摘要： 【目的】谷子具有較強的耐瘠薄特性，探索谷子響應(yīng)低磷脅迫的根系形態(tài)與生理代謝變化，對于了解谷子耐低磷機制具有重要意義。【方法】以耐低磷型種質(zhì)B254 和低磷敏感型種質(zhì)B171 為試材進(jìn)行水培試驗，設(shè)置正常和低磷Hoagland 營養(yǎng)液兩個處理，KH2PO4 濃度分別為0.25、0.0025 mmol/L。幼苗在營養(yǎng)液中處理7、14 天時，取樣分析農(nóng)藝性狀、根系形態(tài)、磷含量、生理酸性磷酸酶（ACP） 活性，利用LC-MS/MS 技術(shù)分析葉片和根系的代謝物，以VIPgt;1、|log2（FC）|≥1 和Plt;0.05 為條件篩選差異代謝物，并利用KEGG 代謝通路數(shù)據(jù)庫分析差異代謝物主要存在的代謝途徑?！窘Y(jié)果】在低磷條件下，谷子株高顯著降低了32.8%，根系磷含量降低可達(dá)75.84%，但耐受型B254 總根長、根表面積分別顯著增加了33.7%、59.5%，表現(xiàn)出較強的耐低磷特性。同時，葉綠素、花青素和酸性磷酸酶（ACP） 活性在低磷條件下也顯著增加，其中B254 的葉片與根系A(chǔ)CP 活性分別顯著增加了91.83% 與22.91%。相關(guān)性分析結(jié)果表明，在低磷條件下株高、根系發(fā)育與生理適應(yīng)性狀之間的相關(guān)性顯著增強。代謝組學(xué)差異分析結(jié)果顯示，低磷脅迫下不同低磷耐受型谷子代謝產(chǎn)物類型存在較大差異，其中B171 在葉片和根系中積累了大量的黃酮、萜類和脂質(zhì)，而B254 的差異代謝物主要為氨基酸和脂質(zhì)，尤其是特殊酯類磷脂合成前體溶血磷脂酸積累。KEGG 代謝通路分析發(fā)現(xiàn)，低磷脅迫顯著富集了谷子葉片的嘌呤代謝和根系苯丙氨酸代謝?！窘Y(jié)論】低磷脅迫誘導(dǎo)谷子耐低磷種質(zhì)提高了酸性磷酸酶活性，提升了花青素含量，并促進(jìn)了黃酮、氨基酸、脂類等代謝物的合成，尤其是對類磷脂合成前體如溶血磷脂酸的累積起到極為關(guān)鍵的作用，產(chǎn)生的差異代謝物主要出現(xiàn)在嘌呤代謝和苯丙氨酸代謝途徑。

關(guān)鍵詞： 谷子；低磷脅迫；根系形態(tài)；生理響應(yīng)；差異代謝物

磷（P） 作為植物生命活動中不可或缺的關(guān)鍵營養(yǎng)元素之一，影響著植物體內(nèi)的生物分子結(jié)構(gòu)（如磷脂、ATP 及核酸） 與細(xì)胞功能調(diào)控（如蛋白質(zhì)合成與調(diào)節(jié)）[1?2]。盡管土壤中磷元素儲量豐沛，但多以不溶性形態(tài)存在，易與Fe、Al、Ca 等離子結(jié)合，形成難以被植物直接吸收的化合物，導(dǎo)致土壤中有效磷（Pi） 含量有限，從而難以滿足植物生長發(fā)育的旺盛需求[3]。為應(yīng)對這一環(huán)境壓力，植物在漫長的進(jìn)化歷程中演化出一套精密的信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，能夠敏銳感知內(nèi)外磷水平波動，并觸發(fā)一系列適應(yīng)性反應(yīng)，包括根系構(gòu)型的重塑、養(yǎng)分利用效率的提升及代謝物譜的調(diào)整，以增強對低磷環(huán)境的耐受性[4]。植物體內(nèi)的磷素增加在一定程度上會緩解干旱、鹽、高溫等非生物脅迫對植物的傷害，提高植物對非生物脅迫的抗性[5]。谷子（Setaria italica），被譽為“五谷之尊”，源自中國北方的野生狗尾草馴化，是一種兼具強抗旱性與耐瘠薄特性的C4 作物，展現(xiàn)出較強的生態(tài)適應(yīng)性[6]。尤其是我國北方廣泛存在的土壤鹽堿化問題，嚴(yán)重抑制著植物營養(yǎng)的吸收均衡性，顯著地降低了土壤磷素的有效性，嚴(yán)重影響作物產(chǎn)量[7]。磷素缺乏會導(dǎo)致谷子葉色發(fā)紅（紫）、根系發(fā)育不良、生長速度減緩等癥狀形成，同時增加秕谷比例，并進(jìn)一步降低谷子的抗病能力和品質(zhì)[ 8 ? 9 ]。這啟示我們深入探究低磷脅迫對谷子根系形態(tài)與生理代謝的影響，對于揭示其耐瘠薄特性的內(nèi)在機制至關(guān)重要。

