（聯(lián)波生物公司）熱循環(huán)儀中進行，反應條件為：98 ℃預變性3 min，98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，回收并純化（使用DNA凝膠回收試劑盒，生工），送至擎科生物工程（廣州）股份有限公司進行測序。

1.2.2 BhCER1的蛋白特性分析 利用ExPASy在線工具（https：//web.expasy.org/protparam/）對BhCER1蛋白的等電點（PI）、分子質量和親水性進行分析。分別使用SOPMA（https：//npsa.lyon.inserm.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）和SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）預測蛋白的二級結構和三級結構。使用TMHMM2.0工具（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）對BhCER1蛋白的跨膜結構進行預測，利用NetPhos3.1Serve（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/）預測蛋白質的磷酸化位點。

1.2.3 BhCER1的基因結構及保守基序分析 利用在線軟件GSDS2.0（https：//gsds.gao-lab.org/Gsds_help.php）繪制BhCER1基因的結構圖，以展示其外顯子和內含子的分布特征。利用MEME Suite（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）對冬瓜BhCER1蛋白進行保守序列基序分析，識別其功能相關的特征基序。

1.2.4 BhCER1同源蛋白多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹構建 利用NCBI網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的BLAST工具，搜索與BhCER1蛋白同源性較高的植物蛋白序列。隨后，使用MEGA11軟件進行多序列比對，采用鄰接法（Neighbor-Joining method）構建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值設為1000次重復，其他參數(shù)保持默認設置。

1.2.5 BhCER1基因啟動子區(qū)順式作用元件分析 利用TBtools軟件提取冬瓜基因組中BhCER1基因上游2000 bp的序列，作為其啟動子區(qū)域序列。隨后，將提取的啟動子序列提交至Plant CARE在線工具（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/），對啟動子區(qū)域的轉錄調控元件進行分析。

1.2.6 BhCER1的表達模式分析 以B227的根、莖、葉、雌花、雄花、果肉和果皮組織為材料，按照1.2節(jié)的方法提取RNA并反轉錄為cDNA。分別以6種組織的cDNA為模板，以UBQ基因做內參對照，通過qRT-PCR（熒光定量PCR儀型號CFX96，美國Bio-Rad公司）測定冬瓜各組織中BhCER1基因的mRNA表達水平?；诙螧hCER1基因（登錄號：XP_038881235）和UBQ基因[15]（登錄號：XM_039044470）序列，利用NCBI網(wǎng)站設計熒光定量PCR引物（表1），引物合成由生工生物工程（廣州）股份有限公司完成。qPCR擴增體系（單個孔總體系為10.0 μL）：模板2 μL，上下游引物各0.2 μL（引物濃度為10 mol·L-1），SYBR Green Master mix 5 μL，ddH2O 2.6 μL。擴增程序：95 ℃，120 s、95 ℃，20 s、58 ℃，20 s、70 ℃，20 s，40個循環(huán)。每個組織包括3個生物學重復，每個樣本設置3次重復，以2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理與作圖 采用Microsoft Excel 2021和Origin2018進行數(shù)據(jù)處理和作圖，并使用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 BhCER1基因克隆

以擬南芥AtCER1蛋白序列為模板，通過BLAST比對從冬瓜基因組中獲得4個相似度較高的同源蛋白，分別是Bhi12G002237、Bhi01G000101、Bhi01G000102和Bhi01G000103。其中，Bhi01G000103與AtCER1相似性最高（59.52%），初步推斷其為擬南芥AtCER1的同源蛋白，并將編碼該蛋白的基因命名為BhCER1。以冬瓜高代自交系B227的葉片為試驗材料進行RT-PCR擴增，獲得BhCER1目標片段（圖1）。對擴增產(chǎn)物進行測序確認，獲得冬瓜BhCER1的cDNA編碼區(qū)序列。BhCER1基因CDS全長1866 bp，編碼621個氨基酸。

