摘要：目的 分析慢性心力衰竭（CHF）合并高尿酸血癥（HUA）患者血清外泌體miRNA的差異表達，探討其作為CHF合并HUA新型診斷分子標志物的可能性，并對差異miRNA進行靶基因功能分析，分析作用靶點。方法 以2020年9月～2023年9月南京中醫(yī)藥大學附屬南京中醫(yī)院心血管病科收治的CHF合并HUA患者為觀察組（n=30），選擇同期健康志愿者為對照組（n=30）。兩組各選取6例樣本，采用高通量測序分析血清外泌體中的差異表達miRNA，采用RT-PCR檢測對未作高通量測序的觀察組和對照組樣本（n=24）進行驗證，使用R軟件進行GO、KEGG富集分析，預測差異表達miRNA的作用靶點，并通過動物實驗驗證臨床篩查的差異miRNA。結果 高通量測序分析顯示，觀察組患者共檢測到42 個差異表達的miRNA（18 個上調，24 個下調），其中miR-27a-5p上調（Plt;0.001），miR-139-3p下調（Plt;0.001）。RT-PCR檢測顯示，觀察組患者血清外泌體中miR-27a-5p 表達量上調（P=0.004）、miR-139-3p 表達量下調（P=0.005）；ROC曲線下面積（AUC）分析發(fā)現(xiàn)，miR-27a-5p、miR-139-3p 預測CHF 合并HUA 發(fā)病的AUC 分別是0.708（95% CI：0.562-0.855）和0.734（95% CI：0.593-0.876），兩者聯(lián)合預測CHF 與HUA 發(fā)病的AUC為0.899（95% CI：0.812-0.987）。對差異基因進行GO富集分析發(fā)現(xiàn)，細胞自噬是富集程度最高的靶點；KEGG功能注釋顯示，激活AMPK-mTOR信號通路可能是差異表達的miR-27a-5p 和miR-139-3p 作用靶點之一。進一步動物實驗得到了相同的驗證。結論 血清外泌體中miR-27a-5p 上調和miR-139-3p 下調可作為精準診斷CHF 合并HUA 的新型分子標志物，激活AMPK-mTOR信號通路后促進心肌細胞的自噬反應可能是差異表達的miR-27a-5p、miR-139-3p的作用靶點之一。

關鍵詞：慢性心力衰竭；高尿酸血癥；外泌體；微小RNA；AMPK；mTOR；自噬

高尿酸血癥（HUA）是嘌呤代謝紊亂導致血清尿酸生成過多或排泄障礙引起的一種代謝異常疾病，是慢性心力衰竭（CHF）的常見合并癥，與心衰不良預后密切相關［1-3］。診斷CHF 合并HUA主要依據(jù)臨床癥狀及血B型腦利鈉肽（BNP）、左室射血分數(shù)（LVEF）和血尿酸（SUA）等檢測指標的綜合診斷。但血BNP 容易受高齡、肥胖、腎功能、SUA等因素影響［4-6］。LVEF主要通過檢查心臟的血流動力學改變評估患者心功能和心室重構情況，CHF除了與血流動力學改變相關，還與神經(jīng)內分泌等機制有關，但心臟超聲卻無法反映這一病理改變，使得LVEF檢查結果具有不全面性［7］。SUA受遺傳、環(huán)境、飲食習慣、性別、年齡、藥物使用、腎功能等多因素影響［8］。因此單一的生物標志物可能不足以診斷CHF合并HUA這一共病狀態(tài)。

外泌體是細胞內多泡體分泌的一種納米級微囊泡，直徑30～140 nm，廣泛分布于各種細胞和體液中，比如血液、腦脊液、尿液和唾液等［9， 10］。外泌體可轉移源細胞的小分子遺傳物質和蛋白質，然后作用于靶細胞，是細胞間信息傳遞的工具，具有更高的穩(wěn)定性［11］。miRNA是一類長18～25 個核苷酸組成的小分子非編碼RNA，通過特異性結合靶基因mRNA轉錄本的3'非翻譯區(qū)，參與多種生物學過程，包括發(fā)育進程、器官形成、細胞增殖、代謝和凋亡等，從而實現(xiàn)對靶基因的表達發(fā)揮調控作用［12］。miRNA可作為一種新型的生物標志物應用于疾病的診斷和預后的早期判斷，以及提供新的治療靶點［13-16］。已有研究表明，外泌體miRNA的差異表達可作為預測CHF 或HUA 的診斷標記物［17， 18］，但目前尚無CHF合并HUA的共病患者外泌體中miRNA異常表達譜分析的相關研究報道。