植物界中廣泛存在著針對低磷脅迫的適應(yīng)性策略，從植株形態(tài)、生理及分子層面均有體現(xiàn)，旨在確保植物在磷匱乏條件下能正常生長和發(fā)育[10]。例如，擬南芥（Arabidopsis thaliana） 通過增加根毛數(shù)量、側(cè)根密度，減少主根長度，從而提高根系對土壤磷的捕獲能力[11?12]。植物體內(nèi)糖代謝與脂類代謝也會發(fā)生適應(yīng)性調(diào)整，如甘藍(lán)型油菜（Brassica napus）在低磷時增強根毛發(fā)育與質(zhì)子、酸性磷酸酶（ACP）及羧酸鹽的分泌，以促進(jìn)磷的吸收與利用[13?14]。根系分泌物作為植物與環(huán)境交流的關(guān)鍵媒介，其成分變化可直接反映植物對逆境的響應(yīng)機制[15]，例如在磷饑餓條件下，擬南芥通過分泌紫色酸性磷酸酶（PAP）開辟了將無機磷轉(zhuǎn)化為有機磷的有效途徑[16?17]。相比之下，玉米（Zea mays）、小麥（Triticum aestivum） 等作物根系的羧酸鹽分泌則對磷供應(yīng)變化不敏感[18?19]，但耐低磷玉米根系中脂質(zhì)代謝物的積累加速了Pi 信號傳遞，增強了其環(huán)境適應(yīng)性[20]。通過增加有機酸的積累與分泌，植物能夠有效釋放土壤中的可溶性磷酸鹽，這一策略在苜蓿（Medicago sativa）、菜豆（Phaseolus vulgaris）、水稻（Oryza sativa）、玉米等多種作物中均有報道[21?22]。例如，油菜在低磷時顯著增加根系分泌的丁二酸、蘋果酸及檸檬酸含量，而木豆則分泌大量番石榴酸以應(yīng)對磷饑餓[23]。同一物種中不同品種的耐低磷特性也存在較大差異，如不同小麥品種間磷素利用效率相差10 倍以上，低磷敏感品種和耐低磷品種生物量、根長和根體積均存在顯著差異[24]。低磷條件下，不同基因型谷子的產(chǎn)量相關(guān)性狀和根系構(gòu)型表現(xiàn)也存在顯著差異[25]，不同品種的根長增長范圍從11.43% 到28.57%，生物量降低幅度由6.29% 到高達(dá)18.55%[26]。因此，分析不同品種的耐低磷特性，篩選低磷耐受型和高磷應(yīng)答型種質(zhì)，可為耐低磷作物的育種和分子機制的研究，改良作物磷利用效率奠定研究基礎(chǔ)。

