摘 要： 為實現對鴿圓環(huán)病毒（pigeon circovirus，PiCV）的快速檢測，建立了針對Cap基因的PiCV熒光定量PCR檢測方法，并應用該方法進行PiCV分子流行病學調查。本研究針對PiCV核衣殼蛋白Cap基因的保守序列設計一對特異性引物，并通過優(yōu)化反應條件，成功建立了熒光定量PCR檢測方法。此外，還對該方法的靈敏度、特異性、重復性進行了全面評估。利用建立的熒光定量PCR方法對華北和西北部分地區(qū)147份臨床樣本進行檢測，并對陽性代表樣本的Cap全長序列進行遺傳演化分析。結果表明，所建立的熒光定量PCR方法在1×104至1×108拷貝·μL^-1范圍內顯示出良好的線性關系，最低檢測限達到1×101拷貝·μL^- 顯著高于傳統(tǒng)PCR方法。此方法具有良好的重復性，且不與其他常見鴿病病原產生交叉反應。采用本試驗方法檢測的147份華北和西北部分地區(qū)肉鴿和信鴿臨床樣本PiCV陽性率為85.0%，陽性樣本的Cap全長序列分析及遺傳演化分析結果顯示，6株分離株相似性在89.8%～97.5%之間，與PiCV HeBeiTS2021株在同一個分支，親緣關系較近。建立的PiCV熒光定量PCR方法具備靈敏、特異和穩(wěn)定等優(yōu)點，可用于PiCV的快速檢測，同時流行病學調查結果表明，2022—2023年華北和西北部分地區(qū)PiCV感染率較高，為我國PiCV的防控研究提供數據支撐。

關鍵詞： 鴿圓環(huán)病毒；Cap基因；熒光定量PCR；分子流行病學；遺傳演化分析

中圖分類號： S852.659.2"""" 文獻標志碼：A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）01-0335-08

收稿日期：2024-02-27

基金項目：現代農業(yè)產業(yè)技術體系北京市家禽創(chuàng)新團隊（BAIC06-2024）；北京市農林科學院科技創(chuàng)新能力建設專項（KJCX20220422）

作者簡介：王星月（1999-），女，北京人，碩士生，主要從事畜禽疫病診斷與防治研究，E-mail：idwxy99@163.com；楊志遠（1988-），男，山西忻州人，副研究員，主要從事畜禽疫病診斷與防治研究，E-mail：yangzy88@126.com。王星月和楊志遠是同等貢獻作者

*通信作者：胡 格，主要從事家禽疫病防控研究，E-mail：bnhuge@126.com

Development and Application of a Real-time Fluorescence Quantitative PCR Detection Method for

Pigeon Circovirus

WANG" Xingyue YANG" Zhiyuan2， LIN" Jian2， ZHANG" Zixuan ZHOU" Yuting

CHENG" Huimin2， LIU" Yuehuan2， HU" Ge^1*

（1.College of Animal Science and Technology， Beijing University of Agriculture，

Beijing 102206，" China;

2.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，

Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences， Beijing 100097，" China）

Abstract： "The aim of this study was to establish a rapid diagnostic method of pigeon circovirus （PiCV）， a real-time quantitative PCR based on Cap gene was established and a molecular epidemiological investigation on PiCV was conducted. Specific primers targeting the conserved sequence of the Cap gene of PiCV were designed and synthesized. The sensitivity， specificity， and repeatability of the developed quantitative PCR method （qPCR） were evaluated. One hundred and forty-seven clinical samples from Northern and Northwest China were detected by the qPCR， followed by genome sequencing and phylogenetic analysis on whole length of Cap gene of isolates from different regions. The established qPCR method showed a good linear response for PiCV standards ranging from 1×104 to 1×108 copies·μL^- with a minimum detection limit as low as 1×101 copies·μL^- substantially surpassing conventional PCR. The intra-assay and inter-assay demonstrated a good repeatability. Importantly， there was no cross-reactivity with other pigeon pathogens. Detection results of 147 clinical samples collected from Northern and Northwest China by this method showed that the positive rate for PiCV was 85.0%. Sequencing results and phylogenetic analysis revealed that Cap gene of six isolates shared homology within the range of 89.8% to 97.5%， and were closely related to PiCV HeBeiTS2021 isolate. The established real-time quantitative PCR method for PiCV demonstrated sensitivity， specificity and repeatability， making it available for rapid detection of PiCV. Epidemiological investigation results indicated a higher PiCV infection rate in Northern and Northwest China during 2022-2023， providing valuable data for prevention and control of PiCV.

