摘要：目的 在低氧微環(huán)境下，以BNIP3-PI3K/Akt信號(hào)通路為核心，研究補(bǔ)陽還五湯參與FLS-RA線粒體自噬的調(diào)控機(jī)制。方法 將成纖維樣滑膜細(xì)胞（FLS）體外培養(yǎng)，分為正常對(duì)照組（FLS-RA正常培養(yǎng)）、模型對(duì)照組（IL-1β誘導(dǎo)）、補(bǔ)陽還五湯含藥血清低、中、高干預(yù)組（IL-1β 誘導(dǎo)+濃度分別為5%、10%、20%含藥血清），除正常對(duì)照組外，其余組細(xì)胞按照10% O2濃度低氧處理。AnnexinV-APC/7-AAD雙染測(cè)定細(xì)胞凋亡和T-AOC試劑盒檢測(cè)細(xì)胞總抗氧化能力。探針分子測(cè)定細(xì)胞ROS，ATP試劑盒測(cè)定細(xì)胞ATP水平、線粒體膜電位（Δψm）、細(xì)胞Ca2+平衡穩(wěn)態(tài)的變化。Western blotting法檢測(cè)BNIP3、PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平，RT-qPCR法檢測(cè)BNIP3、PI3K、AKT及自噬相關(guān)因子LC3、Beclin-1、P62 mRNA 的表達(dá)。結(jié)果 補(bǔ)陽還五湯組能夠降低細(xì)胞的凋亡百分比（Plt;0.05），且呈濃度依賴性。補(bǔ)陽還五湯組總抗氧化力降低，T-AOC濃度（U/mL）降低，ROS產(chǎn)生增加。觀察到自噬小體的形成，ATP 酶水平釋放量增加（Plt;0.05）；線粒體膜電位、Ca2+水平均呈下降趨勢(shì)。補(bǔ)陽還五湯組BNIP3 蛋白表達(dá)升高，PI3K、AKT表達(dá)降低；與模型組相比，補(bǔ)陽還五湯組BNIP3、P62、mRNA表達(dá)升高（Plt;0.05）；PI3K、AKT、LC3、Beclin-1、mRNA表達(dá)降低，Beclin-1的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）；LC3的表達(dá)僅在中藥小劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。結(jié)論 在低氧環(huán)境下，補(bǔ)陽還五湯可能通過抑制BNIP3介導(dǎo)的PI3K/AKT通路，從而抑制了自噬因子的表達(dá)。

關(guān)鍵詞：低氧；補(bǔ)陽還五湯；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；滑膜成纖維細(xì)胞；BNIP3-PI3K/Akt；線粒體自噬

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種病因不明且致殘率較高的自身免疫性疑難疾病，以關(guān)節(jié)滑膜組織內(nèi)反復(fù)發(fā)作的慢性炎癥為主要病理特征［1］。成纖維樣滑膜細(xì)胞（FLS）是RA病程中的主要效應(yīng)細(xì)胞之一，其自噬/凋亡的平衡失調(diào)在關(guān)節(jié)破壞和慢性持續(xù)性炎癥中起關(guān)鍵性作用［2］。

RA受累關(guān)節(jié)存在缺氧微環(huán)境［3］。RA關(guān)節(jié)滑膜組織增生不僅加劇關(guān)節(jié)腔低氧并釋放大量炎性因子，加重氧化應(yīng)激狀態(tài)，氧化應(yīng)激狀態(tài)又促使炎性因子如α腫瘤壞死因子（TNF-α）、介素-1（IL-1）、IL-6、IL-12 和IL-15 釋放增多，加劇軟骨破壞，形成惡性循環(huán)，造成RA疾病進(jìn)程加快［4］。自噬是一種重要的機(jī)體適應(yīng)性反應(yīng)，在機(jī)體應(yīng)對(duì)應(yīng)激環(huán)境時(shí)行使重要的促存活作用。而線粒體作為低氧反應(yīng)最為敏感的細(xì)胞器，其自噬調(diào)節(jié)機(jī)制備受關(guān)注。BNIP3 是一種線粒體自噬的誘導(dǎo)因子，受低氧調(diào)控。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞可能通過激活PI3K與Akt組成的PI3K/Akt通路引起細(xì)胞的自噬［5］，然而，缺氧微環(huán)境對(duì)滑膜成纖維細(xì)胞線粒體自噬的影響與機(jī)制，尚未有更深入的報(bào)道，探索其調(diào)控機(jī)制，有助于尋找到干預(yù)RA骨破壞的作用靶點(diǎn)。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)“尪痹”范疇，“氣虛血瘀、絡(luò)脈痹阻”為RA主要病機(jī)。補(bǔ)陽還五湯具有具有益氣活血、通經(jīng)活絡(luò)的作用，是《醫(yī)林改錯(cuò)》中所載的經(jīng)典方劑，在臨床中廣泛應(yīng)用。筆者前期多次用此方加減治療RA氣虛血瘀證型的患者，效果明顯。這與由清代葉天士提出的“初為氣結(jié)在經(jīng)，久則血傷入絡(luò)”病機(jī)概念相符合。

