摘 要： MgtC蛋白在多種胞內(nèi)寄生菌中是一個重要的毒力因子并表現(xiàn)出抵抗低Mg²⁺環(huán)境的能力。布魯氏菌是一種重要的胞內(nèi)寄生菌，但是關(guān)于MgtC蛋白在布魯氏菌中的生物學(xué)功能報道較少。為了全面闡述MgtC在布魯氏菌中的生物學(xué)特性，本文研究了牛種布魯氏菌MgtC蛋白對低Mg²⁺環(huán)境的適應(yīng)性及其它可能的生物學(xué)功能。構(gòu)建牛種布魯氏菌（S2308株）的mgtC基因缺失突變株S2308ΔmgtC，同時采用質(zhì)粒回補方式構(gòu)建回補株S2308ΔmgtC（pBBR1MCS-mgtC），隨后對其開展低/高Mg²⁺環(huán)境中生長曲線測定，ATP含量測定，胞內(nèi)存活，環(huán)境應(yīng)激，生物被膜檢測和小鼠攻毒試驗等研究，全面分析MgtC在牛種布魯氏菌中的生物學(xué)功能。結(jié)果顯示：成功構(gòu)建缺失株S2308ΔmgtC及其回補株S2308ΔmgtC（pBBR1MCS-mgtC）。牛種布魯氏菌S2308在低Mg²⁺環(huán)境中，mgtC基因轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)（Plt;0.05）；與親本株和回補菌株相比，缺失株S2308ΔmgtC在低Mg²⁺環(huán)境中的生長曲線（Plt;0.001）、膜結(jié)構(gòu)完整性（Plt;0.05）、生物被膜形成能力（Plt;0.01）均低于與親本菌株和回補菌株，而菌體內(nèi)ATP含量均高于親本菌株和回補菌株（Plt;0.001）。此外，mgtC基因的缺失不影響牛種布魯氏菌在巨噬細胞內(nèi)的存活以及對小鼠的致病能力。在低Mg²⁺環(huán)境下，牛種布魯氏菌通過MgtC保證細菌ATP正常水解，維持自身正常生理活動和膜結(jié)構(gòu)的完整性，但是MgtC對牛種布魯氏菌的毒力和致病性無明顯影響，本研究為深入了解牛種布魯氏菌提供了數(shù)據(jù)支撐。

關(guān)鍵詞： 牛種布魯氏菌S2308；mgtC；低Mg²⁺環(huán)境；生物學(xué)功能

中圖分類號： S852.614"""" 文獻標(biāo)志碼：A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）01-0365-13

收稿日期：2024-02-28

基金項目：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項 （2023-YWF-ZYSQ-05）；“十四五”國家重點研發(fā)計劃 （2023YFD1800703）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項目（CAAS-CSLPDCP-202403）;感謝中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項 （2023-YWF-ZYSQ-05）、十四五國家重點研發(fā)計劃 （2023YFD1800703）以及中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項目（CAAS-CSLPDCP-202403）對本研究的支持

作者簡介：王恒泰（1998-），男，山東滕州人，碩士生，主要從事布魯氏菌抵抗吞噬溶酶體不良環(huán)境的研究，E-mail：17861509833@163.com

*通信作者：李 朋，主要從事布魯氏菌病防控及其致病機制研究，E-mail： lipeng01@caas.cn;丁家波，主要從事人畜共患病及其防控研究，E-mail： dingjiabo@caas.cn

Biological Function of MgtC Protein in Brucella abortus to Low-Mg²⁺ Resistant Environment

WANG" Hengtai L Lang JIANG" Hui CHENG" Junsheng2， LIU" Minghe2，

CHU" Yuefeng3， XU" Jian3， LI" Peng "DING" Jiabo^1*

（1.Institute of Animal Science and Veterinary Medicine， Chinese Academy of Agricultural

Science， Beijing 100193，" China;

2.China Veterinary Drug Supervision Institute，

Beijing 10008" China;