Key words： pigeon circovirus; Cap gene; real-time fluorescence quantitative PCR; molecular epidemiology; phylogenetic analysis

*Corresponding author："" HU Ge， E-mail： bnhuge@126.com

近年來隨著我國養(yǎng)鴿業(yè)的發(fā)展，各種病毒的感染率呈明顯上升趨勢，包括鴿副黏病毒I型（pigeon paramyxovirus type I，PPMV-1）、鴿腺病毒（pigeon adenovirus，PiAdV）、鴿痘病毒（pigeonpox virus，PPV）、鴿皰疹病毒（pigeon herpesvirus，PiHV）以及鴿圓環(huán)病毒（pigeon circovirus，PiCV）等^［1］。PiCV于1986年加拿大首次報道，隨后澳大利亞以及美國加州先后發(fā)現鴿感染圓環(huán)樣病毒^［2-3］，在2005年PiCV被正式歸列于圓環(huán)病毒屬。該病毒呈球形，無囊膜，基因組長約2.0 kb左右，為單鏈環(huán)狀DNA^［4-6］。PiCV含有兩個主要開放閱讀框（ORFs），分別為V1和C1。其中V1編碼與病毒復制相關的Rep蛋白，C1則編碼唯一的結構蛋白Cap^［7-8］。通過序列差異分析，發(fā)現Cap基因較Rep基因更易頻繁突變^［9］。

PiCV的感染被歸類于免疫系統(tǒng)疾病，會增加繼發(fā)性感染的風險，繼發(fā)感染后鴿一般表現嗜睡、水樣便、厭食、嘔吐、腹瀉、呼吸性疾病等^{［4，10］}。到目前為止PiCV以及其他禽類圓環(huán)病毒還尚未成功在體外分離，這一局限性對于PiCV的致病機理研究產生了一定的影響^［11-12］。

目前，PiCV常用的實驗室檢測方法包括傳統(tǒng)聚合酶鏈式反應（PCR）、DNA探針原位雜交法（ISH）、斑點雜交法（DHD）以及鏡檢法等^［12-13］。相比傳統(tǒng)PCR檢測方法，SYBR Green I熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）具有快速定性定量、靈敏特異的優(yōu)點，且該方法對PiCV的病毒載量測定能夠良好監(jiān)測鴿感染病毒情況。本研究目的是建立基于PiCV核衣殼蛋白Cap編碼基因的SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法，并以此方法檢測2022—2023年我國華北和西北部分地區(qū)臨床樣本PiCV的陽性率，并對陽性代表樣本進行遺傳演化分析，以期為我國PiCV的流行情況提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 PiCV核酸陽性病料與臨床樣本

PiCV核酸陽性病料與2022—2023年間來自北京市、新疆維吾爾自治區(qū)、河北省、陜西省、內蒙古自治區(qū)、山西省、甘肅省健康鴿與病鴿的147份臨床樣本由北京市農林科學院畜牧獸醫(yī)研究所動物疫病室保存。

1.1.2 特異性研究用病原核酸

PPMV-1（cDNA）、PiAdV-A、PPV及鴿鸚鵡熱衣原體（Chlamydia psittaci，Cps）核酸，由北京市農林科學院畜牧獸醫(yī)研究所動物疫病室保存。

1.1.3 主要試劑

Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，Premix Taq^TM、TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver5.0購自寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司，Q5 "High-Fidelity 2× Master Mix購自 New England Biolabs。

