微RNA（microRNA，miRNA）是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，在不同的細(xì)胞活動(dòng)及生命進(jìn)程中都發(fā)揮重要的調(diào)控作用。1993年，安布羅斯（V.Ambros）和魯夫昆（G.Ruvkun）在《細(xì)胞》（Cell）雜志以背靠背形式發(fā)表兩篇研究論文[1，2]，驚人地發(fā)現(xiàn)秀麗隱桿線蟲(chóng)（C.elegans，以下簡(jiǎn)稱線蟲(chóng)）中22個(gè)核苷酸的lin-4竟能與lin-14mRNA的3’UTR部分互補(bǔ)，從而抑制其翻譯成蛋白質(zhì)。然而，由于lin-4僅存在線蟲(chóng)中，這一重要發(fā)現(xiàn)被當(dāng)時(shí)的科學(xué)界所忽視。7年后，魯夫昆團(tuán)隊(duì)在線蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)第二個(gè)miRNA——let-7，不僅能靶向lin-413’UTR降低其表達(dá)，而且在果蠅和斑馬魚等動(dòng)物界高度保守[3]。隨后，成千上萬(wàn)的miRNA在人以及小鼠、擬南芥等動(dòng)植物中被發(fā)現(xiàn)，由此開(kāi)啟了RNA調(diào)控基因的全新領(lǐng)域。目前，miRNA靶向抑制基因理論已經(jīng)成為經(jīng)典，但卻讓miRNA研究由“熱”轉(zhuǎn)“冷”。近些年，核內(nèi)miRNA靶向增強(qiáng)子激活基因理論正悄然興起，能否借諾貝爾獎(jiǎng)之東風(fēng)掀起miRNA研究的新浪潮，讓我們拭目以待！

興趣碰撞開(kāi)啟miRNA新紀(jì)元

1953年，安布羅斯出生于美國(guó)新罕布什爾州，家里有8個(gè)孩子，其父親是波蘭人，因躲避戰(zhàn)火連中學(xué)都沒(méi)有念完。他為父親感到惋惜，懂得珍惜學(xué)習(xí)機(jī)會(huì)，自小立志成為一名科學(xué)家。他在申請(qǐng)麻省理工學(xué)院（MIT）讀書時(shí)就表明，“我想當(dāng)個(gè)科學(xué)家”。隨后，他進(jìn)入MIT學(xué)習(xí)天文，但發(fā)現(xiàn)自己對(duì)物理學(xué)興趣一般，在室友的熏陶下，癡迷于揭示分子生物與基因組學(xué)的奧秘，徹底愛(ài)上了分子生物學(xué)。在博士期間，他師從巴爾的摩教授（D.Baltimore，1975年獲諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)），研究脊髓灰質(zhì)炎病毒的基因組結(jié)構(gòu)和復(fù)制。在此期間，霍維茨教授（H.R.Horvitz，2002年獲諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)）來(lái)到MIT建立實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行了線蟲(chóng)研究的學(xué)術(shù)報(bào)告，讓安布羅斯對(duì)線蟲(chóng)產(chǎn)生濃厚興趣。1979年，他加入霍維茨實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行博士后訓(xùn)練，研究lin-4和unc-86對(duì)線蟲(chóng)發(fā)育的調(diào)控作用。

1952年，魯夫昆出生在美國(guó)加州伯克利市的猶太家庭，其父母鼓勵(lì)他對(duì)科學(xué)的熱愛(ài)。童年時(shí)期，他對(duì)科學(xué)充滿興趣，因愛(ài)好無(wú)線電，對(duì)電子學(xué)和物理學(xué)很著迷，后來(lái)他進(jìn)入加州大學(xué)伯克利分校學(xué)習(xí)電氣工程。1973年，魯夫昆獲得學(xué)士學(xué)位，恰逢經(jīng)濟(jì)蕭條，對(duì)未來(lái)困惑不已。于是，他買了一輛面包車，沿美國(guó)西海岸旅行直到玻利維亞，曾嘗試應(yīng)聘電臺(tái)DJ等工作都未成功，最后得到酒吧的種樹(shù)工作，與滿懷理想的年輕嬉皮士共同種樹(shù)和生活。然而，一次偶然的機(jī)會(huì)，他被《科學(xué)美國(guó)人》雜志所吸引，內(nèi)心科研的火種被再次點(diǎn)燃，命運(yùn)的齒輪也由此反轉(zhuǎn)。1976年，他返回美國(guó)進(jìn)入哈佛大學(xué)攻讀博士學(xué)位，師從植物分子生物學(xué)家?jiàn)W蘇貝爾（F.Ausubel），并共同解開(kāi)了植物固氮的諸多謎團(tuán)。1982年，他獲得生物物理學(xué)博士學(xué)位后，決定改變研究方向，在哈佛大學(xué)吉爾伯特（W.Gilbert，1980年獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)）和MIT的霍維茨實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行博士后研究，關(guān)注線蟲(chóng)發(fā)育相關(guān)的信號(hào)通路，并與安布羅斯相遇。