3.State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention，

College of Veterinary Medicine， Lanzhou University， Lanzhou Veterinary Research

Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences，

Lanzhou 730000，" China）

Abstract： "MgtC protein is an important virulence factor in a variety of intracellular parasites and possesses ability of resistance to low Mg²⁺ environment. Brucella is an important intracellular parasite， and there are few reports on the biological function of MgtC protein in Brucella. To explore the biological characteristics of MgtC in Brucella abortus， the adaptability to low Mg²⁺ environment and other possible biological functions were studied in this study. Brucella abortus S2308 mgtC deletion mutant （S2308ΔmgtC） and the complementary strain S2308ΔmgtC （pBBR1MCS-mgtC） were constructed. Subsequently， studies on the three strains in low/high Mg²⁺ environment with growth curve determination， ATP content determination， intracellular survival， environmental stress， biofilm detection and mouse challenge test were conducted to comprehensively analyze the biological function of MgtC in Brucella abortus. The deletion strain S2308ΔmgtC and its complementary strain S2308ΔmgtC （pBBR1MCS-mgtC） were successfully constructed. In Brucella abortus S2308， expression of mgtC gene was significantly up-regulated in low Mg²⁺ environment（Plt;0.05）. The growth curve（Plt;0.001）， membrane structure integrity（Plt;0.05）and biofilm formation ability（Plt;0.01）of S2308ΔmgtC in low Mg²⁺ environment were lower than those of the parent strain and the complementary strain， while the ATP content in the strain was higher than that of the parent strain and the complementary strain（Plt;0.001）. In addition， the deletion of mgtC gene did not affect the survival of Brucella abortus to macrophages and the pathogenicity of mice. In low Mg²⁺ environment， Brucella abortus employed MgtC to ensure the normal hydrolysis of ATP and maintain its normal physiological activities and the integrity of membrane structure. However， MgtC had no significant effect on the virulence and pathogenicity of Brucella abortus. This study provides data support for further understanding of Brucella abortus.

Key words： Brucella abortus S2308; mgtC; low Mg²⁺ environment; biological function

*Corresponding authors：" LI Peng， E-mail： lipeng01@caas.cn; DING Jiabo， E-mail： dingjiabo@caas.cn

布魯氏菌?。˙rucellosis），簡稱布病，是一種由布魯氏菌（Brucella spp.）引起重要人獸共患細菌病，嚴(yán)重影響畜牧業(yè)發(fā)展及人類健康。世界衛(wèi)生組織（WHO）將布病劃定為對全球公共衛(wèi)生安全具有嚴(yán)重危害且最容易被忽視的人獸共患病之一^［1］。布魯氏菌屬革蘭陰性菌，是一種兼性胞內(nèi)寄生菌，缺乏眾所周知的經(jīng)典毒力因子，如孢子、菌毛、鞭毛、溶細胞素、外毒素、分泌蛋白酶和毒力質(zhì)粒^［2］等，其毒力主要體現(xiàn)在感染宿主細胞并在胞內(nèi)復(fù)制的能力。布魯氏菌既可以感染巨噬細胞、樹突狀細胞、單核細胞等專職吞噬細胞，也可以感染胎盤滋養(yǎng)層細胞、上皮細胞等非專職吞噬細胞^［3］。據(jù)報道，布魯氏菌感染宿主細胞和胞內(nèi)存活所必需的毒力因子主要包括環(huán)β- 形成布氏小體（BCV）^［5］，在多種毒力因子以及其他相關(guān)因子的作用下，適應(yīng)宿主內(nèi)各種壓力環(huán)境（如酸性環(huán)境、低營養(yǎng)環(huán)境及低Mg²⁺環(huán)境等），實現(xiàn)抵抗宿主吞噬溶酶體的殺傷作用，從而保證布魯氏菌在宿主細胞內(nèi)建立感染并進行胞內(nèi)復(fù)制。但是，布魯氏菌如何適應(yīng)低Mg²⁺環(huán)境目前還不清楚。

微生物在執(zhí)行其生物功能時通常需要金屬陽離子的參與，其中鎂離子（Mg²⁺）在活細胞中含量最多，濃度范圍為5～20 mmol·L^{-1 ［6］}。Mg²⁺具有最小的離子半徑^［7］和最大的水合半徑^［8］，因此經(jīng)常能夠偶聯(lián)其他化合物輔助其發(fā)揮功能。Mg²⁺是促進核糖體的組裝^［9］、維持RNA和DNA的穩(wěn)定^［10］，參與生物體各項重要酶促反應(yīng)^［11］，中和外膜脂多糖（LPS）中的負電荷^［12］等生物學(xué)過程所必需的金屬離子。此外，Mg²⁺是一種細胞外信號，控制細菌的PhoP/PhoQ雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)^［13］。在Mg²⁺匱乏環(huán)境中，許多因子的表達被PhoP/PhoQ雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)直接激活^［14］，包括Mg²⁺轉(zhuǎn)運蛋白MgtA和MgtB^［15］、修飾LPS的酶、F1Fo ATP合酶抑制蛋白MgtC^［16］和多胺^［17］。