本研究基于miRNA測序，對CHF合并HUA患者和健康志愿者血清外泌體miRNA表達譜進行分析，篩選差異表達miRNA，為確定CHF 合并HUA共病狀態(tài)的早期診斷新型分子標志物提供依據(jù)；通過GO 和KEGG富集分析，進一步預測差異表達miRNA的相關作用靶點，探討差異表達miRNA對CHF合并HUA發(fā)病的調控機制。

1 資料和方法

1.1 研究對象

選擇2020 年9 月～2023 年9 月就診于南京中醫(yī)藥大學附屬南京中醫(yī)院心血管病科的CHF合并HUA患者作為觀察組（n=30），隨機選擇在南京中醫(yī)藥大學附屬南京中醫(yī)院健康體檢中心參加體檢的健康志愿者作為對照組（n=30）。本研究方案通過南京中醫(yī)藥大學附屬南京中醫(yī)院倫理委員會批準（倫理批號：KY2020083），研究對象均簽署知情同意書。

1.2 診斷標準

CHF的診斷及心功能分級標準參照《中國心力衰竭診斷和治療指南2018》制定：高血壓性心臟病、冠心病、風心病、心肌??；NYHA心功能分級Ⅱ～Ⅳ級；LVEFlt;50%。

HUA的診斷標準參照《中國高尿酸血癥與痛風診療指南2019》制定：正常嘌呤飲食狀態(tài)下，非同日2次空腹SUAgt;420 μmol/L（成年人，不分性別）。

1.3 納入、排除標準

CHF合并HUA的納入標準：符合CHF及HUA的診斷標準；入組前2 周未使用任何中西醫(yī)降尿酸藥物；18周歲≤年齡lt;90周歲；自愿接受本次臨床研究，并簽署知情同意書。健康志愿者的納入標準：健康體檢者，18周歲≤年齡lt;90周歲。排除標準：自身免疫性疾病、各種急慢性感染及腫瘤患者；既往發(fā)生急、慢性痛風性關節(jié)炎者；嚴重肝功能不全、腎功能不全者；妊娠或哺乳期婦女；無法合作者，如精神病患者；拒絕簽署知情同意者。

1.4 主要儀器與試劑

高速冷凍離心機、高速離心機（賽默飛世爾科技有限公司），低速離心機（杭州奧盛儀器有限公司），渦旋混合器（太倉市華利達試驗設備有限公司），紫外分光光度計（simgen biotechlogy） ，AGENCOURT?AMPURE? XP Kit（Bechman Coulter），KAPA LibraryQuantification Kit Illumina? Platforms （KAPABiosystems），T100TM Thermal Cycler（PCR 儀）（Bio-RAD），Qubit? Fluorometers（Thermo Fisher Scientific），Qseq 100 DNA Analyzer（Bioptic），Light Cycler? 96（Roche）。

Small RNA Library Prep Kit（KAITAI-BIO），Reverse Transcriptase M-MLV（Takara），SYBR Green Ibased Real-time quantitative PCR試劑盒 （艾科瑞），10mmol/L dNTP、RNase-free Water （TIANGEN），RNaseInhibitor （Thermo Fisher Scientific） 。microRNAuniRev、hsa-miR-27a-5p RT、hsa-miR-27a-5p F、hsamiR-139-3p RT、hsa-miR-139-3p F、hsa-U6 snRNAFor、hsa-U6 snRNA Rev（捷瑞）。

1.5 方法

1.5.1 樣本采集與保存 研究對象均禁食10 h，于次日清晨采取外周靜脈血10 mL，室溫靜置10～60 min，4 ℃，以3000 r/min 離心10 min，移液槍吸取上清液1.5 mL到新的離心管中，以16 000×g離心10 min，移液槍吸取上清液到無RNA酶Eppendorf管中，-80 ℃低溫保存。

