摘要：為構(gòu)建腦心肌炎病毒VP2 2A基因真核表達(dá)載體。參考EMCV毒株基因組序列，設(shè)計VP2 2A基因特異性引物，PCR擴增VP2 2A基因目的片段，雙酶切目的基因和pcDNA3.1-Flag質(zhì)粒產(chǎn)生相同的黏性末端，使用T4 DNA連接酶連接相同的黏性末端，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌液PCR鑒定陽性單克隆菌落，對陽性單克隆提取重組質(zhì)粒并雙酶切進(jìn)行驗證，對陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行測序。重組質(zhì)粒雙酶切和測序結(jié)果表明，pcDNA3.1-Flag-VP2和pcDNA3.1-Flag-2A真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

關(guān)鍵詞：腦心肌炎病毒；VP2基因；2A基因；真核表達(dá)載體

腦心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus， EMCV）是一種重要的人畜共患病病原，主要感染嚙齒類、豬及靈長類動物，豬感染后可造成突然死亡和實質(zhì)器官的廣泛病理損傷，引起心肌炎、腦炎、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、生殖系統(tǒng)疾病和糖尿病等，威脅養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展和公共衛(wèi)生安全。EMCV是單股正鏈RNA病毒，屬于小RNA病毒科，心肌病毒屬[1]。EMCV基因組全長約7.8 kb，包括5′UTR、3′UTR和一個編碼區(qū)，編碼區(qū)可編碼一種多聚蛋白（L-1ABCD-2ABC-3ABCD），該聚蛋白在3種蛋白酶的作用下被分解成前導(dǎo)蛋白L和前體P1、P2、P3[2-3]。病毒粒子無囊膜，直徑約為27nm，粒子表面由衣殼粒子組成，每個衣殼粒子含有4種結(jié)構(gòu)蛋白，即VP1、VP2、VP3和VP4，非結(jié)構(gòu)蛋白則包括2A、2B、2C、2D、3A、3B、3C和3D等[4-5]。其中VP1、VP2和VP3位于病毒粒子的表面，VP1是最重要的中和性抗原表位，具有最強的免疫原性；VP4位于衣殼內(nèi)部，抗原性較弱；3C、3D蛋白具有蛋白酶作用；2A蛋白參與自動催化和病毒多聚蛋白的早期裂解[6]。本研究對腦心肌炎病毒的VP2基因和2A基因的真核表達(dá)載體進(jìn)行構(gòu)建，為后續(xù)相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

第一，質(zhì)粒與毒株。

pcDNA3.1-Flag質(zhì)粒、EMCV毒株（GenBank登錄號X74312），均由西北民族大學(xué)生物工程與技術(shù)國家民委重點實驗室提供。

第二，主要試劑。

反轉(zhuǎn)錄預(yù)混型試劑盒購自湖南艾科瑞生物工程有限公司、DNA Marker購自中科瑞泰（北京）生物科技有限公司、Trizol試劑、Ex Taq酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司、瓊脂糖凝膠純化試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司、質(zhì)粒提取試劑盒購自北京云肽生物科技有限公司。

第三，主要儀器。

PCR儀[型號：TOne 96G，Biometra]、電泳儀（型號：DYY-6D，

北京六一生物科技有限公司）、凝膠成像儀（型號：Amersham Imager 600，Cytiva思拓凡）

1.2 實驗方法

第一，引物設(shè)計。

參照EMCV病毒蛋白VP2 2A基因的全長序列（GenBank登錄號X74312），使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列如表1所示。

第二，VP2 2A基因的PCR擴增與純化。

利用Trizol試劑提取EMCV毒株感染細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄預(yù)混型試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體步驟參照試劑盒說明書。用1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化。

第三，VP2 2A基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定。

經(jīng)純化的VP2基因和pcDNA3.1-Flag質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切，2A基因和pcDNA3.1-Flag質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BamHⅠ雙酶切。瓊脂糖凝膠電泳檢驗pcDNA3.1-Flag質(zhì)粒被酶切為線性化質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠回收試劑盒將目的片段與線性化質(zhì)粒進(jìn)行純化。pcDNA3.1-Flag線性化質(zhì)粒與目的片段用T4 DNA連接酶以1∶3比例連接。連接產(chǎn)物取5μL轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，取100μL轉(zhuǎn)化后菌液均勻涂布于帶有氨芐抗性的LB瓊脂平板。挑取LB瓊脂平板上的單克隆菌落接種于LB液體培養(yǎng)基。取2μL菌液進(jìn)行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳鑒定菌液PCR產(chǎn)物中是否存在目的條帶。參照質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取陽性菌液質(zhì)粒并雙酶切驗證，陽性重組質(zhì)粒送往上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 pcDNA3.1-Flag-VP2、pcDNA3.1-Flag-2A真核表達(dá)載體構(gòu)建