研究顯示，沙門菌、結(jié)核分枝桿菌、耶爾森菌等胞內(nèi)寄生菌都需要MgtC蛋白以保證其在巨噬細胞內(nèi)存活和在低Mg²⁺培養(yǎng)基中生長^［18］，但是對于同為胞內(nèi)寄生菌的布魯氏菌，其MgtC蛋白的生物學(xué)功能報道較少。2005年，Lavigne等^［19］報道豬種布魯氏菌的胞內(nèi)復(fù)制需要MgtC的參與，但是MgtC蛋白具體的作用機制、對低Mg²⁺環(huán)境的適應(yīng)性及其它可能的生物學(xué)功能仍不清楚。為了進一步全面闡明布魯氏菌MgtC蛋白的生物學(xué)功能，本研究以牛種布魯氏菌MgtC為研究對象，探究在低Mg²⁺環(huán)境下MgtC對牛種布魯氏菌的生長情況、對ATP水解供能的影響，以及在酸性應(yīng)激、氧化還原應(yīng)激、生物被膜形成、胞內(nèi)存活和小鼠致病性等方面發(fā)揮的生物學(xué)功能，為闡明牛種布魯氏菌的致病機制提供理論數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

牛種布魯氏菌S2308株（Brucella abortus S2308）由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所檢測技術(shù)室保存并提供，pUCML-secB、pBBR1MCS-1等載體由本實驗室保存。凡涉及強毒株操作均在中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所P3實驗室中完成。

1.1.2 主要試劑和儀器

胰酪大豆胨液體/固體培養(yǎng)基（Trypticasesoy Broth/Agar，TSB/TSA）購自北京強欣博瑞有限公司，Primer star DNA聚合酶購自北京TaKaRa生物技術(shù)有限公司，DNA Marker購自北京康潤生物，限制性核酸內(nèi)切酶購自NEB生物公司，DNA純化試劑盒購自O(shè)mega生物公司，質(zhì)粒小提中量試劑盒、細菌RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，TritonX-100、多黏菌素B（polymyxin B）、30%過氧化氫（H 2O 2）、NaCl、硝酸鈉、M9低鹽培養(yǎng)基、ATP檢測試劑盒等購自上海索萊寶生物科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自東洋紡（上海）生物科技有限公司，染色法熒光定量試劑盒ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix、2×Taq Master Mix酶購自諾唯贊生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌RNA提取

牛種布魯氏菌S2308株稀釋至1×108 CFU·mL^- 然后在添加0.1% 酪蛋白氨基酸、1%酵母提取物、10 μmol·L^-1或10 mmol·L^-1 MgCl 2的M9^［19］培養(yǎng)基中加入50 μL稀釋好的菌液，37℃，220 r·min^- 搖至OD 600 nm=0.4～0.6，按照Tian Gen RNA prep Pure cell/Bacteria total RNA extraction kit（DP430）提取RNA，每個樣品設(shè)3個重復(fù)。

1.2.2 熒光定量qPCR

取上述提取出的RNA 1 μg，用東洋紡反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行去除模板DNA，并進行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄1 μL當(dāng)模板，用諾唯贊ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix進行染料法qPCR的測定，以16S為內(nèi)參，2^-ΔΔCt方法計算，每個試驗組做3個重復(fù)。

1.2.3 引物設(shè)計

根據(jù)NCBI網(wǎng)站上公布的牛種布魯氏菌S2308株全基因組序列（GenBank登錄號為NC_007624.1）和pBBR1MCS-1載體的基因序列（GenBank登錄號為U02374.1），用Snap gene軟件分別設(shè)計擴增引物，引物序列見表1。

1.2.4 牛種布魯氏菌mgtC缺失株及其回補株的構(gòu)建

通過PCR擴增mgtC（BAB_RS26555）的上下游同源臂，連接到pUCML-secB載體中，獲得相應(yīng)重組質(zhì)粒。將鑒定成功后的自殺質(zhì)粒電轉(zhuǎn)到牛種布魯氏菌S2308感受態(tài)中，涂布于含有卡那霉素抗性基因的TSA板。挑取單菌落搖混稀釋后涂布于含5%蔗糖的TSA板上。挑取單菌落分別在卡那霉素抗性和5%蔗糖TSA板進行劃線，選擇在卡那霉素板上不能生長而在蔗糖板上生長的單菌落進行PCR鑒定；通過PCR擴增含有自身啟動子的mgtC（BAB_RS26555）基因，純化后與回補質(zhì)粒pBBR1MCS-1連接，篩選正確的重組質(zhì)粒。將質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至S2308ΔmgtC感受態(tài)中，涂布到含有氯霉素的TSA板上，放到37℃、5% CO 2培養(yǎng)箱72 h，挑取單菌落進行鑒定。

1.2.5 生長曲線的測定

將S2308、S2308ΔmgtC、S2308ΔmgtC（pBBR1MCS-mgtC）菌株在3 mL TSB中培養(yǎng)24 h。取1 mL離心后，用1 mL M9培養(yǎng)基重懸，稀釋至1×108 CFU·mL^- 加入至20 mL含有0.1%酪蛋白氨基酸、1%酵母提取物、1%阿拉伯糖、10 μmol·L^-1或10 mmol·L^-1 MgCl 2的M9培養(yǎng)基中，每12h測一次OD 600 nm吸光度。