本研究以低氧微環(huán)境下的氧化應(yīng)激引起的線粒體自噬為出發(fā)點(diǎn)，基于BNIP3介導(dǎo)的PI3K/Akt信號(hào)通路作為切入點(diǎn)，從細(xì)胞層面，研究補(bǔ)陽還五湯對(duì)RA滑膜成纖維細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制，為中醫(yī)傳統(tǒng)經(jīng)方的研究提供思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雌性Wistar 大鼠48 只、體質(zhì)量200～250 g。通過河南省中醫(yī)院倫理委員會(huì)審查并批準(zhǔn)（倫理批號(hào)SL-HNSZYY-2020-35）。所有動(dòng)物均飼養(yǎng)于溫度22±2 ℃、相對(duì)濕度（50±10）%環(huán)境，每天光照時(shí)間12 h，自由進(jìn)食及飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 儀器 超凈工作臺(tái)（SW-CJ-1FD）；CO2 恒溫培養(yǎng)箱（SANYO）；低速離心機(jī)（Eppendorf）；流式細(xì)胞儀（BECKMAN）；自動(dòng)生化分析儀（深圳雷杜生命科技）；透射電子顯微鏡（hitachi）；PCR儀（東勝創(chuàng)新生物科技有限公司）；水平電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備公司）；水平搖床（江蘇海門其林貝爾儀器制造公司）；激光共聚焦顯微鏡（OLYMPUS）；酶標(biāo)儀（Thermo）；電轉(zhuǎn)儀（北京六一儀器廠）；垂直電泳槽（北京六一儀器廠）。

1.2.2 試劑 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（Elabscience）；DMEM、 青霉素-鏈霉素混合液rypsin-EDTA（0.25%）（Procell）；胎牛血清（Excell Bio）；總抗氧化能力試劑盒、ATP含量試劑盒（南京建成生物工程所）；活性氧（ROS）檢測(cè)試劑盒、線粒體膜電位熒光探針JC-1檢測(cè)試劑盒、Fluo-3 AM、RIPA 裂解液、磷酸酶抑制劑（碧云天）；電鏡固定液（Servicebio）；蛋白marker（10 000～250 000，海利克思）；PVDF 膜（0.45 μm， Millipore）；兔單抗BNIP3、兔單抗PI3K、兔單抗AKT（Abclonal）；HRP 標(biāo)記羊抗兔二抗（武漢博士德生物工程有限公司）；HiScriptIIQ RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）、HiScript IIQ Select RT SuperMix for qPCR（ +gDNA wiper）（VAZYME）。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥品

補(bǔ)陽還五湯加減（《醫(yī)林改錯(cuò)》）：黃芪30 g，川芎6 g，當(dāng)歸6 g，赤芍6 g，地龍3 g，桃仁3 g，紅花3 g。IL-1β溶液配成終濃度為100 μg/L。

