摘 要：山東省某養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)的12日齡鸚鵡出現(xiàn)呼吸困難、鼻腔內(nèi)充滿干酪樣分泌物等癥狀，采集死亡鸚鵡的鼻腔內(nèi)分泌物和肺臟組織分離細(xì)菌，通過(guò)生化試驗(yàn)、16S rDNA測(cè)序和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，初步證實(shí)該病由肺炎克雷伯菌肺炎亞種所致。藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該分離菌對(duì)大部分藥物耐受，僅對(duì)氟苯尼考、氧氟沙星等藥物高度敏感，對(duì)多粘菌素B、阿米卡星等藥物中度敏感。本研究為鸚鵡肺炎克雷伯菌感染的臨床診治提供了理論依據(jù)和參考。

關(guān)鍵詞：鸚鵡；肺炎克雷伯菌；分離鑒定；藥敏試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：S858.39 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1673-1085（2025）02-0037-06

肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumonia）是一種引起多種動(dòng)物和人類肺炎的革蘭氏陰性條件性病原菌，屬于腸桿菌科，克雷伯菌屬[1]。肺炎克雷伯氏菌分為肺炎、臭鼻和鼻硬結(jié)3個(gè)亞種，其中肺炎亞種廣泛存在于人和動(dòng)物的上呼吸道和腸道，當(dāng)機(jī)體抵抗力降低時(shí)便會(huì)誘發(fā)疾病[2]。已有報(bào)道鸚鵡感染肺炎克雷伯氏菌后臨床上表現(xiàn)出伸頸、呼吸困難、鼻腔堵塞、肺炎等病癥，嚴(yán)重影響了鸚鵡養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[3]。2023年山東省某養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)的12日齡鸚鵡出現(xiàn)呼吸困難、鼻腔內(nèi)充滿干酪樣分泌物等癥狀，剖檢發(fā)現(xiàn)肺炎、肝臟變化不明顯。經(jīng)細(xì)菌分離培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗(yàn)、基因測(cè)序和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)鑒定分離菌為肺炎克雷伯菌肺炎亞種感染，經(jīng)藥敏試驗(yàn)篩選出敏感藥物進(jìn)行治療，該鸚鵡群疫情很快得到控制，現(xiàn)總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源

采集山東省某養(yǎng)殖場(chǎng)12日齡發(fā)病鸚鵡的鼻腔粘液和肺組織。

1.2 主要試劑

pMD-18T克隆載體，購(gòu)自TaKaRa公司；PCR擴(kuò)增試劑盒，均購(gòu)自Axygen公司；細(xì)菌微量生化管，購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司；藥敏紙片，購(gòu)自北京艾博利德商貿(mào)有限公司；LB培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基及其他試劑，購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌分離 無(wú)菌采集發(fā)病鸚鵡的鼻腔組織粘液在LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h；挑取單菌落在麥康凱培養(yǎng)平板鑒別培養(yǎng)，觀察菌落生長(zhǎng)情況；革蘭氏染色后鏡檢觀察。

1.3.2 生化試驗(yàn) 挑取分離菌（標(biāo)記為：KP-parrot）單個(gè)菌落，參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[4]，按照生化管說(shuō)明書(shū)進(jìn)行生化試驗(yàn)。

1.3.3 16S rDNA序列測(cè)定及分析 挑取分離菌KP-parrot的單菌落懸浮于50 μL雙蒸水作為模板，使用16s rDNA通用引物：上游引物為5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；下游引物為5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，按照以下比例配制反應(yīng)體系：模板1 μL，上下游引物 （ 20 pmol/μL） 各0.5 μL，2×Taq PCR Mix 12.5 μL，補(bǔ)充去離子水至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，

72 ℃ 1 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。將陽(yáng)性PCR產(chǎn)物送生工生物工程 （ 上海） 股份有限公司測(cè)序。

將序列與GenBank中登錄的產(chǎn)酸克雷伯菌株、產(chǎn)氣克雷伯菌、變棲克雷伯菌、肺炎克雷伯菌肺炎亞種、肺炎克雷伯菌臭鼻亞種、肺炎克雷伯菌鼻硬結(jié)亞種等肺炎克雷伯菌核苷酸序列對(duì)比，見(jiàn)表1；使用MEGA 7.0制作系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

收稿日期：2024-08-23

基金項(xiàng)目：山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2022CXGC010606，2022CXPT010-04）；山東省家禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系首席專家項(xiàng)目（SDAIT-11-01）；