1.2.6 RNA-Sequencing和RNA-Seq分析" 對菌株S2308、S2308ΔmgtC分別進行高/低Mg²⁺誘導(dǎo)，提取RNA，進行轉(zhuǎn)錄組測序?；贑RAC輸出，使用DESeq對每個物種的兩種不同誘導(dǎo)條件進行歸一化和差異基因表達分析。

1.2.7 細菌內(nèi)ATP含量試劑盒

將菌株S2308、S2308ΔmgtC、S2308ΔmgtC（pBBR1MCS-mgtC），初始菌落數(shù)稀釋至1×108 CFU·mL^-1。然后在添加0.1%酪蛋白氨基酸、1%酵母提取物、1%阿拉伯糖、10 μmol·L^-1或10 mmol·L^-1 MgCl 2的M9培養(yǎng)基中加入50 μL稀釋好的菌液，在37 ℃、220 r·min^-1下培養(yǎng)至OD 600 "nm=0.4～0.6。對上述菌液計數(shù)后，按照索萊寶ATP檢測試劑盒（貨號：BC0305）進行測定。

1.2.8 環(huán)境壓力應(yīng)激

測定各菌株對酸性環(huán)境的敏感性，將各菌株稀釋至1×108 CFU·mL^- 取10 μL加入200 μL pH=5.5或者pH=4.5的TSB中^［20］，37℃孵育2 h，取100 μL進行稀釋計數(shù)，計算存活率。

采用H 2O 2測定牛種布魯氏菌對氧化應(yīng)激的敏感性，將菌株稀釋至1×106 CFU·mL^- 在菌懸液中添加H 2O "最終濃度分別為2.5 mmol·L^-1和5 mmol·L^-1［20］。37℃、孵育2 h后，取100 μL進行稀釋計數(shù)，計算存活率。

為了確定每個菌株突變體對熱或冷沖擊脅迫的敏感性，將5 μL梯度稀釋的細菌培養(yǎng)物（1×108 CFU·mL^-1）在42或25℃、5% CO 2的TSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)72 h。

為了比較各菌株在低鐵培養(yǎng)基中的生長情況，在TSA培養(yǎng)基中加入0.4 mmol·L^-1濃度的鐵螯合劑2， 2-聯(lián)吡啶^［21］（bipyridine），模擬缺鐵環(huán)境。各菌株培養(yǎng)至指數(shù)期，連續(xù)稀釋計數(shù)至1×108 CFU·mL^-1。經(jīng)倍比稀釋后，將5 μL滴于含有0.4 mmol·L^-1的2，2-聯(lián)吡啶的TSA上，37℃孵育72 h。

1.2.9 陽離子殺菌肽的敏感性

將終濃度為1 mg·mL^{-1 ［22］}的多黏菌素B加入菌懸液（1×108 CFU·mL^-1）中，37℃孵育2 h。通過稀釋計數(shù)計算存活率。

1.2.10 對硝普鈉（SNP）的敏感性

SNP是一種自發(fā)釋放NO的有機物質(zhì)。細菌通常采用多種策略來處理NO的毒性作用。SNP用于評估對亞硝化脅迫的敏感性。各菌株先培養(yǎng)至指數(shù)期，連續(xù)稀釋計數(shù)至1×108 CFU·mL^- 取5 μL連續(xù)倍比稀釋10倍，滴在含有0.5 mmol·L^-1SNP的TSA^［22］，37℃孵育72 h。無SNP的TSA作為正常生長對照。

1.2.11 生物被膜的形成能力

將各菌株用TSB調(diào)整菌液濃度為1×107 CFU·mL^- 進行生物被膜形成測定，操作步驟：向96孔板中每孔接種200 μL提前制備的菌液，再設(shè)置一組空白對照（僅加入200 μL TSB培養(yǎng)液），置于37℃、5%CO 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；在培養(yǎng)的48、96 h取出96孔板，棄掉TSB培養(yǎng)液，加入300 μL PBS輕柔地洗滌3次，除去浮游菌體，向每孔加入200 μL甲醇，自然干燥；加入200 μL 0.1%結(jié)晶紫溶液染色20 min，用300 μL PBS輕柔地清洗3次，自然風(fēng)干；加入200 μL提前配制的95%乙醇溶解結(jié)晶紫染料，充分溶解后置于酶標(biāo)儀中檢測595 nm處吸光度。