1.5.2 血清外泌體的提取 采用超高速離心法按以下步驟提取血清外泌體：取出-80 ℃保存的血清復溫后，在4 ℃條件下，以300×g 離心10 min，再以10 000×g 離心60 min。使用0.22 μm濾器過濾上清。過濾后使用天平稱質量法絕對配平后放入超高速離心機，在4 ℃條件下，以120 000×g離心2 h。然后在離心瓶中加入DPBS清洗超離獲得的外泌體液。再次給予120 000×g，4 ℃條件下離心2 h。小心去除上清，輕柔加入DPBS重懸外泌體沉淀塊，即為外泌體溶液。

1.5.3 血清外泌體RNA 的提取 血清外泌體中加入700 μL QLAzol Lysis，邊加邊吸打至樣本溶解，然后渦旋震蕩混勻。在室溫15～25 ℃放置5 min。加入140 μL氯仿（氯仿與QLAzol Lysis體積比=1∶5），渦旋混勻，室溫放置3 min。4 ℃條件下，12 000×g離心15 min。取上清至另一離心管（盡量吸取上清，不要中間的白膜層），加入1.5倍體積的無水乙醇，渦旋混勻，室溫15～25 ℃放置10 min。取700 μL混合液于RNeasyMini colution 中，≥8000×g，室溫離心15 s，若混合液較多，重復此步驟。去掉下游液體，加入700 μL RWT到柱子上，≥8000×g，室溫離心15 s。去掉下游液體，加入500 μL RPE到柱子上，≥8000×g，室溫離心15 s。去掉下游液體，加入500 μLRPE到柱子上，≥8000×g，室溫離心15 s?！?000×g，室溫空離2 min，將吸附柱置于一個新的RNase-Freedd離心管中于室溫放置5 min，晾干吸附材料中殘余的漂洗液。往離心管中央加入30 μL RNase-FreeddH2O，室溫放置2 min，13 400×g 離心3 min 得到血清外泌體RNA溶液。

1.5.4 血清外泌體miRNA高通量芯片檢測

1.5.4.1 外泌體RNA的提取 根據(jù)基因測序實驗設計要求每組樣本≥3 的原則及本研究納入的總樣本量，隨機選取6例CHF合并HUA患者和6例健康體檢者作先期血清外泌體miRNA高通量測序。

1.5.4.2 外泌體miRNA高通量測序及數(shù)據(jù)質控 提取miRNA后，對其進行質量檢測。使用Qubit2.0 進行初步定量，使用Agilent 2100對其片段長度進行檢測。采用Q-PCR方法對檢測的miRNA有效濃度進行準確定量（有效濃度為gt;2 nmol/L）。按照目標下機數(shù)據(jù)量進行pooling，用NovaSeq 6000平臺進行測序。

1.5.5 篩選出可能作為CHF 合并HUA的血清外泌體miRNA標志物 經(jīng)過高通量測序，檢測6 例CHF 合并HUA患者及6例健康志愿者血清外泌體中存在的差異表達miRNA，使用R軟件包DESeq 2對數(shù)據(jù)集進行差異分析，按照|log FC|gt;1.5且Plt;0.05的標準篩選差異表達的miRNA，在得到的顯著差異表達的miRNA基因譜中選取一個顯著上調和一個顯著下調的miRNA，作為CHF合并HUA患者顯著差異表達的血清外泌體miRNA標志物。

1.5.6 RT-PCR驗證篩選出的差異miRNA 篩選出CHF合并HUA患者差異表達的血清外泌體miRNA標志物后，對其余CHF合并HUA患者和健康體檢者的血清樣本采用RT-PCR的方法進行驗證。按照1.5.2和1.5.3的試驗步驟，提取血清外泌體miRNA，參照microRNAuniRev試劑盒使用說明制取混合液，混合均勻后瞬時離心，在ABI 核酸擴增儀中42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min 得到RT反應液。按照microRNA uniRev試劑盒步驟，分別加入目標miRNA引物（表1），在ABI PCR儀中95 ℃30 s進行預變性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s進行40個循環(huán)完成變性和退火，循環(huán)結束后立即進行融解曲線分析。各樣品設置3 個復孔，采用2-ΔΔct法計算miR-27a-5p 和miR-139-3p的相對表達水平。以U6作為內參，對未作高通量測試的24例CHF合并HUA患者及24例健康志愿者血清外泌體中目標 miRNA采用RT-PCR檢測方法驗證。