代謝組學(xué)作為解析植物非生物脅迫耐受性的強大工具，正逐步揭示出植物體內(nèi)代謝物變化與逆境響應(yīng)之間的復(fù)雜聯(lián)系。通過利用液相/氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（LC/GC-MS），研究人員已在大麥等作物中發(fā)現(xiàn)了低磷條件下代謝物譜的顯著變化，涉及三羧酸循環(huán)及胺代謝等多個關(guān)鍵途徑[27]。近年來，針對谷子磷素養(yǎng)分高效利用機制的研究雖已取得一定進(jìn)展，如谷子豫谷1 號（Yugu1） 在低磷脅迫下表現(xiàn)出冠根長度、側(cè)根數(shù)量和冠根密度（側(cè)根數(shù)量與冠根長度之比） 顯著增加[28]，但不同谷子種質(zhì)在低磷條件下根系形態(tài)構(gòu)型、生物量變化均存在顯著差異。相對于低磷敏感型種質(zhì)，耐低磷種質(zhì)根毛數(shù)量有顯著提高，且生長受限和生物量減少的幅度相對較低[25]。在耐低磷分子機制方面，低磷脅迫促使谷子改變磷信號調(diào)控因子或磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白等的表達(dá)，可提高植物對低磷脅迫的耐受性[29]，例如低磷會顯著誘導(dǎo)根系中磷酸鹽轉(zhuǎn)運體基因SiPHT1.1、SiPHT1.2 和SiPHT1.4表達(dá)上調(diào)[28]。此外，谷子磷酸鹽饑餓響應(yīng)基因SiPHR1可通過增加主根長度、側(cè)根和根毛數(shù)量來增強植株的耐低磷特性[30]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，深入挖掘和開發(fā)谷子磷高效吸收與利用的關(guān)鍵代謝物及其調(diào)控基因，對實現(xiàn)作物養(yǎng)分利用率、抗逆性和產(chǎn)量同時提高的目標(biāo)具有重要的基礎(chǔ)意義。因此，本研究基于前期篩選出的耐低磷與磷敏感谷子種質(zhì)，通過對比分析其在低磷與正常磷條件下的根系形態(tài)、ACP 活性，并利用UPLC-MS/MS 技術(shù)鑒定低磷條件下的葉片和根系的差異代謝物，旨在揭示谷子耐低磷代謝信號途徑的關(guān)鍵要素，為谷子磷高效代謝機理的深入闡釋提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

本研究以前期篩選的谷子低磷敏感型種質(zhì)B171（河北廣宗縣） 和低磷耐受型種質(zhì)B254 糯粟（江西省上饒市） 為試驗材料，首先使用15% 雙氧水對籽粒表面消毒30 min，再用蒸餾水重復(fù)沖洗5 次后，在帶有濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)黑暗萌發(fā)48 h。然后將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到14 h 光照/10 h 黑暗、光強30000 Lux，溫度22℃～28℃，相對濕度45% 的氣候室中培養(yǎng)。第7 天時，從兩種材料中分別挑選出長勢均勻的幼苗移栽至水培盒（31 cm×29 cm×18 cm） 中，加入霍格蘭營養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。繼續(xù)培養(yǎng)7 天后進(jìn)行低磷條件處理，低磷濃度設(shè)置為（KH2PO4） 0.0025 mmol/L，同時設(shè)置正常磷濃度（0.25 mmol/L） 為對照，每3 天更換1 次營養(yǎng)液。每個處理重復(fù)6 次。

1.2 植物表型和生理指標(biāo)測定

在培養(yǎng)7 和14 天后，取幼苗樣測定植株形態(tài)、生理表型、磷含量，每組設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)。其中使用鋼尺測定株高和根長，使用千分之一天平稱量鮮重后，分別將根、葉片樣品裝入牛皮紙袋中，放入烘箱105℃ 2 h 后，60℃ 48 h 烘干至恒重，最后稱其干重。將烘干的根系和葉片組織進(jìn)行研磨，通過H2SO4?H2O2 法消解后，采用鉬藍(lán)比色法測定磷含量。使用根系掃描儀（Epson Perfection V850 Pro） 測量總根長（ T R L ）、根表面積（ R S A ） 和根分支數(shù)（RBN）；便攜式葉綠素儀（SPAD-502 ChlorophyllMeter Model） 測定倒二葉的葉綠素相對含量（SPAD）；采用南京建成生物工程研究所酸性磷酸酶（ACP） 試劑盒測定低磷脅迫14 天后的葉片ACP 活性，ACP活性以1 g 組織蛋白在37℃ 與基質(zhì)作用30 min 產(chǎn)生1 mg 酚為1 個活力單位，即U/（g·protein）；采用鹽酸?甲醇法測定花青素含量，使用1% 鹽酸?甲醇浸提樣品12 h，用酶標(biāo)儀測定535 nm 處的吸光值。