2.2 冬瓜BhCER1基因的生物信息學分析

2.2.1 BhCER1蛋白特性分析 通過ExPASy在線分析工具預測，BhCER1的等電點（PI）為8.29，蛋白質分子質量為71.94 kD，為堿性蛋白質，平均親水性為-0.015。疏水性分析顯示，BhCER1蛋白中第93位谷氨酰胺殘基的親水性最強（分值-3.322），而第189位丙氨酸殘基的疏水性最強（分值2.856），（圖2-A）。通過TMHMM2.0軟件預測，發(fā)現(xiàn)BhCER1蛋白為跨膜蛋白，包含4個跨膜區(qū)（圖2-B）。磷酸化位點分析結果表明，BhCER1蛋白具有55個磷酸化位點，其中包括29個絲氨酸位點、19個蘇氨酸位點和7個酪氨酸位點（圖3-A）。使用SWISS-MODEL構建蛋白的三級結構，模型顯示BhCER1蛋白主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構成（圖3-B）。此外，通過SOPMA軟件分析BhCER1蛋白的二級結構，結果顯示該蛋白二級結構由α-螺旋（44.61%）、折疊延伸鏈（8.37%）和無規(guī)則卷曲（47.02%）組成（圖3-C）。

2.2.2 BhCER1的基因結構及保守基序分析 在NCBI數(shù)據(jù)庫中通過同源比對獲得與BhCER1蛋白相似性較高的11個物種的CER1蛋白序列，分別是擬南芥（Arabidopsis thaliana，NC003070.9）AtCER1、甜瓜（Cucumis melo，XP008438263）CmCER1、黃瓜（Cucumis sativus，XP011650829）CsCER1、梨（Pyrus ×bretschneideri，XP048434502）PbCER1、梅（Prunus mume，XP008232262.1）PmCER1、番茄（Solanum lycopersicum，XP004234847.1）SlCER1、水稻（Oryza sativa，AAD29719.1）OsCER1、大麥（Hordeum vulgare，ABF51011.1）HvCER1、小麥（Triticum aestivum，ACA14353.1）TaCER1、香蕉（Musa acuminata，XP009384064.1）MaCER1和油棕（Elaeis guineensis，XP_010920377.1）EgCER1（圖4-A）。利用在線程序MEME分析BhCER1與其他物種CER1的蛋白基序（motif），發(fā)現(xiàn)BhCER1蛋白與其他11個物種的CER1蛋白均由10個motif組成。基因結構分析可知BhCER1基因包含9個外顯子、8個內含子，其結構與CsCER1、CmCER1較為相似（圖4-B）。

2.2.3 BhCER1的系統(tǒng)發(fā)育樹分析 基于包括冬瓜在內的12種CER1蛋白序列，利用MEGA11軟件采用鄰接法構建CER1蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹。結果顯示這些CER1蛋白可分為2個分支：擬南芥（Arabidopsis thaliana）、甜瓜（Cucumis melo）、黃瓜（Cucumis sativus）、梨（Pyrus × bretschneideri ）、梅（Prunus mume ）和番茄（Solanum lycopersicum）等雙子葉植物聚為一支，水稻（Oryza sativa）、大麥（Hordeum vulgare）、小麥（Triticum aestivum）、香蕉（Musa acuminata）和油棕（Elaeis guineensis）等單子葉植物聚為一支（圖5）。進化分析結果表明，冬瓜BhCER1與同為葫蘆科的甜瓜和黃瓜的CER1蛋白親緣關系較近。

2.2.4 BhCER1的順式作用元件分析 使用TBtools軟件提取冬瓜基因組中BhCER1基因上游2000 bp的啟動子序列，并提交至PlantCARE在線工具進行順式作用元件預測。結果顯示，BhCER1啟動子序列中包含15種不同類型的啟動子元件（表2），包括響應激素信號的元件（如ABRE，響應脫落酸；P-box，響應赤霉素；TCA-element，響應水楊酸），以及響應逆境脅迫的元件（如ARE，響應厭氧脅迫）。根據(jù)啟動子預測結果，推測冬瓜BhCER1基因可能在激素信號調控及逆境脅迫響應中發(fā)揮重要作用。