1.4 補(bǔ)陽還五湯含藥血清的制備

將大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組和補(bǔ)陽還五湯治療組，20只/組，對(duì)照組給予蒸餾水灌服，治療組用量依據(jù)動(dòng)物等效劑量比值計(jì)算，補(bǔ)陽還五湯組給藥劑量為5.13 g/kg，每次灌胃1 mL，2次/d，連續(xù)灌胃1周。然后用1%戊巴比妥鈉按照30 mg/kg 標(biāo)準(zhǔn)麻醉，無菌條件下由腹主動(dòng)脈取血，靜置1 h后3000 r/min，離心15 min取上清，將同組血清混合，56 ℃水浴滅活30 min，0.22 μm濾器過濾除菌，分裝置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)、低氧處理及細(xì)胞分組

本實(shí)驗(yàn)所用人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞（FLS-RA）購于廣州吉妮歐生物科技有限公司。為保證細(xì)胞有良好狀態(tài)，本實(shí)驗(yàn)選用細(xì)胞第4代到第8代。

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，按每孔5×105均勻接種到6孔板中，37 ℃、5%CO2飽和濕度條件培養(yǎng)過夜；除正常組細(xì)胞外，其他組細(xì)胞均放入三氣培養(yǎng)箱10%O2低氧處理24 h，待細(xì)胞完全貼壁后進(jìn)行加藥處理。

正常細(xì)胞對(duì)照組、模型組：加入10 ng/mL的IL-1β誘導(dǎo)1 mL。五陽還五湯低、中、高劑量組：在模型組基礎(chǔ)上分別加入5%、10%、20%補(bǔ)陽還五湯含藥血清1 mL。24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 雙染測(cè)定細(xì)胞凋亡

細(xì)胞復(fù)蘇和傳代采用常規(guī)流程，細(xì)胞處理如前所述。AnnexinV-APC/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞陽性染色數(shù)目。

1.7 細(xì)胞總抗氧化能力檢測(cè)

按總抗氧化能力試劑盒（T-AOC）說明書測(cè)定總抗氧化能力，標(biāo)本混勻，防止10 min，波長(zhǎng)520 nm，1 cm光徑，雙蒸水調(diào)零，測(cè)定各管吸光度值?？偪寡跄芰Γ?測(cè)定管吸光度值（ODU）-對(duì)照管吸光度值（ODC）/0.01/30×反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)/待測(cè)樣品蛋白濃度。

1.8 ROS檢測(cè)

各組細(xì)胞用胰酶消化并收集，PBS潤(rùn)洗細(xì)胞2 次，棄上清；使用含染料DCFH-DA的細(xì)胞ROS 檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)；流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.9 透射電鏡觀察線粒體自噬小體

將細(xì)胞置于60 mm 培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，分組24 h 后分別轉(zhuǎn)至相應(yīng)氧濃度培養(yǎng)箱中孵育，孵育24 h 后胰酶消化，PBS 漂洗，離心收集細(xì)胞沉淀固定等。采用透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞及線粒體超微結(jié)構(gòu)。

1.10 細(xì)胞ATP水平的檢測(cè)

將FLS細(xì)胞胰酶消化，低速離心，重懸后，按照實(shí)驗(yàn)要求接種于6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至60%時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在不透光的96孔板中進(jìn)行ATP檢測(cè)，然后加入待測(cè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行反應(yīng)。用化學(xué)發(fā)光儀luminometer測(cè)定相對(duì)發(fā)光單位RLU值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度和RLU值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣本ATP值。

1.11 檢測(cè)線粒體膜電位（Δψm）的變化

按照比例稀釋JC-1，即每50 μL JC-1（×200）加入8 mL超純水的。充分溶解并混勻后再加入2 mL JC-1染色緩沖液（×5），再次混勻后即為JC-1 染色工作液。隨后按照說明書依次染色、洗滌、上機(jī)檢測(cè)。

1.12 檢測(cè)細(xì)胞 Ca2+平衡穩(wěn)態(tài)的變化

將Ca2+釋放觸發(fā)劑由100 μmol/L ATP，140 mmol/LNacl，50 mmol/LKcl，1 mmol/LMgcl2等組成，實(shí)時(shí)的熒光變化通過激光共聚焦顯微鏡的488 nm和515 nm的波長(zhǎng)檢測(cè)得到，代表細(xì)胞內(nèi)Ca2+的釋放、吸收幅度。

1.13 細(xì)胞自噬水平的檢測(cè)