花青素含量（nmol/g） = （A535/0.0462）×（V/m）

式中：A535 表示樣品在535 nm 處的吸光值，V 為溶液總體積（mL），m 為樣品質(zhì)量（g）。

1.3 樣品代謝組測定

分別取上述根和葉樣品0.1 g，置于凍干機中真空冷凍干燥后，采用研磨儀（MM400） 研磨至粉末狀，之后將樣品放入2 mL 離心管中并加入1.0 mL 70%甲醇，然后采用多次渦旋混合（每次10 s，共3 次，間隔10 min） 方式進(jìn)行提取。提取液在4℃ 冰箱中靜置過夜后，以12000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液并通過0.22 μm 微孔濾膜過濾，保存于進(jìn)樣瓶中，以備代謝物的定性定量分析。檢測儀器為QExactiveTM plus 組合型四級桿OrbitrapTM 質(zhì)譜儀（Thermo Fisher）。采用Full Mass 和dd Mass2 分別對一、二級質(zhì)譜進(jìn)行掃描，其中二級質(zhì)譜檢測時的碎裂能量（cataclastic energy， CE） 分別設(shè)置20、40 和60 V，掃描窗口±1.6 m/z。最后，使用MassLynx V4.2 采集的原始數(shù)據(jù)通過Progenesis QI 軟件做峰提取、峰對齊等數(shù)據(jù)處理操作，并基于Progenesis QI 軟件在線METLIN 數(shù)據(jù)庫、公共數(shù)據(jù)庫識別代謝物。最后將原始數(shù)據(jù)上傳至MetaboAnalyst 5.0 （http：//www.metaboanalyst.ca） 在線軟件，根據(jù)所有代謝物峰面積的中位數(shù)對其進(jìn)行歸一化處理。

1.4 差異代謝物篩選及調(diào)控基因表達(dá)分析

在代謝物分析中，綜合運用單元和多元統(tǒng)計分析方法，以及正交偏最小二乘法判別分析VIP 值，通過設(shè)置VIPgt;1、差異倍數(shù)對數(shù)值|log2（FC）|≥1 且T 檢驗Plt;0.05 為條件篩選差異代謝物，并使用本地數(shù)據(jù)庫進(jìn)行差異代謝物質(zhì)譜定性分析。最后利用KEGG PATHWAY 數(shù)據(jù)庫（https：//www.kegg.jp/kegg/pathway.html/） 進(jìn)行差異代謝物的通路富集分析，以超幾何檢驗的Plt;0.05 定其代謝物富集的顯著性。利用前期在低磷條件下，低磷敏感型谷子根系低磷脅迫處理0.5、2、12 h 獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，鑒定并分析富集到重要代謝通路表達(dá)的基因[30]，獲得響應(yīng)低磷脅迫過程的具體基因的作用機制。

1.5 統(tǒng)計分析

在R 軟件環(huán)境中使用rstatix 和ggplot 2 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析和數(shù)據(jù)可視化，并使用t 檢驗比較不同磷水平下生長表型和生理表型的統(tǒng)計差異，圖形數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 低磷脅迫對谷子苗期生長表型和磷含量的影響

從圖1 可以看出，相比正常磷條件下，低磷條件下谷子種質(zhì)B171 （低磷敏感型） 和B254 （低磷耐受型） 的幼苗株高分別降低了49.3% 和16.3% （Plt;0.01），平均降低了32.8%，地上部干重分別降低了68.3% 和54.8% （Plt;0.01），根系總分支數(shù)分別增加了10.5%、31.3%，B171 根系表面積降低了46.3%（Plt;0.001），而B254 根系表面積和總根長分別顯著增加了59.5% 和33.7% （Plt;0.01），B171 總根長變化不顯著。在低磷條件下耐低磷種質(zhì)B254 的根冠比增加了10.7%，而低磷敏感種質(zhì)B171 根冠比反而降低了9.9%。同一磷條件下，B254 根系和葉片的磷含量明顯高于B171。而在低磷條件下，B254 根系和葉片磷含量分別顯著下降了36.06% 和43.86%，相比之下，B171 的根系磷含量下降幅度更為顯著（Plt;0.01），葉片和根系分別達(dá)到18.89% 和75.84%。由此可見，低磷條件顯著抑制了谷子幼苗的生長，而低磷耐受型B254 通過調(diào)整總根長、根表面積和根分支數(shù)等，減少根系和葉片中磷含量降低幅度，從而減少了低磷對幼苗生長的影響，表現(xiàn)出更強的低磷適應(yīng)性。