1.5.7 靶基因的篩選 基于已知和新預測的miRNA，根據(jù)其種子區(qū)（動物）或完整序列（植物）與靶基因3' UTR區(qū)的互補關系，結合自由能情況預測該miRNA的靶基因。為進一步提高預測結果的準確性，本報告使用miRanda（http：//www.microrna.org/microrna/home.do）和RNAhybridl兩個軟件預測差異表達miRNA靶基因，并且對兩個結果取交集，得到最終miRNA靶基因。

1.5.8 差異miRNA 靶基因預測和功能分析 使用miRanda和RNAhybridl軟件預測miRNA的靶基因，并且對兩個結果取交集，得到最終miRNA靶基因。

使用R包clusterprofiler 對得到的靶基因進行GO和KEGG富集分析，設置篩選閾值Plt;0.05。通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)與差異表達miRNA的靶基因顯著相關分子功能、生物過程和細胞組分。通過KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)與差異表達的miRNA靶基因富集的分子信號通路。

1.6 動物實驗驗證臨床篩查的差異miRNA

采用腹腔注射阿霉素（2.5 mg/kg）1次/周、連續(xù)6周的方法制備CHF大鼠模型。給予CHF模型大鼠灌胃乙胺丁醇（250 mg/kg）聯(lián)合皮下注射氧嗪酸鉀（200 mg/kg）1次/d、連續(xù)6周，制備CHF合并HUA模型大鼠，觀察臨床協(xié)定方化濕降濁方對CHF 合并HUA 模型大鼠血miR-27a-5p 和miR-139-3p 的影響，進一步觀察調控miR-27a-5p 與miR-139-3p 對模型大鼠心肌細胞自噬反應和AMPK-mTOR信號通路的影響。

50只SD雄性大鼠，隨機選取8只作為空白對照組（Control），其余42只大鼠進行CHF合并HUA造模，在CHF造模過程中先后死亡6只，36只大鼠成功制備CHF合并HUA病理模型，隨機分為3組：模型組（Model）、化濕降濁方組（HSJZF）和化濕降濁方+AMPK 激動劑Acadesine組（HSJZF+A），12只/組。HSJZF組給予化濕降濁方（10 g·kg-1·d-1）混懸液灌胃；HSJZF+A組給予化濕降濁方（10 g·kg-1·d-1）混懸液灌胃的基礎上肌肉注射Acadesine（50 mg·kg-1·d-1）；Control 與Model 組灌胃等量蒸餾水，體積為10 mL/kg。末次給藥1 h后行心臟彩超檢查測定各實驗大鼠的左心室射血分數(shù)（LVEF），然后麻醉處死，用ELISA 法測定其SUA、血腦利鈉肽（BNP），RT-PCR 法測定血miR-27a-5p 和miR-139-3p的相對表達量；取大鼠心肌組織，采用Western blotting法檢測AMPK-mTOR蛋白表達情況。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)組間比較采用獨立樣本t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，不符合正態(tài)分布則采用Mann-Whitney U 檢驗，使用ROC曲線下面積（AUC）來描述差異目標miRNA的檢測效能，計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用卡方檢驗，Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 臨床資料比較

觀察組患者中合并高血壓11例、冠心病5例、房顫5例；對照組經(jīng)詢問病史排除心血管疾病。兩組性別、年齡、肝功能、總膽固醇的差異均無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05），觀察組的SUA、SCr、BUN水平高于對照組（Plt;0.001），LVEF低于對照組（Plt;0.001，表2）。

2.2 高通量測序篩查CHF合并HUA患者血清外泌體差異表達的miRNA

篩選出差異表達miRNA共42個，其中18個上調，24 個下調。miR-27a-5p 上調最為顯著，miR-139-3p 下調最為顯著（圖1，表3、4）。因此，選擇miR-27a-5p 和miR-139-3p 作為CHF合并HUA患者顯著差異表達的目標miRNA，并進行RT-PCR驗證。

2.3 RT-PCR法檢測驗證目標miRNA

與對照組比較，CHF合并HUA患者血清外泌體中miR-27a-5p表達量升高（P=0.004）、miR-139-3p表達量下降（P=0.005，圖2）。

2.4 靶基因篩選結果

結果顯示，miRanda 和RNAhybridl 預測miR-27a-5p的靶基因分別有6537和1337個，交集靶基因有396個（圖3A，表5）。使用miRanda和RNAhybridl預測miR-139-3p的靶基因分別有8753和2503個，交集靶基因有585 個（圖3B，表5）。分別取交集靶基因用于后續(xù)GO和KEGG富集分析。