1.2 方法

1.2.1 引物設計

根據NCBI中登錄的PiCV基因序列信息（GenBank：MW181934.1），針對其Cap基因保守區(qū)域設計一對特異性引物用于鑒定PiCV，命名為CV-F、CV-R，目的片段大小為530 bp。參照本試驗所測得的PiCV Cap基因序列設計熒光定量PCR引物，命名為qCap-F、qCap-R，長度為158 bp。設計一對特異性引物（Cap-F、Cap-R）用于擴增Cap基因，擴增長度為911 bp，序列信息詳見表1。以上引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 質粒標準品構建

取發(fā)病鴿肺臟組織勻漿上清0.2 mL，按照TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver5.0提取核酸。使用引物CV-F、CV-R進行PCR擴增。PCR擴增程序：94℃ 2min；94℃ 30s，55℃ 45s，72℃ 40s，35個循環(huán)；72℃ 10min。其擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測到有目的條帶后，將此PCR產物送往生工生物工程（上海）股份有限公司純化測序，測序結果經Blast鑒定其是否為目的基因序列。在序列的5＇端和3＇端分別引入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點，連接至pUC57載體，構建質粒標準品pUC57-Cap。測定重組質粒標準品濃度后根據公式“拷貝數（copies·μL^-1）=（6.02×10²³）×［質量濃度（ng·μL^-1）×10^-9］/（DNA length×660）”換算得標準品拷貝數。

1.2.3 標準曲線的建立

將pUC57-Cap標準質粒依次進行10倍系列稀釋，以1×104～1×108拷貝·μL^-1的5個質粒標準品為模板，每個稀釋度做3個平行重復，同時以ddH 2O為陰性對照。按已優(yōu)化的反應程序及體系進行擴增，其反應程序為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，64℃ 30 s，40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，以得到標準曲線和熔解曲線。

1.2.4 熒光定量PCR檢測方法的評價

1.2.4.1 靈敏度試驗：

取7個標準品（1×101～1×107拷貝·μL^-1）進行10倍系列稀釋并做3個平行重復，以ddH 2O為陰性對照。按優(yōu)化好的反應體系與條件分別進行熒光定量PCR和常規(guī)PCR反應，以可檢測出最高稀釋倍數標準品為檢測下限評定靈敏度。

1.2.4.2 特異性試驗：

按照上述方法，取Cps、PPV、PiAdV-A、PPMV-1（cDNA）陽性核酸，進行特異性試驗，同時設置pUC57-Cap為陽性對照，ddH 2O為陰性對照，根據Ct值及熔解曲線Tm值評價本研究建立的檢測方法的特異性。

1.2.4.3 重復性試驗：

取5個標準品（1×103～1×107拷貝·μL^-1）為模板，進行組內重復性試驗。在不同時間同一反應條件進行3次反應，為組間重復性試驗。計算標準偏差和變異系數。

1.2.5 臨床樣本檢測

為評定本試驗建立的qPCR檢測方法在臨床樣本檢測中的可靠性，以2022—2023年來自華北和西北部分地區(qū)共147份臨床樣本（腦組織4份，腎臟11份，肺臟38份，肝臟82份，脾臟9份，心臟2份，咽拭子1份）作為試驗樣品（詳細信息見結果“2.7”），提取病毒基因組，分別使用熒光定量PCR和常規(guī)PCR進行檢測，比較兩種方法的陽性檢出率和符合率。

1.2.6 Cap基因遺傳演化分析

挑選各地區(qū)陽性樣品核酸，以Cap-F、Cap-R為引物，進行PCR擴增。反應體系為：Q5 "High-Fidelity 2× Master Mix 12.5 μL，F/R各1.25 μL，模板 1μL，ddH 2O補足至25 μL。反應條件：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 2 min。擴增經電泳鑒定與目的片段大小一致后，將PCR產物送往生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定。運用MEGA11對測得的序列與參考序列（表2）一同繪制遺傳演化樹并進行同源性比較，其中遺傳演化樹采用鄰接法（Neighbor-Joining Method），Bootstrap設置1 000次重復。