1980年代，安布羅斯和魯夫昆在霍維茨實(shí)驗(yàn)室中共同探究lin-14在線蟲(chóng)發(fā)育中的作用機(jī)制，但并未解開(kāi)未知之謎。隨后，他們分別加入哈佛大學(xué)的不同團(tuán)隊(duì)繼續(xù)聚焦lin-14研究，盡管兩人保持相對(duì)獨(dú)立，但又緊密合作。后來(lái)，安布羅斯和魯夫昆分別獨(dú)立推導(dǎo)lin-4和lin-14的序列信息，在1992年6月11日晚上交換彼此的結(jié)果，對(duì)比后驚奇地發(fā)現(xiàn)，lin-4非編碼RNA在lin-14mRNA的3’UTR存在多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，像拉鏈一樣吻合。兩個(gè)團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步證實(shí)lin-4通過(guò)結(jié)合在lin-14mRNA的3’UTR抑制其翻譯，并于1993年將論文同時(shí)發(fā)表在《細(xì)胞》雜志上[1，2]。一種以miRNA為媒介的新型基因調(diào)控方式被發(fā)現(xiàn)，但當(dāng)時(shí)并未引起科學(xué)界的關(guān)注。直到2000年，魯夫昆團(tuán)隊(duì)證實(shí)線蟲(chóng)中l(wèi)et-7在動(dòng)物界具有高度保守性[3]，突顯了miRNA抑制基因的普適性，才正式開(kāi)啟miRNA研究新領(lǐng)域。

miRNA掌控細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)換

研究表明，miRNA生成是一個(gè)被精心編排的生物學(xué)過(guò)程。首先，在細(xì)胞核內(nèi)，基因組DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生長(zhǎng)鏈的初級(jí)miRNA（primarymiRNA，pri-miRNA），通常包含一個(gè)或多個(gè)發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，是miRNA成熟的關(guān)鍵信號(hào)。接著，DGCR8蛋白與Drosha酶等相互作用并結(jié)合pri-miRNA，Drosha酶將pri-miRNA剪切成約70個(gè)核苷酸長(zhǎng)的前體miRNA（precursormiRNA，pre-miRNA）。然后，pre-miRNA在exportin-5蛋白協(xié)助下，從細(xì)胞核被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)，被Dicer酶進(jìn)一步剪切形成雙鏈RNA，與AGO蛋白組成miRNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（miRNA-inducedsilencingcomplex，miRISC）并完成雙鏈解旋，最終導(dǎo)致RNA雙鏈中僅有一條鏈與AGO蛋白穩(wěn)定結(jié)合，該鏈被稱為引導(dǎo)鏈，即成熟miRNA。目前，最全面的miRNA公共數(shù)據(jù)庫(kù)——miRBase已收錄來(lái)自271個(gè)物種、超過(guò)4萬(wàn)個(gè)miRNA的信息，其中，人類miRNA共1917個(gè)，可能在疾病和發(fā)育進(jìn)程中起重要的調(diào)控作用。

miRNA通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)影響細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生物學(xué)功能，在個(gè)體發(fā)育、行為表現(xiàn)以及疾病發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要。例如，最早發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)miRNA——lin-4和let-7都能調(diào)控線蟲(chóng)的發(fā)育時(shí)序。其中，lin-4通過(guò)抑制lin-14和lin-28表達(dá)，分別調(diào)控線蟲(chóng)L1～L2期和L2～L3期的轉(zhuǎn)變[1]；let-7通過(guò)調(diào)控lin-41、hbl-1等靶基因，調(diào)控線蟲(chóng)從L4期到成蟲(chóng)的轉(zhuǎn)變[4]。另外，miR-iab4/iab8突變則顯著影響果蠅幼蟲(chóng)的自我糾正能力[5]，進(jìn)而影響其行為表現(xiàn)。然而，miRNA表達(dá)異常則導(dǎo)致靶基因表達(dá)失控，與腫瘤、自身免疫性疾病以及神經(jīng)退行性疾病等密切相關(guān)。以乳腺癌為例，低表達(dá)的miR-339通過(guò)降低抑癌基因表達(dá)促進(jìn)乳腺癌發(fā)生發(fā)展[6]。那么，miRNA如何影響個(gè)體發(fā)育和疾病進(jìn)程呢？