2.5 miR-27a-5p、miR-139-3p 預測CHF 合并HUA 的ROC曲線分析

ROC曲線結果顯示，miR-27a-5p和miR-139-3p預測的AUC分別為0.708（95% CI：0.562-0.855）和0.734（95% CI：0.593-0.876），兩者聯(lián)合預測CHF 合并HUA的AUC為0.899（95% CI：0.812-0.987）（表6，圖4）。

2.6 GO和KEGG富集分析

對差異基因進行GO富集分析，共富集了8353 條GO條目。根據(jù)P值由小到大的順序篩選出前40 位的GO條目，包括：生物學過程（BP），細胞組成（CC）和分子功能（MF）。主要BP有：自噬、參與自噬的過程、GTP酶活性的調節(jié)、蛋白信號傳導等。主要CC有：神經(jīng)元胞體、細胞前緣、突觸膜、軸突等；主要MF包括：絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、微小GTP酶結合、金屬離子跨膜轉運活性、GTP酶結合、GTP酶活性調節(jié)等。通過富集分析氣泡圖，發(fā)現(xiàn)細胞自噬是富集程度最高的靶點（圖5A）。

對CHF 合并HUA 患者差異表達miR-27a-5p 與miR-139-3p 基因進行KEGG通路分析，結果顯示分別有多條通路參與CHF合并HUA的病理機制：如磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（AKT）信號通路、自噬信號通路、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、醛固酮合成和分泌等。其中AMPK-mTOR跟PI3K-Akt 信號通路是差異基因表達GO功能注釋得出的自噬高度相關的通路（圖5B）。

2.7 大鼠血miR-27a-5p和miR-139-3p相對表達量比較

與Control組比較，Model組大鼠血miR-27a-5p 表達量升高（Plt;0.01），血miR-139-3p表達量降低（Plt;0.01）。與Model 組比較，HSJZF 組可以下調miR-27a-5p 的表達（Plt;0.01），升高miR-139-3p 的表達（Plt;0.05）。與HSJZF 組相比，加用AMPK激動劑后，HSJZF+A組大鼠血miR-27a-5p 表達量上調（Plt;0.01），血miR-139-3p表達量下調（Plt;0.05，圖6）。

2.8 大鼠心肌組織中AMPK-mTOR蛋白水平比較

與Control 組比較，Model 組大鼠心肌組織中p-AMPK蛋白表達增加、p-mTOR蛋白表達降低（Plt;0.01）；與Model 組相比，HSJZF 可以降低p-AMPK 和升高p-mTOR蛋白的表達（Plt;0.01）；與HSJZF組比較，加用AMPK激動劑后，HSJZF+A組p-AMPK蛋白表達水平增加，但p-mTOR蛋白表達水平下降（Plt;0.05，圖7）。

3 討論

CHF 與HUA共病是心衰患者最常見的臨床狀態(tài)之一，探索特異性、敏感性高的新型分子標志物對于CHF 合并HUA精準診斷和靶向治療具有重要意義。miRNA為生理和病理過程中細胞間通訊和信號傳導介質的調節(jié)因子，差異表達的miRNA具有編碼成纖維細胞和促進血管新生的作用，與心力衰竭和左室肥大相關［21-23］。研究發(fā)現(xiàn)心室重構模型小鼠外泌體中miRNA-27a-5p 呈高表達［19］、梗死心肌中miR-139-3p 呈低表達［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，CHF與HUA共病患者血清外泌體中存在差異表達的miRNA共42個，其中18個上調，24個下調，miR-27a-5p呈上調表達，miR-139-3p呈下調表達，與上述文獻報道結果相似。聯(lián)合檢測血清外泌體miR-27a-5p和miR-139-3p的表達水平對進一步研究精準診斷CHF合并HUA可能的新型分子標記物具有重要價值。