Western blotting 法檢測(cè)Bnip3、PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平?；玖鞒虨椋簶颖局苽?、上樣、切膠、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗、孵育二抗、曝光。一抗GAPDH、BNIP3、AKT、PI3K，稀釋比例均為1∶1000； HRP 標(biāo)記二抗-1∶10 000稀釋。

1.14 RT-qPCR 法檢測(cè)細(xì)胞PI3K、AKT及自噬相關(guān)因子LC3-Ⅱ、Beclin-1、P62的mRNA 相對(duì)表達(dá)量

低氧濃度下的成纖維樣滑膜細(xì)胞根據(jù)相關(guān)分組干預(yù)后，按照 Trizol 試劑說明書，用一步法提取組織總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的要求配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA后配置realtime PCR反應(yīng)混合液，依相應(yīng)條件擴(kuò)增，根據(jù)參考文獻(xiàn)合成引物（北京擎科生物科技有限公司，表1），進(jìn)行 RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)。

1.15 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，結(jié)合PostHoc Multiple Comparison 的LSD檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0 以及R 語言軟件分析，以Plt;0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組FLS細(xì)胞凋亡情況

與空白對(duì)照組相比，加入10 ng/ml IL-1β誘導(dǎo)劑后FLS 細(xì)胞凋亡率增加（Plt;0.05）；與誘導(dǎo)組比較，不同濃度的補(bǔ)陽還五湯含藥血清均能夠降低HFLS-RA細(xì)胞的凋亡百分比（Plt;0.05），且呈濃度依賴性（表2，圖1）。

2.2 各組FLS細(xì)胞總抗氧化能力表達(dá)

模型組和正常細(xì)胞對(duì)照組比較，ROS 濃度明顯上升（Plt;0.05）。給藥期間補(bǔ)陽還五湯大、中、小劑量組總抗氧化力較對(duì)照組比較有所降低，T-AOC 濃度（U/mL）降低，ROS 產(chǎn)生增加（Plt;0.05）。與模型組對(duì)比，給藥小劑量組在總抗氧化力方面二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05），給藥中、高劑量組在總抗氧化力以及ROS 的產(chǎn)生與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05，圖2、3）。

2.3 透射電子顯微鏡觀察自噬小體的發(fā)生以及線粒體自噬變化

透射電子顯微鏡結(jié)果提示，與正常細(xì)胞對(duì)照組相比，模型誘導(dǎo)組有較多自噬發(fā)生，可以觀察到更多的自噬小體和自噬溶酶體（圖4）。

ATP 酶水平釋放量均處于增加狀態(tài)，給藥組與模型組對(duì)比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；線粒體膜電位水平呈下降趨勢(shì)，各給藥劑量組與模型組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；細(xì)胞Ca2+平衡穩(wěn)態(tài)方面，胞內(nèi)鈣離子濃度整體呈下降趨勢(shì)，但給藥小劑量組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05，表3）。

2.4 Western blotting 法檢測(cè)BNIP3、PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平

與模型組相比，補(bǔ)陽還五湯組 BNIP3 蛋白表達(dá)均升高（Plt;0.05），但與空白對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。與模型組相比，補(bǔ)陽還五湯組PI3K、AKT蛋白表達(dá)均呈降低趨勢(shì)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05，表4）。

2.5 q-PCR 檢測(cè)補(bǔ)陽還五湯對(duì)BNIP3、PI3K、AKT、以及自噬相關(guān)因子LC3、Beclin-1、P62 mRNA表達(dá)的影響

與模型組相比，補(bǔ)陽還五湯組BNIP3、P62、mRNA表達(dá)均升高（Plt;0.05）；補(bǔ)陽還五湯組PI3K、AKT、LC3、Beclin-1、mRNA表達(dá)均降低，但是Beclin-1 的表達(dá)在補(bǔ)陽還五湯低、中、高劑量組中差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）；LC3 的表達(dá)僅在中藥小劑量組時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05，表5，圖5）。