2024年山東省農(nóng)業(yè)重大技術(shù)協(xié)同推廣計(jì)劃（SDNYXTTG-2024-09）

第一作者：黃濤（2000—），碩士研究生，獸醫(yī)專業(yè)，E-mail：erbercom@163.com

通信作者：馬秀麗（1978—），研究員，主要從事禽病診斷與防治技術(shù)研究，E-mail：maxiuli1978@163.com

1.3.4 藥物敏感試驗(yàn) 按照WHO推薦的瓊脂紙片擴(kuò)散法（K-B）對(duì)分離菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果按照NCCLS標(biāo)準(zhǔn)做出判定。所用的檢測(cè)藥物有氟苯尼考、強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、恩諾沙星、氧氟沙星、慶大霉素、多粘菌素B、頭孢噻肟、阿莫西林、氨芐西林、卡那霉素、阿米卡星、鏈霉素、紅霉素、林可霉素、復(fù)方新諾明、恩諾沙星等。根據(jù)藥敏結(jié)果選擇敏感藥物治療。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離與培養(yǎng)結(jié)果

患病鸚鵡的鼻腔液在LB固體培養(yǎng)基上劃線，37 ℃培養(yǎng)24 h后可見(jiàn)圓形、隆起、灰白色、光滑濕潤(rùn)的菌落。挑取單菌落在麥康凱培養(yǎng)平板上劃線，可見(jiàn)粉色、大而隆起、光滑濕潤(rùn)菌落，48 h后相鄰菌落融合成膿汁樣；革蘭氏染色后鏡檢為革蘭氏陰性桿菌，單個(gè)、成對(duì)或短鏈狀排列的短小桿狀，菌體小，約（0.5～0.8）μm×（1.5 ～2.0）μm，見(jiàn)圖1。

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果

生化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。分離菌KP-parrot能利用麥芽糖、果糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、尿素，判為陽(yáng)性；不能利用枸櫞酸鹽，判為陰性；不產(chǎn)生硫化氫，判為陰性。

2.3 16S rDNA測(cè)序分析

通過(guò)PCR擴(kuò)增出的目的片段大小約1 200 bp，見(jiàn)圖2；測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI網(wǎng)站BLAST比對(duì)，與肺炎克雷伯菌的核苷酸同源性高達(dá)99%。

利用Mega7.0軟件對(duì)分離菌KP parrot及其它參考序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，結(jié)果顯示KP parrot菌株與肺炎克雷伯菌肺炎亞種AAM7株（GenBank：MK512007）分布在同一分支上，親緣關(guān)系最為接近，見(jiàn)圖3。結(jié)合細(xì)菌特征及生化試驗(yàn)結(jié)果，初步鑒定該菌為肺炎克雷伯菌肺炎亞種（subsp. pneumoniae）。

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏結(jié)果顯示分離菌對(duì)于氟苯尼考、氧氟沙星高度敏感；對(duì)多粘菌素B、阿米卡星表現(xiàn)出中度敏感；對(duì)強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、卡那霉素、慶大霉素、恩諾沙星、頭孢噻肟、阿莫西林、氨芐西林、紅霉素、鏈霉素、林可霉素、復(fù)方新諾明等均表現(xiàn)為耐藥，結(jié)果見(jiàn)表3。

根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇敏感藥物氟苯尼考溶液治療，按照說(shuō)明書(shū)推薦劑量連續(xù)用藥5 d，發(fā)病鸚鵡的呼吸道癥狀緩解，同時(shí)配合做好環(huán)境消毒，有效控制了該病。

3 討論

肺炎克雷伯菌在自然界的分布極為廣泛，但由于其作為一種條件致病性病原菌，因此未受到業(yè)內(nèi)人士的廣泛關(guān)注。近年來(lái)，隨著養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，集約化養(yǎng)殖規(guī)模逐漸增大，各種動(dòng)物疫病種類也層出不窮。一旦動(dòng)物機(jī)體免疫能力下降，肺炎克雷伯菌這類條件性致病菌便有機(jī)可乘。研究發(fā)現(xiàn)，由于抗生素的大量使用導(dǎo)致肺炎克雷伯菌的耐藥性呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)[5-6]，因肺炎克雷伯菌感染動(dòng)物的病例屢見(jiàn)不鮮，如禽類尤其是鸚鵡感染后會(huì)流鼻涕、眼周水腫、鼻孔內(nèi)出現(xiàn)干酪樣堵塞物、呼吸困難以及肝臟點(diǎn)狀壞死、心臟及皮下存在黃色的膠凍樣滲出物[7]；羊感染后肺部嚴(yán)重充血，肝脾淤血腫大[8]；鼠感染后心肌纖維腫脹、脾小梁水腫、肺部毛細(xì)血管擴(kuò)張[9]，嚴(yán)重阻礙了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