2 結 果

2.1 PCR擴增Cap基因及質粒構建

以PiCV基因組為模板使用引物CV-F、CV-R進行PCR擴增。所得目的片段大小為530 bp，并經測序后，確定為PiCV Cap基因序列。構建質粒后，通過質粒PCR驗證，證明成功構建質粒標準品。

2.2 標準曲線的建立

經退火溫度的優(yōu)化，以質粒標準品為模板進行試驗。得到的熒光定量標準曲線（圖1A）間距均勻，標準曲線Slope為-3.305，R2值為 擴增效率為100.711。表明標準曲線在1×104～1×108拷貝·μL^-1范圍內與Ct值之間有良好線性關系。

2.3 熔解曲線

標準質粒的SYBR Green I熒光定量PCR擴增結果，如圖1B所示，熔解曲線在85.5℃為單一峰，表明無非特異性擴增及引物二聚體出現，該引物具有良好的特異性。

2.4 靈敏度試驗

以10倍系列稀釋的7個質粒標準品（1×101～1×107拷貝·μL^-1）進行靈敏度試驗，分別進行熒光定量PCR和普通PCR擴增。本試驗建立的PiCV熒光定量PCR檢測方法的最低檢測限為1×101拷貝·μL^- Ct值為33.9 普通PCR最低檢出量為1×103拷貝·μL^-1?？梢姡瑹晒舛縋CR方法靈敏度是普通PCR的100倍。

2.5 特異性試驗

應用已建立的熒光定量PCR檢測方法，分別對Cps、PPV、PiAdV-A、PPMV-1（cDNA）和PiCV核酸陽性樣品進行熒光定量檢測。結果僅PiCV陽性樣品檢測結果為陽性，Cps、PPV、PiAdV-A、PPMV-1（cDNA）核酸陽性樣品以及陰性對照均為陰性，表明本試驗建立的qPCR方法特異性良好。

2.6 重復性試驗

以5個稀釋度標準品為模板，進行組內和組間"" 重復性試驗。通過Ct值的平均值和標準偏差，計算每個稀釋度的變異系數。結果組內變異系數在0.036%～0.994%之間，組間變異系數在1.185%～2.090%之間，組內、組間標準偏差均小于0.5。表明該方法的重復性和穩(wěn)定性較好。

2.7 臨床樣本檢測

臨床樣本檢測結果如表3，常規(guī)PCR陽性檢測率為66.7%（98/147），熒光定量PCR陽性檢測率為85.0%（125/147）。常規(guī)PCR檢測結果為陽性的樣本用本試驗建立的熒光定量PCR方法檢測后，結果均為陽性，且總體符合率為81.6%（表4）。結果表明，該熒光定量PCR方法靈敏度較高。

2.8 Cap基因遺傳演化分析

將獲得的Cap基因序列命名并將序列上傳至NCBI，與28株國內外PiCV毒株的Cap基因全長序列一同繪制遺傳演化樹并進行核苷酸同源性比較。綜合兩者結果顯示（圖2），已構建的遺傳演化樹分為兩個主要分支，本研究測得的6條序列均在同一個主要分支內，相似性為89.8%～97.5%，與PiCVHeBeiTS2021株親緣關系最近。6條序列與鴿源參考序列相似性為66.8%～90.7%，并且與其他非鴿源的圓環(huán)病毒親緣關系均較遠。

3 討 論

PiCV最早報道于20世紀80年代，隨后在許多歐洲和北美洲國家以及澳大利亞和南非等其他國家蔓延分布?，F如今鴿產業(yè)快速發(fā)展，導致市場上對優(yōu)良品種選擇的需求增加，國際間引進輸出優(yōu)良品種，致使各種病毒廣泛傳播，加速了PiCV的流行^［4］。