第一，VP2 2A基因PCR克隆及pcDNA3.1-Flag載體線性化分析。

EMCV感染HEK293T細(xì)胞9hpi，使用RNAiso Plus裂解液裂解細(xì)胞，提取RNA，取1μgRNA按照AG反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，以cDNA為模板擴增出VP2 2A基因片段，使用膠回收試劑盒對擴增產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果如圖1A所示，瓊脂糖凝膠電泳圖中呈現(xiàn)VP2 2A基因擴增長度為767bp和470bp，與NCBI中記錄的大小一致，與預(yù)期相符，結(jié)果表明PCR擴增成功。

對擴增的VP2 2A基因和pcDNA3.1-Flag空載質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切驗證，使用膠回收試劑盒對酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化，瓊脂糖凝膠電泳檢測其純化質(zhì)量。結(jié)果如圖1B和C所示，VP2 2A酶切后條帶大小無變化，pcDNA3.1-Flag質(zhì)粒被酶切成線性化質(zhì)粒。

圖 1 A： EMCV VP2 2A基因PCR擴增結(jié)果 B C： VP2 2A基因和pcDNA3.1-Flag質(zhì)粒雙酶切結(jié)果

第二，擴增產(chǎn)物與線性化載體連接轉(zhuǎn)化及重組質(zhì)粒鑒定。

使用T4 DNA連接酶將PCR純化產(chǎn)物與pcDNA3.1-Flag線性化載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取克隆質(zhì)粒驗證，對轉(zhuǎn)化成功的重組質(zhì)粒菌液進(jìn)行PCR擴增并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果如圖2A所示，重組質(zhì)粒擴增出VP2和2A基因。結(jié)果表明VP2和2A基因與pcDNA3.1-Flag質(zhì)粒成功連接。

挑選陽性菌液PCR擴增成功的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗證，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果如圖2B所示，pcDNA3.1-Flag-VP2重組質(zhì)粒雙酶切后存在2個條帶，分別是pcDNA3.1-Flag質(zhì)粒條帶和VP2基因條帶；pcDNA3.1-Flag-2A重組質(zhì)粒雙酶切后同樣存在2個條帶，分別是pcDNA3.1-Flag質(zhì)粒條帶和2A基因條帶。結(jié)果表明pcDNA3.1-Flag真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.2 序列比對

將構(gòu)建成功的pcDNA3.1-Flag-VP2和pcDNA3.1-Flag-2A真核表達(dá)載體送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。序列比對結(jié)果如圖3所示，NCBI提供EMCV毒株X74312序列與pcDNA3.1-Flag-VP2、pcDNA3.1-Flag-2A測序結(jié)果比對無缺失或替換，以上結(jié)果表明pcDNA3.1-Flag-VP2和pcDNA3.1-Flag-2A真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

3 結(jié)論

分別成功構(gòu)建腦心肌炎病毒VP2、2A基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-Flag-VP2和pcDNA3.1-Flag-2A，為下一步研究腦心肌炎病毒編碼的結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白奠定基礎(chǔ)。

4 討論

EMCV在全球范圍內(nèi)分布，被感染動物可出現(xiàn)腦炎或心肌炎等臨床癥狀。VP2蛋白與病毒表面的抗原表位形成相關(guān)，具有良好的免疫原性，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體和細(xì)胞因子的變化；2A參與病毒多聚蛋白的早期裂解。本文成功構(gòu)建VP2基因和2A基因的真核表達(dá)載體為后續(xù)腦心肌炎病毒蛋白的表達(dá)及功能驗證研究提供更多數(shù)據(jù)支持?！?/p>

參考文獻(xiàn)：

[1] A Z， B N-S， J P K， H J E. The complete nucleotide sequence and construction of an infectious cDNA clone of a highly virulent encephalomyocarditis virus[J]. Virology， 1994， 203（2）.

[2] Palmenberg A， Kirby E， Janda M， Drake N， Duke G， Potratz K， Collett M. The nucleotide and deduced amino acid sequences of the encephalomyocarditis viral polyprotein coding region[J]. Nucleic acids research， 1984， 12（6）： 2969-2985.

[3] 施開創(chuàng)， 屈素潔， 陳進(jìn)喜， 許瑞勝， 鄭敏， 劉棋， 陳漢忠， 李剛. 豬源腦心肌炎病毒GXLC株全基因組序列測定與分析[J]. 病毒學(xué)報， 2010， 26（02）： 134-142.

[4] Kristin M B， Bert L S. Regulation of picornavirus gene expression[J]. Microbes Infect， 2004， 6（7）.

[5] Margot C， Labib B-K. The encephalomyocarditis virus[J]. Virulence， 2012， 3（4）.

[6] Zheng W， Haolin Y， Wenyue Z， Jingxuan C， Yi J， Zhicheng G， Xiaotian H， Qiong L. Cell pyroptosis in picornavirus and its potential for treating viral infection[J]. J Med Virol， 2022， 94（8）.

收稿日期：2024-12-20

基金項目：西北民族大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費（31920230154）；西北民族大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費（131920230001）；甘肅省自然科學(xué)基金（23JRRA720）

作者簡介：邵帥（1998—），女，碩士研究生。研究方向：分子病原學(xué)與免疫學(xué)。

通訊作者：李瓊毅（1980—），女，博士，教授。研究方向：分子病原生物學(xué)。