1.2.12 胞內(nèi)存活

RAW264.7細胞用含有1%血清的DMEM稀釋至2.5×105 CFU·mL^- 并在24孔板中培養(yǎng)12 h（Corning， NY， USA）。按MOI=100將各菌株分別感染細胞，1 000 g離心5 min，孵育1 h。感染完后，PBS洗滌細胞3次，并加入慶大霉素（50 μg·mL^-1）的DMEM殺菌1 h。感染后（p.i.）1、12、24、48、72 h，用500 μL 0.1%TritonX-100水溶液裂解細胞，用PBS倍比稀釋滴板計數(shù)。試驗一式三次，至少重復(fù)兩次。

1.2.13 小鼠毒力試驗

9只6周齡BALB/c小鼠，購自維通利華公司，平均分為S2308組、S2308Δmgtc組和S2308Δmgtc（PBBR1MCS-1）組。

將各菌株稀釋成1×107 CFU·mL^- 分別吸取100 μL（1×106 CFU·mL^-1）對各組小鼠進行腹腔注射。在攻毒后2、4、6周處死小鼠，無菌采集小鼠脾，加1 mL生理鹽水研磨脾組織；連續(xù)倍比稀釋后，涂布無抗的TSA平板，置于37℃、5%CO 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，計算脾細菌載量。試驗中涉及的小鼠試驗的操作均在中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所P3實驗室中完成。倫理審查批件CIVDC2019-000672。

1.2.14 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）”表示，用 Graph Pad Prism 8統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)的差異顯著性分析（t 檢驗法，*. Plt;0.05， **. Plt;0.0 ***. Plt;0.001）。

2 結(jié) 果

2.1 牛種布魯氏菌mgtC缺失株及其回補株的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)錄水平檢測

為探究MgtC在牛種布魯氏菌S2308中的生物學(xué)功能，設(shè)計引物擴增了mgtC上下游同源臂并連接到自殺質(zhì)粒，PCR鑒定結(jié)果顯示，正確連接的質(zhì)粒擴增出大小為2 000 bp的條帶（圖1A），表明mgtC自殺質(zhì)粒構(gòu)建成功。隨后，將自殺質(zhì)粒電轉(zhuǎn)進入牛種布魯氏菌S2308，PCR鑒定結(jié)果顯示，親本株S2308擴增出2 717 bp的條帶，而缺失株S2308ΔmgtC擴增出2 000 bp的條帶（圖1B），表明mgtC基因的缺失株構(gòu)建成功。

同時，設(shè)計引物擴增出含自身啟動子的mgtC基因序列，隨后連接至過表達質(zhì)粒，PCR鑒定結(jié)果顯示能擴增出大小為917 bp的條帶（圖1C），表明mgtC過表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。隨后，將自殺質(zhì)粒電轉(zhuǎn)進入缺失株S2308ΔmgtC，PCR鑒定結(jié)果顯示，菌株擴增出大小為917 bp的條帶（圖1D），表明mgtC基因的回補菌株構(gòu)建成功。

為驗證mgtC基因在缺失株和回復(fù)株中的轉(zhuǎn)錄水平，熒光定量PCR檢測牛種布魯氏菌S2308株、S2308ΔmgtC和回補菌株S2308ΔmgtC（pBBR1MCS-mgtC）中的mgtC基因的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示：與親本株S2308相比，缺失株S2308ΔmgtC的mgtC基因未轉(zhuǎn)錄，回補菌株S2308ΔmgtC（pBBR1MCS-mgtC）中的mgtC基因的轉(zhuǎn)錄水平約為親本株轉(zhuǎn)錄水平的80%，表明mgtC基因的缺失株和回復(fù)株構(gòu)建成功（圖1E）。

2.2 MgtC是牛種布魯氏菌S2308應(yīng)對低Mg²⁺環(huán)境的關(guān)鍵基因

為探究Mg²⁺對牛種布魯氏菌S2308生長代謝的影響，測定了牛種布魯氏菌S2308在高/低Mg²⁺環(huán)境中的生長曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：牛種布魯氏菌S2308在低Mg²⁺環(huán)境中的生長速度明顯低于在高Mg²⁺環(huán)境中的生長速度（Plt;0.00 圖2 A）。牛種布魯氏菌S2308在低Mg²⁺環(huán)境中誘導(dǎo)4、12、24 h后，對菌液進行稀釋計數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與高Mg²⁺環(huán)境相比，親本菌株在低Mg²⁺環(huán)境下細菌CFU顯著降低（Plt;0.00 圖2 B）。綜上所述，Mg²⁺對牛種布魯氏菌S2308生長代謝必不可少。