2.2 低磷脅迫對谷子生理性狀的影響及相關(guān)性分析

相比正常磷處理，在低磷條件下谷子葉綠素和花青素含量均增加。其中，低磷耐受型種質(zhì)B254葉片的葉綠素和花青素含量分別增加了17.2% 和17.4%，但低磷敏感種質(zhì)B171 葉綠素含量增加不顯著。此外，B254 葉片與根系中ACP 活性分別增加了91.83%、22.91%，而B171 根系的ACP 活性增加不顯著（圖2）。由此表明，低磷條件促進(jìn)了葉片中葉綠素和花青素的積累，并顯著提高了葉片ACP 的活性，但ACP 活性提升在低磷敏感種質(zhì)根系中表現(xiàn)不顯著。

在低磷和正常磷條件下，不同種質(zhì)的谷子幼苗農(nóng)藝性狀和生理性狀之間相關(guān)性存在較大差異（圖3）。正常磷條件下，株高與地上部干重、根表面積、根分支數(shù)均存在顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)（r） 分別為0.86、1.00 和0.97；而株高與根分支數(shù)均存在顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r 為?0.82。在低磷條件下，株高、根系發(fā)育與生理適應(yīng)性狀之間存在顯著正相關(guān)，且相關(guān)系數(shù)更高，其中株高與地上部干重、根干重和總根長存在顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r 分別為0.84、0.91和0.85?；ㄇ嗨睾透礎(chǔ)CP 活性與株高、根干重等農(nóng)藝性狀的相關(guān)性均達(dá)到顯著性水平，如根系A(chǔ)CP活性與株高、根干重、根表面積、根分支數(shù)相關(guān)系數(shù)分別為0.90、0.88、0.96 和0.90。由此可見，谷子在不同磷水平下，其農(nóng)藝性狀與生理性狀之間的相關(guān)性表現(xiàn)出顯著差異，低磷條件根表面積、總根長、根分支數(shù)的顯著增加，并伴隨有花青素和ACP活性的提升，從而更好地適應(yīng)磷脅迫。

2.3 谷子苗期對磷饑餓代謝響應(yīng)的差異代謝物分析及歸類

經(jīng)過低磷和正常磷條件處理7 和14 天，幼苗葉片和根樣品中共獲得447 個代謝產(chǎn)物譜。經(jīng)|log2FC|≥1和Plt;0.05 兩個條件篩選，低磷脅迫7 天后，敏感種質(zhì)B171 葉片中鑒定出96 個差異代謝物，其中44 個呈現(xiàn)上調(diào)趨勢（圖4A），主要包括氨基酸及其衍生物、萜類和脂質(zhì)（圖4B），脅迫14 天后，葉片中差異代謝物數(shù)量增至111 個，其中84 個上調(diào)。耐低磷種質(zhì)B254 葉片在低磷脅迫7 和14 天下分別鑒定到54個和31 個差異代謝物（圖4A）。在谷子幼苗根系中，低磷脅迫7 天后在敏感種質(zhì)B171 中鑒定到43 個差異代謝物，其中13 個呈現(xiàn)上調(diào)，主要為氨基酸及其衍生物和黃酮類；在14 天后，鑒定到的差異代謝物數(shù)量大幅增加至89 個，其中60 個呈現(xiàn)上調(diào)，涵蓋了更廣泛的代謝物類別，如氨基酸、黃酮類、萜類以及植物激素等（圖4B）。在耐受型種質(zhì)B254根中，脅迫7 天后，鑒定到28 個差異代謝物，其中17 個上調(diào)，主要涉及黃酮類；脅迫14 天后，差異代謝物數(shù)量增至81 個，上調(diào)代謝物以黃酮類和氨基酸及其衍生物為主。由此可見，低磷脅迫引起低磷敏感種質(zhì)B171 代謝物的變化明顯多于耐低磷種質(zhì)B254，差異代謝物葉片中主要包括氨基酸及其衍生物、萜類和脂質(zhì)，根系中主要為黃酮類和氨基酸等。