于2000年初，Mankertz等^［14］首次報道了PiCV的全基因組序列，這為后續(xù)學者檢測PiCV起到了先導開端作用，隨后很快跟進了特異性PCR技術、ISH和DHD^［15-16］。ISH和DHD耗時長，操作復雜，而常規(guī)PCR方法敏感性低，無法準確定量病毒載量低的樣本。直至今日，高通量測序是最先進的PiCV檢測技術，但其成本昂貴、耗時長的缺點同樣不適用于快速診斷分析^［4，9］，而靈敏、快速、可檢動態(tài)范圍寬的熒光定量PCR方法能夠解決以上問題。近幾年，多名學者建立了PiCV的熒光定量PCR檢測方法的研究。國外學者Nath等^［13］以Rep基因建立了TaqMan 探針法，其最低檢測限為2拷貝·μL^- 組內和組間變異系數分別低于0.78%和2.87%。國內學者亓玉卓等^［17］與郭學波等^［18］分別以Rep基因建立了SYBR Green I染料法與TaqMan 探針法，在最佳反應條件下，兩種方法最低檢測限分別為143和21拷貝·μL^- 前者組內組間變異系數均低于0.8%，后者組內和組間變異系數分別低于1%和2%。韓曉語等^［11］以Cap基因建立的SYBR Green I染料法最低檢測限為100拷貝·μL^- 組內組間變異系數均低于2%。李曉波等^［7］以polymerase基因建立的TaqMan 探針法最低檢測限為34.8拷貝·μL^- 組內和組間變異系數分別低于1.63%和7.23%。以上建立的5種PiCV檢測方法與常見鴿源病原的檢測結果也表明具有較好的特異性。本研究建立的方法組內重復性良好，變異系數低于1%，組間變異系數低于2.1%，靈敏度高，最低可檢測到10拷貝·μL^-1核酸，相比韓曉語所建立的相同方法更靈敏，相比探針法具有成本低、操作便捷等優(yōu)勢。

近十年來，國內外均有報道PiCV的感染情況。Zhang等^［19］在2011年和2014年檢測了中國東部5個省份中健康鴿與患病鴿PiCV感染情況，結果顯示，2011年30份健康鴿與88份患病鴿樣本陽性率分別為56.7%、77.3%；2014年38份健康鴿與94份患病鴿樣本陽性率分別為60.5%、80.9%^［10］。2016—2019年間王浩然^［4］檢測來自北京、陜西、河北、內蒙古等11個?。▍^(qū)）的571份無臨床癥狀賽鴿血清樣本以及51份患病賽鴿組織，PiCV總陽性率為19.3%，病鴿陽性率為27.4%，無臨床癥狀賽鴿陽性率為18.6%。在國外，波蘭、澳大利亞、土耳其以及匈牙利均報道鴿感染PiCV^［20-23］。本試驗所收集的2022至2023年華北和西北部分地區(qū)147份臨床樣本，多數來自病鴿，使用本試驗建立的檢測方法檢測PiCV總陽性率高達85.0%（125/147）。綜合2011年至今的流行病學調查來看，鴿的PiCV感染情況仍不容小覷，病鴿檢出PiCV的陽性率依然很高。

通過對2022—2023年我國華北和西北部分地區(qū)陽性樣品Cap基因序列的分析，顯示所測得6條序列與PiCV HeBeiTS2021株親緣關系最近，相似性為89.8%～97.5%。與鴿源參考序列相似性為66.8%～90.7%，與其他非鴿源的圓環(huán)病毒親緣關系均較遠。從進化樹看，本試驗測得的華北以及西北部分地區(qū)PiCV陽性樣本的Cap基因未出現明顯變異。因此引種時建議繼續(xù)做好檢疫，在信鴿賽季期間注意病毒監(jiān)測和預防，飼養(yǎng)人增強生物安全意識。

4 結 論

本研究建立的基于PiCV Cap基因的SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法，特異、靈敏、穩(wěn)定，可應用于PiCV的監(jiān)測及診斷；對2022—2023年我國華北和西北部分地區(qū)PiCV的感染情況進行調查，發(fā)現PiCV感染率較高，應加快開展PiCV防控技術研究。

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（編輯 白永平）