為探究MgtC對牛種布魯氏菌S2308適應(yīng)低Mg²⁺環(huán)境的影響，首先利用qPCR方法檢測牛種布魯氏菌S2308的mgtC基因在低Mg²⁺環(huán)境中的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示：與高Mg²⁺環(huán)境相比，mgtC在低Mg²⁺環(huán)境中誘導(dǎo)4、12、24 h后，其轉(zhuǎn)錄水平均顯著上調(diào)（Plt;0.05或Plt;0.01），并在低Mg²⁺環(huán)境中誘導(dǎo)12 h后，轉(zhuǎn)錄水平最高（Plt;0.0 圖2 C）。隨后，測定了牛種布魯氏菌S2308、S2308ΔmgtC、S2308ΔmgtC（pBBR1MCS-mgtC）在高/低Mg²⁺環(huán)境中的生長曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在高Mg²⁺環(huán)境中，三株菌株在生長速度上均沒有明顯差異（Pgt;0.05，圖2 D）;在低Mg²⁺環(huán)境中，S2308ΔmgtC的生長速度明顯小于親本及回補菌株（Plt;0.0 圖2 E）。因此，mgtC基因是牛種布魯氏菌S2308應(yīng)對低Mg²⁺環(huán)境的關(guān)鍵基因。

2.3 MgtC通過維持菌體ATP的正常水解供能來影響牛種布魯氏菌S2308在低Mg²⁺環(huán)境中生長代謝

為探討MgtC在低Mg²⁺環(huán)境中影響牛種布魯氏菌生長代謝的機制，分別提取在低Mg²⁺環(huán)境下誘導(dǎo)的S2308、S2308ΔmgtC的RNA，隨后進行轉(zhuǎn)錄組分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與親本株S2308相比，在低Mg²⁺環(huán)境中S2308ΔmgtC的糖ABC轉(zhuǎn)運蛋白底物結(jié)合蛋白（sugar ABC transporter substrate-binding protein）顯著上調(diào)，磷酸腺苷蛋白（ATP-binding protein）顯著下調(diào)，其他基因（包括毒力基因等）的表達差異不顯著（圖3A、B）。將差異基因進行GO分析，發(fā)現(xiàn)差異基因大都與本身組分有關(guān)（圖3C）。綜上所述，在低Mg²⁺環(huán)境中牛種布魯氏菌MgtC可能主要參與糖蛋白的轉(zhuǎn)運和調(diào)控菌內(nèi)ATP水解供能的過程。

上述研究證明，MgtC對于牛種布魯氏菌S2308在低Mg²⁺環(huán)境下的生長至關(guān)重要，并且其主要可能參與菌內(nèi)ATP水解供能的調(diào)控。為驗證上述猜想，分別檢測S2308、S2308ΔmgtC、S2308ΔmgtC（pBBR1MCS-mgtC）三株菌株中在高/低Mg²⁺環(huán)境中ATP的含量。發(fā)現(xiàn)在高Mg²⁺環(huán)境中，S2308ΔmgtC的ATP含量與親本株和回補株無顯著差異（圖3D）；而在低Mg²⁺環(huán)境中，S2308ΔmgtC菌株的ATP含量明顯高于親本和回補株（圖3D），說明缺失株在低Mg²⁺環(huán)境中菌體內(nèi)的ATP無法被催化釋放能量。綜上所述，說明mgtC不僅是牛種布魯氏菌抵抗低Mg²⁺環(huán)境的重要基因，同時也是催化ATP釋放能量以保證細菌維持正常生長代謝的重要基因。

2.4 MgtC參與牛種布魯氏菌抵抗氧化應(yīng)激

為了探究牛種布魯氏菌S2308中MgtC在抵抗吞噬溶酶體內(nèi)部應(yīng)激環(huán)境中發(fā)揮的重要作用，作者模擬了相應(yīng)的壓力環(huán)境，分別檢測了S2308、S2308ΔmgtC、S2308ΔmgtC（pBBR1MCS-mgtC）在不同壓力環(huán)境中的存活率。

分別使用終濃度為5.0和2.5 mmol·L^-1的過氧化氫來評估牛種布魯氏菌抵抗氧化應(yīng)激的能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與親本和回補株相比，缺失株S2308ΔmgtC在濃度為5.0和2.5 mmol·L^-1的過氧化氫環(huán)境中的存活率顯著降低，表明 MgtC有助于牛種布魯氏菌抵抗氧化應(yīng)激環(huán)境（圖4 A）。

另外，使用pH=5.5和pH=4.5的TSB、25℃培養(yǎng)箱、42℃培養(yǎng)箱、0.4 mmol·L^-1鐵螯合劑（2-2聯(lián)吡啶）、0.5 mmol·L^-1硝普鈉分別模擬了酸性環(huán)境、極端溫度環(huán)境、低鐵壓力環(huán)境、亞硝化壓力環(huán)境，評估牛種布魯氏菌在這些壓力環(huán)境中的存活能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：S2308ΔmgtC在酸性環(huán)境、極端溫度環(huán)境、低鐵壓力環(huán)境、亞硝化壓力環(huán)境中的存活能力與親本株和回復(fù)株沒有顯著差異，表明MgtC對于牛種布魯氏菌抵抗上述壓力環(huán)境無關(guān)（圖4B、4C）。