2.4 不同磷耐受型谷子共有的響應(yīng)低磷脅迫差異代謝物及其KEGG 富集分析

在低磷脅迫7、14 天后，28 個差異代謝物在低磷敏感種質(zhì)B171 葉片均被鑒定到，其中有11 個黃酮類和4 個脂質(zhì)（圖5A），而在耐低磷種質(zhì)B254 葉片中鑒定11 個，其中有2 個氨基酸及其衍生物和4 個脂質(zhì)。D-天冬酰胺、α-亞油酸乙醇酰胺和溶血卵磷脂LPC （18：3） 在2 個耐受型種質(zhì)葉片中均被鑒定到，血磷脂酸 （LPA 18：1 和LPC 18：3） 以及1 種溶血磷脂膽堿均顯著提高了1.6 倍。在B171根系中共有差異代謝物13 個，包括3 個黃酮類、2 個萜類、2 個吲哚衍生物以及芳香族（圖5B），在B254 根系共有差異代謝物7 個，包括3 個黃酮類、2 個脂質(zhì)和1 個萜類。其中茉莉酸在種質(zhì)B254 葉片和根系中分別顯著增加1.2 和1.8 倍。小白菊內(nèi)酯是唯一在兩個品種根系中均被鑒定到的差異代謝物。

將所有葉片和根系差異代謝產(chǎn)物在KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行代謝途徑比對，在氨基酸代謝、核苷酸代謝、脂質(zhì)代謝、能量代謝和碳水化合物代謝等途徑中發(fā)現(xiàn)了差異代謝物（圖5C、5D）。B171 和B254 葉片中共有的代謝途徑有5 條，分別參與丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、氨?；鵷RNA 生物合成、核酸代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、嘌呤代謝，尤其參與氨?；鵷RNA 生物合成和嘌呤代謝途徑。此外，B254 葉片還特有半胱氨酸和蛋氨酸代謝、乙醛酸和二羧酸代謝及鞘脂代謝3 個代謝途徑。B171 和B254 根系中共有的代謝途徑有9 條，主要參與氨基酸代謝（精氨酸、絲氨酸和蘇氨酸等）、氨?；鵷RNA 生物合成、嘌呤代謝和苯丙氨酸代謝途徑，且B254 根系還特有α-亞麻酸代謝、不飽和脂肪酸生物合成及黃醇代謝3 個途徑。值得注意的是，在低磷脅迫7 和14 天后B171 和B254 的葉片差異代謝物均參與嘌呤代謝途徑，而根系中主要參與苯丙氨酸代謝途徑。由此可見，磷耐受型谷子品種B254 和磷敏感品種B171 在磷脅迫下的代謝響應(yīng)差異顯著，這些差異不僅體現(xiàn)在代謝物的數(shù)量和種類上，還體現(xiàn)在其參與的代謝途徑上，這為理解和改良谷子的磷脅迫耐受性提供了重要線索。

2.5 低磷誘導(dǎo)谷子嘌呤和苯丙氨酸代謝通路的基因表達(dá)分析

為了進(jìn)一步探索低磷誘導(dǎo)差異代謝物參與嘌呤和苯丙氨酸代謝途徑的調(diào)控基因，本研究結(jié)合低磷敏感型材料和低磷敏感型谷子的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，系統(tǒng)分析了此代謝通路中代謝物及關(guān)鍵基因的表達(dá)變化。圖6 表明，相比正常磷條件下，Si1g32260 和Si2g36250 調(diào)控嘌呤核苷磷酸化酶（PNP） 合成在低磷脅迫2 h 表達(dá)量達(dá)到最高。腺嘌呤和鳥嘌呤在脫氨酶（ADE、GDA） 作用下轉(zhuǎn)化為黃嘌呤和次黃嘌呤，此過程調(diào)控脫氨酶基因中Si3g31280、Si7g19870 在低磷脅迫的12 h 表達(dá)量達(dá)到最高；黃嘌呤氧化酶進(jìn)一步氧化次黃嘌呤形成黃嘌呤，Si2g11260、Si2g11270、Si3g21240、Si9g52440 具有相同的功能，均屬于黃嘌呤氧化還原酶（XOR），在低磷脅迫的2 h 開始高表達(dá)，積極參與低磷響應(yīng)。在谷子根系低磷脅迫后，共有6 個谷子基因參與苯丙酮酸到苯丙氨酸的轉(zhuǎn)變。其中基因Si1g03380、Si8g15570、Si1g31420、Si5g33060 表達(dá)在低磷脅迫30 min 后顯著上調(diào)，Si7g19870 表達(dá)在低磷脅迫2 和12 h 后均顯著上調(diào)，生長素作為苯丙氨酸的下游合成物質(zhì)，苯丙氨酸的積累可能是通過促進(jìn)根系生長素的合成來幫助植物生長，從而抵御低磷脅迫。