一種miRNA可作用于多個不同的靶基因，而每種靶基因亦可被多個不同的miRNA調控。差異表達的miRNA具有調控心肌細胞凋亡和自噬影響CHF 患者預后的作用［24］。自噬是一種高度保守的溶酶體相關降解過程，主要負責大分子蛋白聚集體和受損細胞器的降解，廣泛參與包括心血管疾病在內的病理生理過程［25］。衰竭的心臟組織中，受損的線粒體產(chǎn)生活性氧，進一步激活自噬，過度自噬是加重CHF的重要因素［26， 27］。本研究GO 富集分析發(fā)現(xiàn)，差異表達miRNA 的靶基因可能與調控自噬的發(fā)生相關。因此推斷差異表達的miR-27a-5p 和miR-139-3p 通過激活自噬參與CHF 合并HUA的進程。

SUA異?？梢酝ㄟ^誘導內皮損傷、炎癥反應和氧化應激，激活自噬，導致血管和心肌的損傷［28-30］。PI3KAkt、磷酸酯酶與張力蛋白同源物（PTEN）誘導假定激酶1-帕金森病蛋白（PINK1-Parkin）、AMPK-mTOR和p38MAPK等通路是調節(jié)自噬的主要信號通路［25， 31-33］。但CHF合并HUA共病狀態(tài)下自噬被激活的信號通路仍不清楚，探究其分子遺傳發(fā)病機制已成為當前研究的熱點。本研究KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，差異表達miR- 27a-5p 和miR-139-3p 的靶基因涉及與自噬相關的PI3KAkt與AMPK-mTOR信號通路。高尿酸會激活PI3KAkt信號通路，故抑制PI3K-Akt信號通路可能是降尿酸藥物發(fā)揮作用的機制之一［34］。而抑制PI3K-Akt信號通路可導致心肌細胞的過度自噬，激活PI3K-Akt信號通路，則可以影響心肌細胞的過度自噬，從而發(fā)揮保護心肌細胞的作用［35］。兩者之間存在明顯矛盾，提示PI3KAkt信號通路可能還通過除自噬之外的其它機制參與了CHF 合并HUA 的發(fā)病［29］。高濃度的尿酸可激活AMPK-mTOR 信號通路從而促進細胞自噬。而AMPK-mTOR信號通路的激活又具有促進心肌細胞自噬的作用，抑制AMPK-mTOR信號通路可顯著降低心肌細胞的自噬程度，具有保護心肌細胞的作用［36］。進一步提示差異表達外泌體miR-27a-5p 和miR-139-3p 通過激活AMPK-mTOR信號通路誘發(fā)自噬調控CHF 合并HUA的發(fā)生、發(fā)展。

對于篩選出的差異miRNA及預測的信號通路，本研究通過制備CHF合并HUA復合病理模型，并采用化濕降濁方進行動物實驗驗證干預，結果發(fā)現(xiàn)CHF合并HUA模型大鼠血miR-27a-5p呈高表達、miR-139-3p呈低表達，并通過激活AMPK-mTOR信號通路，加重CHF合并HUA模型大鼠心肌損傷。這與臨床研究結果相同，進一步驗證了高表達的miR-27a-5p 及低表達的miR-139-3p 與CHF合并HUA的發(fā)病相關?；瘽窠禎岱礁深A后具有通過調控miR-27a-5p 和miR-139-3p 的表達，抑制AMPK-mTOR信號通路的激活，發(fā)揮對CHF合并HUA模型大鼠心肌的保護作用。加用AMPK激動劑后可以部分逆轉化濕降濁方的干預作用，進一步驗證臨床篩查的差異miRNA對自噬相關AMPK-mTOR信號通路的影響。

綜上所述，血清外泌體中差異表達的miR-27a-5p聯(lián)合miR-139-3p可作為早期診斷CHF與HUA共病的新型分子標志物，激活AMPK-mTOR信號通路、導致心肌細胞自噬可能是差異表達miRNA的調控機制之一。本研究為探索精準診斷CHF與HUA共病、尋找靶向干預藥物提供了新的研究思路，具有較好的臨床應用前景及科研意義。

本研究仍存在一些局限性。首先，由于本研究是來自單一中心的小樣本臨床研究，研究結果可能存在一定的偏倚和局限性。第二，本研究僅限于中國漢族人群，因此研究結果應謹慎推廣到其他種族群體。未來可通過多中心、大樣本的臨床研究和動物實驗進一步驗證本文研究結果。

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（編輯：林 萍）