本試驗(yàn)從鸚鵡鼻腔粘液中分離出疑似病原菌，對(duì)分離菌的形態(tài)、生化特性進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)該菌的生化鑒定結(jié)果符合肺炎克雷伯菌的生化特性，與左偉等[10]的試驗(yàn)結(jié)果相一致。通過(guò)16S rDNA測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，進(jìn)一步確定分離株為肺炎克雷伯菌肺炎亞種。通過(guò)藥敏試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離株僅對(duì)部分四環(huán)素類、喹諾酮類高度敏感，對(duì)部分喹諾酮類、氨基糖苷類和多肽類藥物中度敏感，對(duì)大部分藥物不敏感，其藥敏結(jié)果與符德佳等[11]的試驗(yàn)結(jié)果存在一定的差異，表明不同區(qū)域不同動(dòng)物所分離的肺炎克雷伯菌對(duì)藥物的敏感性也不盡相同，實(shí)際生產(chǎn)中最好通過(guò)藥敏試驗(yàn)選擇敏感藥物，以減少抗生素的濫用，避免耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生。

通過(guò)后續(xù)的跟蹤觀察，養(yǎng)殖戶使用氟苯尼考溶液治療后，病情得到了很好的控制。本研究對(duì)鸚鵡肺炎克雷伯菌的有效防控具有一定的借鑒意義。

參考文獻(xiàn)：

[1] HOLT J G，KRIEG N K，SNEATH P H A．Manual of Determinative Bacteriology 9th ed[M].USA：Wilkins Co，1994：181.

[2] 付霞麗，鄭紫方，肖書(shū)奇，等.一株豬源肺炎克雷伯菌的分離與鑒定[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2021，51（8）：

999-1006．

[3] DAVIES， Y.M.，CUNHA， M.P.V.，DROPA， M.， et al. Pandemic Clones of CTX-M-15 Producing Klebsiella pneumoniae ST15， ST147， and ST307 in Companion Parrots[J]. Microorganisms 2022，10（7）：1412.

[4] 布坎南.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社，1995.

[5] WANG G Y， ZHAO G， CHAO X Y， et al. The characteristic of virulence， biofilm and antibiotic resistance of Klebsiella pneumoniae[J]. Int J Env Res Pub He，2020，17（17）：6278.

[6] 閆曉煜，肖創(chuàng)清.肺炎克雷伯菌多重耐藥性與基因 PBP2、PBP3的相關(guān)性研究[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2017，38（14）：1873-1875+1878．

[7] MCLAUCHLIN J， NARAYANAN G L， MITHANI V，

et al . The detection of enterotoxins and toxic shock síndrome toxin genes in Staphylococcus aureus by polymerase chain reaction[J]. J Food Prot. 2000（63）： 479-488.

[8] 范培超，史量全，溫樹(shù)波，等．羊源肺炎克雷伯菌的分離鑒定及毒力基因檢測(cè)[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2021，41（1） ： 96-101．

[9] 張?jiān)娪?肺炎克雷伯桿菌的分離鑒定及其對(duì)小鼠的致病性研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[10]左偉，武琦，張千，等.藏豬源肺炎克雷伯菌的分離鑒定及生物學(xué)特性研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2022（9）：72-79+141.

[11]符德佳，康樺華，曾憲軍，等.雞場(chǎng)飲水中肺炎克雷伯氏菌的分離鑒定及耐藥性研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024，51（2）：124-138.

Diagnosis of Parrots Infected with Klebsiella Pneumoniae

HUANG Tao1， LIU Jinfeng2， LIN Zhongyin3， JU Yan3， JIANG Yifei3，

ZHAO Qiaoya3， MA Xiuli3

（1.Nanjing Agricultural University，College of Veterinary Medicine，Nanjing 210095，China;

2. Yinan County Animal Husbandry Bureau，Yinan 276300，China;

3.Poultry Research Institute of Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100，China）

Abstract： Parrots， bred in a farm in Shandong Province， exhibited a series of symptoms such as respiratory distress and caseous-like secretions in the nasal cavity. The nasal secretions and lung tissue from deceased parrots were collected for bacterial isolation. It was preliminarily confirmed that this case was caused by subspecies of Klebsiella pneumoniae through biochemical assays， 16S rDNA sequencing， and phylogenetic analysis. Antimicrobial susceptibility test showed that this strain is resistant to most antibiotics but highly sensitive to florfenicol and ofloxacin， while exhibiting moderate sensitivity to polymyxin B and amikacin. This study provides a theoretical evidence and reference for the clinical diagnosis and treatment of Klebsiella pneumoniae infections in parrots.

Keywords： Parrot; Klebsiella pneumoniae; Isolation and identification; Antimicrobial susceptibility test