3 討論

磷作為植物生長發(fā)育不可或缺的營養(yǎng)元素，在土壤中其有效性常受限于磷的固化作用，導(dǎo)致植物可吸收的有效磷含量有限，進(jìn)而嚴(yán)重影響植物的生長與發(fā)育。為了應(yīng)對磷饑餓，植物進(jìn)化出了一系列發(fā)育、生理和生化反應(yīng)機制，包括重塑根系的形態(tài)構(gòu)型促進(jìn)根系吸收更多的有效磷及體內(nèi)有機磷的高效利用[31]。其中，根系形態(tài)的重塑尤為關(guān)鍵，它不僅優(yōu)化了植物對土壤水分及礦質(zhì)養(yǎng)分的獲取能力，更在磷素匱乏時展現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢。在缺磷條件下，許多物種根系所占的總干物質(zhì)比例更大[32]。前期研究已比較了16 種作物的根系形態(tài)對磷獲取的策略，發(fā)現(xiàn)不同物種之間根系功能性狀存在顯著的種間差異。在玉米中，低磷條件下根長顯著增加，根平均直徑顯著降低，兩種玉米的總根長、根表面積、比根長和根平均直徑無顯著差異[33]。而在本研究中低磷脅迫能顯著抑制谷子幼苗的生長，但是兩種不同耐受型品種的根系形態(tài)變化存在差異。耐低磷種質(zhì)B254 在低磷脅迫下可通過顯著增加總根長、根表面積及分支數(shù)，進(jìn)而提升根冠比達(dá)10.7%，顯著優(yōu)于磷敏感品種B171 的負(fù)向變化（根冠比降低9.9%），從而減弱低磷脅迫對其生長的影響。植物可以通過增加根毛和側(cè)根的數(shù)量和長度，增加根冠比，產(chǎn)生分枝來擴大與土壤磷的接觸面積，從而增加植物對磷的吸收[34?35]。由此表明，在磷貧瘠土壤中，谷子耐低磷種質(zhì)在資源分配上的策略性調(diào)整，即將更多養(yǎng)分用于根系形態(tài)重塑，從而表現(xiàn)出更強的低磷適應(yīng)性。

酸性磷酸酶（ACP） 作為植物體內(nèi)關(guān)鍵的水解酶，在低磷條件下其活性顯著增強，通過催化有機磷化合物水解，為植物提供額外的磷源，從而增強了植物對低磷環(huán)境的適應(yīng)能力。缺磷誘導(dǎo)玉米葉片、根組織和根系分泌ACP 活性升高[36]。水稻OsACP1 可從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中的非必需磷酸酯中回收無機磷酸鹽Pi，以維持水稻Pi 穩(wěn)態(tài)，細(xì)胞內(nèi)磷酸酯類釋放的Pi 會緩解Pi 脅迫反應(yīng)[37]。本研究中，兩種不同基因型谷子的ACP 活性在低磷條件下均顯著增加，特別在耐低磷品種B254 葉片中增幅高達(dá)91.83%，進(jìn)一步印證了ACP 在磷高效利用中的重要性。此外，低磷條件下和正常磷條件下生長表型與生理表型之間相關(guān)性存在較大差異。例如，在正常磷條件下，株高與花青素含量及葉片和根系A(chǔ)CP 活性存在負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r 分別為0.73、0.54 和0.68，而在低磷條件下，株高、根系發(fā)育與生理適應(yīng)性狀之間存在明顯正相關(guān)，且相關(guān)系數(shù)均較高，其中株高與根干重、根分支數(shù)、根系A(chǔ)CP 活性的相關(guān)系數(shù)分別為0.91、0.85 和0.90。由此表明，在低磷條件下，谷子農(nóng)藝性狀與生理性狀間的聯(lián)系更加緊密，特別是低磷條件不僅促進(jìn)了根系重塑形態(tài)構(gòu)型，而且伴隨有花青素和ACP 活性的提升，反映了谷子在低磷條件下通過精細(xì)調(diào)控生長策略和生理機能，展現(xiàn)出一種高效、靈活的主動適應(yīng)機制。這一發(fā)現(xiàn)對于深入理解植物逆境生理、優(yōu)化農(nóng)業(yè)管理措施以及培育耐低磷作物品種具有重要的理論和實踐價值。