3 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與遺傳、免疫系統(tǒng)紊亂、感染、環(huán)境刺激等多種因素有關(guān)，發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明［6］。目前尚無特異性治療方式，如何更好地預(yù)防和控制疾病的發(fā)展是亟待解決的難題。線粒體自噬與關(guān)節(jié)炎癥之間的研究日益增多，但在缺氧微環(huán)境下，二者之間究竟如何影響尚在探究中。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，益氣養(yǎng)血中藥補(bǔ)陽還五湯能降低氧化應(yīng)激狀態(tài)，增強(qiáng)總體抗氧化能力，降低ROS的產(chǎn)生，延緩了線粒體自噬現(xiàn)象的發(fā)生?？赡苁峭ㄟ^抑制BNIP3介導(dǎo)的PI3K/AKT通路，從而抑制了自噬因子的表達(dá)。

RA受累關(guān)節(jié)存在缺氧微環(huán)境［7］。正常生理狀態(tài)下，機(jī)體氧化-抗氧化作用在一定范圍內(nèi)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)遭受低氧刺激時(shí)，氧化系統(tǒng)失衡，細(xì)胞線粒體電子傳遞鏈中作為電子最終受體的氧分子供應(yīng)不足，導(dǎo)致產(chǎn)生大量的ROS蓄積過多，從而對(duì)細(xì)胞中大分子和細(xì)胞器造成損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂或死亡［8］。目前，活性氧的含量評(píng)估是氧化應(yīng)激狀態(tài)的重要衡量指標(biāo)［9］。本研究中，在低氧影響下，模型誘導(dǎo)組、誘導(dǎo)+給藥組（補(bǔ)陽還五湯大、中、小劑量）的總抗氧化力相對(duì)正常組，均呈降低狀態(tài)，T-AOC濃度降低，ROS 產(chǎn)生增加，而通過細(xì)胞凋亡率的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯組能夠降低HFLSRA細(xì)胞的凋亡百分比（Plt;0.05），且呈濃度依賴性。說明益氣養(yǎng)血方補(bǔ)陽還五湯的干預(yù)能夠?qū)筊OS蓄積引起的細(xì)胞損傷或死亡。

90%的ROS產(chǎn)生于線粒體。其損傷主要存在于3個(gè)方面：氧化損傷，鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)以及ATP合成［ 10］。ROS蓄積可損傷細(xì)胞內(nèi)的大分子物質(zhì)，線粒體呼吸鏈的損傷會(huì)導(dǎo)致ATP合成的破壞。由于鈣離子的轉(zhuǎn)運(yùn)是耗能的過程，所以缺乏ATP供應(yīng)會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)鈣離子濃度增加，使得鈣離子穩(wěn)態(tài)失調(diào)［11］。三者共同作用會(huì)誘導(dǎo)線粒體通透性（mPTP）改變，產(chǎn)生膜電位降低，造成線粒體結(jié)構(gòu)的改變，諸如腫脹、甚至外膜破裂［12］，同時(shí)線粒體向胞質(zhì)內(nèi)釋放細(xì)胞色素c，然后激活凋亡誘導(dǎo)因子，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［13］。因此，本研究從以上3個(gè)方面觀察了線粒體自噬的變化，不僅在透射電鏡下能觀察到自噬小體的形成，同時(shí)檢測(cè)到ATP酶水平釋放量發(fā)生變化，線粒體膜電位水平和胞內(nèi)鈣離子濃度呈下降趨勢(shì)。

線粒體自噬在細(xì)胞凋亡過程中起調(diào)節(jié)作用［14］。LC3 是位于自噬體膜上的標(biāo)記蛋白［15］。BNIP3 定位于線粒體，是低氧誘導(dǎo)激活線粒體自噬發(fā)生中的重要信號(hào)分子［16］。研究發(fā)現(xiàn)BNIP3不僅能誘導(dǎo)線粒體膜電位的降低［17］，在線粒體自噬中也發(fā)揮著重要的作用［18］。低氧條件下可通過其LIR結(jié)構(gòu)域與LC3蛋白發(fā)生相互作用，從而誘導(dǎo)線粒體自噬；同時(shí)，BNIP3磷酸化可增強(qiáng)其與LC3 蛋白的相互作用，進(jìn)一步促進(jìn)線粒體自噬［19］。因此，我們推測(cè)BNIP3在自噬的發(fā)生過程中，起介導(dǎo)作用。