2.5 牛種布魯氏菌利用MgtC抵抗陽離子殺菌肽的殺傷

使用終濃度為1 mg·mL^-1多黏菌素B模擬抵抗殺菌因子環(huán)境，評估牛種布魯氏菌的抗菌肽耐受性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與親本株和回復(fù)株相比，S2308ΔmgtC在濃度為1 mg·mL^-1多黏菌素B環(huán)境中存活率明顯降低（圖5），表明 MgtC參與布魯氏菌抵抗陽離子殺菌肽的殺傷。

2.6 MgtC參與牛種布魯氏菌生物被膜的形成

生物被膜（biofilm， BF）作為病原菌抵御藥物和免疫系統(tǒng)殺傷的有效物理屏障，對細菌的生長具有重要意義。因此，測定了牛種布魯氏菌生物被膜的形成能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：再培養(yǎng)48 h后，S2308ΔmgtC的生物被膜形成能力與親本和回補株并無顯著差異；在培養(yǎng)96 h后，S2308ΔmgtC的生物被膜形成能力顯著低于親本和回補株，表明 MgtC參與了牛種布魯氏菌生物被膜的形成（圖6）。

2.7 MgtC不影響牛種布魯氏菌的胞內(nèi)存活能力和對小鼠的致病性

為了探究MgtC對于牛種布魯氏菌毒力的影響，分別用巨噬細胞和小鼠模型進行毒力評估。分別用S2308、S2308ΔmgtC、S2308ΔmgtC（pBBR1MCS-mgtC）感染巨噬細胞RAW264.7，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在感染1、4、24、48、96 h后，S2308ΔmgtC的胞內(nèi)存活的CFU與親本株和回復(fù)株沒有顯著差異（圖7A），表明MgtC與牛種布魯氏菌的胞內(nèi)存活能力無關(guān)。隨后建立的BALB/c小鼠感染模型，分別以1×106 CFU·mL^-1的劑量感染小鼠，在感染2、4、6、8周后分別取脾進行定植量的測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在感染2、4、6、8周后，S2308ΔmgtC的脾載菌量與親本株和回復(fù)株沒有顯著差異（圖7 B），表明MgtC與牛種布魯氏菌對小鼠的致病性無關(guān)。

3 討 論

牛種布魯氏菌是一種胞內(nèi)寄生菌，毒力主要體現(xiàn)于其胞內(nèi)存活能力^［23］。牛種布魯氏菌入侵細胞后，形成布氏小體（BCV），通過多種因子協(xié)同作用幫助牛種布魯氏菌突破胞內(nèi)多種壓力環(huán)境，如酸性環(huán)境、營養(yǎng)匱乏環(huán)境、低Mg²⁺環(huán)境等，使BCV移行至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進行復(fù)制^［24］。其中，MgtC是細菌適應(yīng)低Mg²⁺環(huán)境的關(guān)鍵因子^［25］。據(jù)報道在沙門菌、結(jié)核分枝桿菌、鼠疫耶爾森菌等胞內(nèi)寄生菌中，MgtC不僅有助于細菌適應(yīng)低Mg²⁺環(huán)境，還能夠影響細菌的毒力^［26］。本研究成功構(gòu)建了牛種布魯氏菌mgtC基因的缺失株用于探究牛種布魯氏菌MgtC的生物學(xué)功能（圖1A～E），為深入了解牛種布魯氏菌提供了數(shù)據(jù)支撐。