我們認(rèn)為，miRNA通過(guò)改變時(shí)空維度上細(xì)胞的身份及狀態(tài)影響發(fā)育和疾病過(guò)程。事實(shí)上，miRNA具有很強(qiáng)的組織細(xì)胞特異性，如肌肉特異性miR-1和肝臟特異性miR-122等。其中，小鼠miR-122隨著胚胎發(fā)育逐漸升高，在出生時(shí)急劇升高，這與出生后肝臟代謝功能密切相關(guān)。另外，小鼠被敲除miR-122后導(dǎo)致脂肪在肝臟積累，逐漸獲得脂肪細(xì)胞儲(chǔ)肪功能，丟失部分肝臟細(xì)胞排除脂肪的能力，引起肝炎，最終在11月齡時(shí)發(fā)展成肝癌。此外，miR-17～92家族參與Th細(xì)胞身份的塑造，而miR-7在成熟的胰腺β細(xì)胞身份維持中發(fā)揮重要作用。因此，miRNA組織特異性表達(dá)的特征與細(xì)胞特定身份密切相關(guān)，其異常表達(dá)會(huì)造成細(xì)胞身份轉(zhuǎn)變及疾病發(fā)生與進(jìn)展，但具體作用機(jī)制尚不完全清楚。

NamiRNA打破基因沉默的魔咒

目前，沉默基因表達(dá)是miRNA調(diào)控基因的經(jīng)典途徑，主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平。在細(xì)胞質(zhì)中，成熟miRNA與AGO蛋白形成miRISC復(fù)合體并通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與mRNA結(jié)合，負(fù)向調(diào)節(jié)其翻譯效率和穩(wěn)定性抑制基因表達(dá)。一方面，miRISC復(fù)合體通過(guò)阻止翻譯起始因子被招募到mRNA的5’端非編碼區(qū)或者影響核糖體沿mRNA的移動(dòng)，抑制核糖體的翻譯[7]。另一方面，miRISC復(fù)合體會(huì)激活去腺苷化酶，將mRNA3’端的多腺苷酸尾切除，進(jìn)一步導(dǎo)致mRNA的5’端帽結(jié)構(gòu)丟失，加速mRNA被核酸外切酶降解，降低基因表達(dá)。然而，動(dòng)植物中miRNA與mRNA的結(jié)合方式并不完全相同。在植物中，miRNA常以完全匹配的方式結(jié)合mRNA并形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)沉默基因表達(dá)，而在動(dòng)物中，miRNA與mRNA的結(jié)合通常是不完全匹配的，極大增加miRNA抑制靶標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)的復(fù)雜性和難度[8]。與此相反，miRNA能與啟動(dòng)子相互作用以非經(jīng)典途徑在轉(zhuǎn)錄水平上激活基因表達(dá)。例如，細(xì)胞核中的miR-373能夠與E-鈣黏蛋白基因的啟動(dòng)子區(qū)域序列互補(bǔ)并促進(jìn)mRNA的轉(zhuǎn)錄，揭示miRNA更為復(fù)雜的生物學(xué)功能。

近些年，復(fù)旦大學(xué)于文強(qiáng)團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了一種全新的非經(jīng)典途徑——細(xì)胞核內(nèi)miRNA靶向增強(qiáng)子激活基因轉(zhuǎn)錄，并將這類miRNA命名為核內(nèi)激活miRNA（nuclearactivatingmiRNA，NamiRNA）。2009年，該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)大多數(shù)miRNA在基因組位置上與基因激活元件增強(qiáng)子高度重疊，提示miRNA可能具有激活基因的功能。經(jīng)過(guò)8年潛心研究，團(tuán)隊(duì)證實(shí)miRNA能夠定位于細(xì)胞核內(nèi)，并揭示了核內(nèi)miRNA激活基因的功能機(jī)制，創(chuàng)造性地提出了NamiRNA-增強(qiáng)子-基因激活的全新理論[9，10]。NamiRNA指的是一類在細(xì)胞核內(nèi)的miRNA，能夠通過(guò)與增強(qiáng)子相互作用促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄。具體來(lái)說(shuō)[10]，miRNA作為楔子，打開(kāi)基因組DNA雙鏈，AGO2識(shí)別增強(qiáng)子與miRNA的雜交鏈，維持DNA單鏈狀態(tài)，促進(jìn)RNA聚合酶Ⅱ?qū)虻霓D(zhuǎn)錄。事實(shí)上，NamiRNA不僅能夠激活與其位置相鄰的靶基因表達(dá)，還能夠激活全基因組范圍內(nèi)的基因表達(dá)，從而影響細(xì)胞身份及功能改變。NamiRNA的發(fā)現(xiàn)開(kāi)啟了一個(gè)新的研究領(lǐng)域，實(shí)現(xiàn)了miRNA從沉默基因到激活基因的華麗轉(zhuǎn)身，為miRNA的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化提供了新的視角和方向。