在植物應(yīng)對低磷脅迫的過程中，代謝適應(yīng)是至關(guān)重要的策略之一。這種適應(yīng)不僅涉及初級代謝途徑的調(diào)整，還深刻影響著次級代謝產(chǎn)物的生成。在低磷條件下，玉米根系的核酸、有機酸和糖的濃度顯著增加，但磷酸化代謝物、特異氨基酸、脂質(zhì)代謝物和含氮化合物的濃度降低[38]。低磷條件下，叢枝菌根植物通過調(diào)控碳水化合物和脂質(zhì)平衡增加庫強[39]。本研究聚焦不同耐低磷能力種質(zhì)間的代謝物差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)磷敏感與耐低磷種質(zhì)在代謝物種類上存在顯著差異。其中低磷敏感種質(zhì)的差異代謝物主要包括黃酮、酯類，而耐低磷種質(zhì)中差異代謝物主要是氨基酸、酯類。在耐低磷種質(zhì)B254 中，2 種溶血磷脂酸（LPA 18：1 和LPC 18：3） 以及1 種溶血磷脂膽堿顯著提高了1.6 倍。溶血磷脂酸是一種最小、結(jié)構(gòu)最簡單的植物磷脂，是真核細(xì)胞磷脂生物合成早期階段的關(guān)鍵前體，可結(jié)合生長素輸出載體蛋白PIN1，共同調(diào)控生長素轉(zhuǎn)運和植株生長的分子機制[40]。此外，我們還發(fā)現(xiàn)茉莉酸在種質(zhì)B254 葉片和根系中分別顯著增加1.2 和1.8 倍。進(jìn)一步通過KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)，低磷誘導(dǎo)的B171 和 B254 差異代謝物主要參與嘌呤和苯丙氨酸途徑。其中，嘌呤作為多種生物分子的前體，不僅參與核酸、蔗糖、多糖及磷脂的合成，還在植物抗逆性中扮演重要角色。例如大豆分泌的嘌呤類物質(zhì)招募有益微生物假單胞菌，從而增強鹽脅迫下植物的生長能力[41]。在低磷條件下，獨腳金內(nèi)酯（SLs） 作為植物反應(yīng)的調(diào)節(jié)器，也可促進(jìn)與植物磷限制反應(yīng)相關(guān)的代謝物水平，包括與羧酸、脂肪酸和嘌呤代謝有關(guān)的信號。另一方面，苯丙氨酸是木質(zhì)素、花青素、黃酮類化合物的重要前體物質(zhì)，可以通過調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的抗氧化酶活性和多酚物質(zhì)含量，從而提高植物的抗逆性[42]。在耐瘠薄野生大豆根系的研究中也證實了苯丙氨酸在逆境適應(yīng)中的積極作用，其在低磷條件下根系中顯著增加了1.76 倍[43]。此外，通過外源苯丙氨酸能促進(jìn)植物激素的生物合成，抑制潛在有害細(xì)菌類群，從而促進(jìn)了氮循環(huán)和植物生長[44]。這與本研究結(jié)果類似，在根系代謝通路中，耐低磷種質(zhì)B254 根系中主要參與了苯丙氨酸代謝途徑，可能通過促進(jìn)黃酮類化合物的轉(zhuǎn)化來增強抗氧化能力和抗逆性，從而幫助植物更好地應(yīng)對低磷環(huán)境。然而，關(guān)于谷子關(guān)鍵代謝物嘌呤和苯丙氨酸在耐低磷機制中的具體作用機制和相互作用關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

低磷脅迫誘導(dǎo)耐低磷谷子品種產(chǎn)生的差異代謝物主要出現(xiàn)在嘌呤代謝和苯丙氨酸代謝途徑，耐低磷品種磷脅迫下提高酸性磷酸酶活性，提升花青素含量，促進(jìn)了黃酮、氨基酸和脂類等代謝物的合成，尤其是對類磷脂合成前體如溶血磷脂酸的累積起到了極為關(guān)鍵的作用。