Mg²⁺是多種生物學(xué)過程所必需的金屬離子，也是Mg²⁺是一種細胞外信號^［27］。在Mg²⁺匱乏環(huán)境中，會直接激活許多因子的表達^［28］。本研究發(fā)現(xiàn)Mg²⁺對于牛種布魯氏菌S2308的生長代謝必不可少，牛種布魯氏菌S2308在低Mg²⁺條件下生長速度明顯降低（圖2A、B），目前在其他胞內(nèi)寄生菌上還沒有類似的報道。此外，本研究表明mgtC基因是牛種布魯氏菌S2308應(yīng)對低Mg²⁺環(huán)境的關(guān)鍵基因（圖2D、E），S2308ΔmgtC在低Mg²⁺環(huán)境中生長速度顯著低于親本菌株，其結(jié)果與鼠疫耶爾森菌MgtC功能一致^［29］。但是牛種布魯氏菌mgtC基因其在低Mg²⁺環(huán)境中的轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢（圖2C），暗示牛種布魯氏菌可能通過調(diào)控mgtC基因表達適應(yīng)低Mg²⁺壓力應(yīng)激環(huán)境。另外，Mg²⁺也是生物體各項酶促反應(yīng)的最重要的輔因子^［30］，其中包括Mg²⁺與ATP之間相互作用。在生物體內(nèi)Mg²⁺通常與ATP偶聯(lián)^［31］，是ATP水解成ADP并釋放能量這一過程中必不可少的重要金屬陽離子。本研究轉(zhuǎn)錄組表明，MgtC可能是通過影響ATP結(jié)合蛋白和ABC蛋白轉(zhuǎn)運系統(tǒng)從而影響牛種布魯氏菌在低Mg²⁺環(huán)境中的生長代謝（圖3A～C），之后通過測定牛種布魯氏菌在高/低Mg²⁺環(huán)境中菌體內(nèi)ATP含量，證明了牛種布魯氏菌MgtC參與ATP正常水解釋放能量的過程（圖3D）。

結(jié)構(gòu)預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，牛種布魯氏菌MgtC具有一個跨膜區(qū)域，說明其也可能參與維持牛種布魯氏菌膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。因H 2O 2 能夠通過膜定位的水通道蛋白進入胞內(nèi)，進而使細胞遭受氧化應(yīng)激^［32］，多黏菌素B常用來測定細菌外膜的穩(wěn)定性并且生物被膜（biofilm， BF）可作為病原菌抵御不良環(huán)境的物理屏障，本研究模擬了相應(yīng)的壓力應(yīng)激條件，發(fā)現(xiàn)mgtC基因不僅參與牛種布魯氏菌抵抗氧化應(yīng)激環(huán)境（圖4A），還參與牛種布魯氏菌抵抗陽離子殺菌肽的殺傷（圖4B）和生物被膜（圖4C）的形成。

MgtC在沙門菌、結(jié)核分枝桿菌、鼠疫耶爾森菌等胞內(nèi)寄生菌中是一種重要的毒力因子^［33］，本研究發(fā)現(xiàn)牛種布魯氏菌MgtC不影響其胞內(nèi)存活能力和對小鼠的致病性（圖5A、B），這與MgtC在其他胞內(nèi)寄生菌（如沙門菌、結(jié)合分枝桿菌、鼠疫耶爾森菌）中的功能不一致。究其原因可能有三點：1）牛種布魯氏菌MgtC可能與其他胞內(nèi)寄生菌MgtC的同源性較低，導(dǎo)致MgtC對布魯氏菌的毒力影響異于對其他胞內(nèi)寄生菌的毒力影響；2）在其他胞內(nèi)寄生菌中，MgtC通過影響其重要毒力因子的表達導(dǎo)致其毒力降低^［34］，本研究轉(zhuǎn)錄組結(jié)果發(fā)現(xiàn)MgtC在低Mg²⁺環(huán)境中并不影響牛種布魯氏菌毒力基因的差異表達（圖3A、C），并且MgtC對于牛種布魯氏菌抵抗酸性環(huán)境并無影響（圖4D），這些結(jié)果支持了MgtC對牛種布魯氏菌的毒力影響不大；3）牛種布魯氏菌可能還存在MgtC以外的功能基因來代償性幫助牛種布魯氏菌抵抗低Mg²⁺環(huán)境，進而保證牛種布魯氏菌的胞內(nèi)存活，這需要進一步的研究。值得一提的是，豬種布魯氏菌的胞內(nèi)存活需要MgtC的^［19］，而牛種布魯氏菌MgtC不影響其胞內(nèi)存活能力，這可能是由于不同種屬布魯氏菌之間存在種間差異。

4 結(jié) 論

本研究通過構(gòu)建牛種布魯氏菌 S2308ΔmgtC基因缺失株，初步探討了MgtC在牛種布魯氏菌中的生物學(xué)功能。研究表明，在低Mg²⁺環(huán)境中MgtC維持細菌ATP正常水解釋放能量來維持自身正常生理活動，此外還參與維持細菌膜結(jié)構(gòu)的完整性，幫助牛種布魯氏菌抵抗氧化應(yīng)激、抵抗陽離子殺菌肽的殺傷，但是MgtC對牛種布魯氏菌的毒力沒有明顯影響。本研究為進一步揭示MgtC在牛種布魯氏菌中的功能和對布魯氏菌的致病作用提供了參考和方向，具有重要意義。

5 致 謝

感謝中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項 （2023-YWF-ZYSQ-05）、“十四五”國家重點研發(fā)計劃 （2023YFD1800703）以及中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項目（CAAS-CSLPDCP-202403）對本研究的支持。

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（編輯 白永平）