借諾貝爾獎(jiǎng)東風(fēng)創(chuàng)miRNA研究新浪潮

截至2024年12月，PubMed檢索“miRNA”文章已超過(guò)17萬(wàn)篇，涵蓋病毒、細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物自然界五大類生物，不僅揭示了miRNA調(diào)控微生物繁殖及對(duì)宿主的作用，而且探究了miRNA在動(dòng)植物的發(fā)育及不同疾病過(guò)程的重要作用，尤其在miRNA的生成加工過(guò)程、生物功能以及基因調(diào)控模式等方面都取得很大進(jìn)展。然而，miRNA文章自2021年開(kāi)始逐年減少，2024年發(fā)文總量銳減近50%，似乎意味著miRNA研究正由“盛”轉(zhuǎn)“衰”，其背后原因值得我們深思。

首先，miRNA的基礎(chǔ)研究似乎早已陷入“科研怪圈”：過(guò)表達(dá)miRNA能夠誘導(dǎo)基因的差異表達(dá)，但大多數(shù)研究者僅僅關(guān)注下調(diào)的基因，對(duì)上調(diào)基因視而不見(jiàn)。相應(yīng)地，miRNA上調(diào)基因的研究少之又少，且主要是miRNA通過(guò)沉默中間基因?qū)е孪掠位虻纳险{(diào)。那么，miRNA能否激活基因？如前所述，答案是肯定的。如何探究其正向的基因調(diào)控作用呢？NamiRNA-增強(qiáng)子-基因激活理論為科研工作者指明了具體方向，細(xì)胞核內(nèi)的miRNA可以作為激活劑，活化基因組增強(qiáng)子并與其相互作用，打開(kāi)DNA雙鏈，激活基因轉(zhuǎn)錄。目前，NamiRNA研究尚處于早期階段，還有諸多未知值得深入探究。我們相信，在不遠(yuǎn)的未來(lái)，NamiRNA研究的新生力量必將涌現(xiàn)，共同實(shí)現(xiàn)miRNA基礎(chǔ)研究的繁榮與復(fù)興！

其次，miRNA的臨床應(yīng)用似乎總是“撲朔迷離”，尤其是成藥極其困難。2008年，丹麥制藥公司SantarisPharma宣布SPC3649（Miravirsen）進(jìn)入臨床試驗(yàn)，是全球首個(gè)靶向miRNA的核酸藥物，能特異性結(jié)合miR-122，旨在降低丙肝病毒（hepatitisCvirus，HCV）載量。隨后的臨床Ⅱ期試驗(yàn)顯示，該藥物用于慢性丙肝病毒感染患者呈現(xiàn)劑量依賴性的丙肝病毒RNA的降低[11]，但后報(bào)道稱Miravirsen會(huì)誘導(dǎo)HCV的UTR區(qū)域突變，沒(méi)有進(jìn)一步的進(jìn)展。2016年，首個(gè)miR-34a類似物MRX34的多中心臨床I期試驗(yàn)因嚴(yán)重的免疫副作用致死而終止[12]。目前，尚無(wú)臨床可用的靶向miRNA核酸藥物。近些年，核酸藥物的修飾以及遞送系統(tǒng)已取得巨大進(jìn)步，不僅能降低核酸藥物的免疫原性，而且能促進(jìn)其向靶組織器官的運(yùn)輸。那么，決定miRNA成藥的關(guān)鍵是什么呢？我們認(rèn)為，靶點(diǎn)篩選是miRNA成藥的核心，而篩選策略是重中之重。與經(jīng)典抑制理論不同，NamiRNA-增強(qiáng)子-基因激活理論讓我們更關(guān)注miRNA對(duì)全基因組的激活作用，有望引領(lǐng)一種全新的miRNA篩選潮流，突破miRNA成藥難的困境。我們期待，藥物研發(fā)團(tuán)隊(duì)及生物醫(yī)藥企業(yè)能夠重拾信心，提升靶向miRNA核酸藥物的研發(fā)投入，加快miRNA的臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化！

借著諾貝爾獎(jiǎng)的東風(fēng)，miRNA研究2.0時(shí)代已經(jīng)開(kāi)啟，讓我們共同努力，推動(dòng)基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化，催生臨床可用的靶向miRNA核酸藥物，為人類與疾病的斗爭(zhēng)貢獻(xiàn)力量！

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關(guān)鍵詞：諾貝爾獎(jiǎng)miRNA沉默基因NamiRNA基因激活■