有報(bào)道顯示，當(dāng)?shù)脱跽T導(dǎo)BNIP3高表達(dá)時(shí)，BNIP3和BNIP3L能與Beclin-1競(jìng)爭(zhēng)性地與Bcl-2或Bcl-XL相結(jié)合［20］，因此，Beclin-1 會(huì)從線粒體上的Bcl-2/Beclin-1或Bcl-XL/Beclin-1 復(fù)合體釋放出來，游離的Beclin-1與Vps34、Ambra1等多種蛋白共同形成III型磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）復(fù)合體，進(jìn)而激活PI3K/Akt通路［21］。

PI3K/Akt信號(hào)通路廣泛存在于滑膜組織，對(duì)RA的滑膜細(xì)胞增殖有重要的作用［22］?；谝陨侠碚?，通過進(jìn)一步對(duì)自噬相關(guān)因子的分析，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯抑制了自噬因子（LC3、Beclin-1）的表達(dá)，而促使p62表達(dá)水平升高（溶酶體降解過程中，與底物結(jié)合的p62 被蛋白水解酶降解。因此，p62水平升高通常被認(rèn)為是自噬活性受到抑制的標(biāo)志［23］），也減緩了線粒體自噬現(xiàn)象的發(fā)生，而PI3K、AKT的表達(dá)也同時(shí)降低，綜上所述，可能是通過抑制BNIP3介導(dǎo)的PI3K/AKT通路，從而抑制了自噬因子的表達(dá)。

RA在中醫(yī)稱為痹病、尪痹，病因病機(jī)概括為正虛邪實(shí)［24］，患者多病程綿長(zhǎng)，久治不愈，氣虛血瘀型在臨床較為常見［25］，而補(bǔ)陽還五湯因療效確切，被廣泛應(yīng)用。補(bǔ)陽還五湯由黃芪、川芎、紅花、當(dāng)歸尾、赤芍、桃仁、地龍組成，是由清代名醫(yī)王清任創(chuàng)制的經(jīng)典名方，首見于《醫(yī)林改錯(cuò)》一書中，具有益氣活血、祛瘀通絡(luò)的功效。方中重用生黃芪，大補(bǔ)脾胃之元?dú)?，令氣旺血行，瘀去絡(luò)通，為君藥；當(dāng)歸尾長(zhǎng)于活血，且有化瘀而不傷血之妙，是為臣藥；川芎、赤芍、桃仁、紅花助當(dāng)歸尾活血祛瘀，地龍通經(jīng)活絡(luò)，均為佐藥。本方的配伍特點(diǎn)是大量補(bǔ)氣藥與少量活血藥相配，使氣旺則血行，活血而不傷正，共奏補(bǔ)氣活血通絡(luò)之功?？v觀全方布局，采用大量補(bǔ)氣藥與少量活血化瘀藥配伍，使陽氣旺盛，血液運(yùn)行恢復(fù)如常，瘀血去除，經(jīng)絡(luò)通暢，活血而不傷正。

近年來，對(duì)補(bǔ)陽還五湯的基礎(chǔ)及臨床研究取得較多進(jìn)展。Meta 分析顯示其具有較好的臨床療效和安全性［26-28］。而我們的研究表明，補(bǔ)陽還五湯中西藥組患者臨床癥狀HAQ和VAS評(píng)分、血清IL-4和CRP指標(biāo)較西藥組改善更為明顯（Plt;0.05）［29］，實(shí)驗(yàn)研究表明關(guān)節(jié)病理檢測(cè)給藥治療后補(bǔ)陽還五湯組小鼠血管翳明顯減少，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕，骨結(jié)構(gòu)與模型組相比相對(duì)完整［30］。

綜上所述，益氣養(yǎng)血方補(bǔ)陽還五湯在RA的應(yīng)用中，無論臨床療效，還是生物學(xué)基礎(chǔ)方面均有肯定的評(píng)價(jià)，我們旨在通過更多的科學(xué)研究，在豐富痹癥的現(xiàn)代內(nèi)涵的同時(shí)，能真正讓中醫(yī)藥發(fā)揮特色優(yōu)勢(shì)。尤其是在慢行免疫疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的臨床治療中，中西醫(yī)結(jié)合療法值得進(jìn)一步的探索。

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（編輯：吳錦雅）