2.3 BhCER1的表達模式分析

為了進一步探索BhCER1基因的功能，通過qRT-PCR分析了BhCER1基因在冬瓜不同組織部位的表達模式。結果顯示，BhCER1基因在成熟果皮中的表達量最高，極顯著高于其他組織，其次為果肉、雌花、雄花、葉片、莖，而在根中幾乎不表達（圖6），表明該基因具有明顯的組織表達特異性。

3 討論與結論

植物表皮覆蓋一層具有疏水性保護功能的蠟質層[16]，表皮蠟質不僅可以幫助植物抵御紫外線輻射[17]、干旱脅迫[18]，還能夠有效抵御病蟲害[19]，在植物的生長發(fā)育和環(huán)境適應中發(fā)揮了重要作用[20]。在模式作物擬南芥中，蠟質合成及其調控基因的研究較為深入，已鑒定出包括CER1在內的多個關鍵基因，為其他作物中蠟質相關基因的克隆和功能鑒定提供了重要參考價值[21]。在玉米和黃瓜等植物中，CER1基因被證實能夠影響超長鏈烷烴等蠟質主要成分的合成，從而調控蠟質的積累。然而，目前尚未見到關于冬瓜CER1基因的相關研究報道。筆者通過同源克隆獲得了冬瓜CER1基因（BhCER1），并基于與其他物種CER1蛋白的同源性，構建了系統(tǒng)發(fā)育樹。結果顯示，冬瓜BhCER1基因與甜瓜CmCER1和黃瓜CsCER1的親緣關系最近。此外，蛋白磷酸化位點分析表明，BhCER1蛋白含有多種磷酸化位點，包括絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸化位點，推測BhCER1蛋白活性可能受磷酸化作用的調控。這為進一步研究冬瓜BhCER1基因的功能和調控機制提供了重要線索。

順式作用元件是基因轉錄調控的重要分子開關，其中啟動子是基因能夠準確表達的主要DNA調控序列[22]。已有研究表明，MYB轉錄因子可以直接結合CER1啟動子并上調表達，從而調控表皮蠟質的生物合成[23]。筆者通過分析BhCER1基因啟動子序列中的順式作用元件發(fā)現(xiàn)，其含有對脫落酸（ABRE）和赤霉素（P-box）響應的元件，推測冬瓜BhCER1基因可能通過激素調控參與植物的生長發(fā)育及逆境脅迫響應。此外，BhCER1啟動子中還含有響應厭氧誘導和光照的元件，進一步顯示了其在多種環(huán)境條件下可能發(fā)揮作用的潛力。

前人研究表明，植物表皮蠟質廣泛存在于地上部的組織中，并由表皮細胞合成后轉運到細胞外，覆蓋在葉、花、種皮、果實和莖表面[24-25]。冬瓜屬于葫蘆科冬瓜屬蔬菜作物，其果實表面覆蓋有較厚的蠟質，對貯藏和抗病菌侵染具有重要作用。因此，研究冬瓜果皮蠟質具有重要意義。在蔬菜作物中，已有研究通過同源基因克隆獲得了一批與蠟質形成相關的基因。例如，劉小鳳等[26]通過熒光定量PCR和生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，CsCER7響應脫落酸，并影響果皮蠟質的形成。筆者通過qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，BhCER1基因在成熟果皮中的表達量最高，其次是果肉、雌花、雄花、葉片、莖，而在根中幾乎不表達。這一結果表明，BhCER1基因可能在冬瓜果實蠟質合成過程中發(fā)揮重要作用，但其具體的生物學功能仍需開展深入的系統(tǒng)研究。

綜上所述，筆者通過同源克隆獲得了冬瓜BhCER1基因，并結合生物信息學和表達特征分析，初步明確了BhCER1基因在不同器官中的表達差異。本研究結果不僅為揭示BhCER1基因在冬瓜果皮蠟質合成中的具體作用機制奠定了基礎，同時也為后續(xù)BhCER1基因的生物學功能研究提供了重要參考。

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