摘 要： 為建立一種豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒（SADS-CoV）血清抗體的快速檢測方法，本研究首先經(jīng)PCR擴增SADS-CoV N基因，純化鑒定后克隆至表達(dá)載體pET-32a（+），構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a-N。重組N蛋白誘導(dǎo)表達(dá)并通過SDS-PAGE和Western blot鑒定后，采用純化的重組N蛋白作為包被抗原，以兔抗豬HRP- IgG作為二抗，利用方陣滴定法優(yōu)化各反應(yīng)條件，建立了一種以SADS-CoV N蛋白為靶標(biāo)的檢測SADS-CoV血清抗體的間接ELISA方法，并對此方法的敏感性、特異性、重復(fù)性及臨床應(yīng)用價值進行鑒定。SDS-PAGE及Western blot結(jié)果顯示，重組表達(dá)的N蛋白約為70 ku，且具有良好的反應(yīng)原性。采用該方法檢測SADS-CoV陽性血清抗體效價可達(dá)1∶3 200，并且與豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬丁型冠狀病毒（PDCoV）、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）、豬輪狀病毒（PoRV）和豬圓環(huán)病毒（PCV）陽性血清均無交叉反應(yīng)，具有良好的敏感性和特異性。批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗的變異系數(shù)均小于10%，具有較好的重復(fù)性。利用該方法和間接免疫熒光方法（IFA）分別對50份豬臨床血清樣品進行檢測，結(jié)果顯示二者的總符合率為98%。綜上，本研究建立了一種基于SADS-CoV N蛋白的間接ELISA抗體檢測方法，可用于臨床SADS-CoV血清抗體檢測以及流行病學(xué)的監(jiān)測，對防控SADS-CoV的流行具有重要意義。

關(guān)鍵詞： 豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒（SADS-CoV）；N蛋白；原核表達(dá)；間接ELISA

中圖分類號： S852.659.6nbsp;""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）01-0319-08

收稿日期：2024-02-28

基金項目：國家自然科學(xué)基金區(qū)域創(chuàng)新發(fā)展聯(lián)合基金（U23A20236）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項（1610302022015）

作者簡介：曾苗苗（2000-），女，河南周口人，碩士生，主要從事豬腸道冠狀病毒研究，E-mail：18790286972@163.com

*通信作者：石 達(dá)，主要從事獸醫(yī)微生物及其分子生物學(xué)研究，E-mail：shida@caas.cn；馮 力，主要從事獸醫(yī)微生物及其分子生物學(xué)研究，E-mail：fengli@caas.cn

Establishment and Preliminary Application of an Indirect ELISA for Swine Acute Diarrhea

Syndrome Coronavirus N Protein

ZENG" Miaomiao， YANG" Xiaoman， ZHANG" Xin， LIU" Dakai， SHI" Hongyan， ZHANG" Jiyu，

ZHANG" Liaoyuan， CHEN" Jianfei， FENG" Tingshuai， LI" Xiuwen， SHI" Da*， FENG" Li*

（State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention， Harbin Veterinary Research Institute，

Chinese Academy of Agricultural Sciences， Harbin 150069，" China）

Abstract： "To establish a rapid detection method for swine acute diarrhea syndrome coronavirus （SADS-CoV） serum antibodies， N gene was amplified by PCR， and then the purified fragment was cloned into pET-32a （+） prokaryotic expression vector to construct the recombinant plasmid pET-32a-N. The expression of recombinant N protein was determined by SDS-PAGE and western blot. The purified recombinant N protein was applied as the coating antigen. Rabbit anti-pig HRP-IgG was used as the secondary antibody. We used the square-array titration to optimize the reaction conditions of the indirect ELISA method targeting SADS-CoV N protein antibodies. In addition， we identified the sensitivity， specificity and repeatability of this method， and evaluated its clinical applicability. SDS-PAGE and western blot results showed that the recombinant N protein was about 70 ku and had good reactivity. The antibody titer of SADS-CoV positive serum detected by this method was 1： 3 200， and there was no cross reaction with PEDV， TGEV， PDCoV， PRRSV， PoRV or PCV positive pig serum， which exhibited good sensitivity and specificity. The coefficient of variation of intra-batch and inter-batch repeatability tests were both less than 10%， demonstrating favorable reproducibility of this method. Fifty randomly selected porcine clinical serum samples were tested by ELISA and immunofluorescence assay， and the coincidence rate of results was 98%. In conclusion， we established an indirect ELISA based on N protein to test SADS-CoV clinical serum antibodies， which is useful for epidemiological surveillance， and is of great significance for prevention and control of SADS-CoV.

Key words： swine acute diarrhea syndrome coronavirus （SADS-CoV）; N protein; prokaryotic expression; indirect ELISA

*Corresponding authors： SHI Da，E-mail：shida@caas. cn；FENG Li，E-mail：fengli@caas. cn

豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒（swine acute diarrhea syndrome coronavirus，SADS-CoV）屬于套式病毒目冠狀病毒科冠狀病毒亞科α冠狀病毒屬成員，于2017年首次在中國廣東省清遠(yuǎn)地區(qū)被發(fā)現(xiàn)^［1］，其特征主要為急性嘔吐和水樣腹瀉，最終因體重急劇減輕而導(dǎo)致死亡，5日齡以內(nèi)的仔豬病死率可達(dá)到90%以上^［2］，成年母豬感染后臨床癥狀較輕微，大多數(shù)母豬感染后2 d內(nèi)即可恢復(fù)。組織病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，感染仔豬表現(xiàn)為空腸、回腸明顯病變，小腸絨毛嚴(yán)重萎縮和脫落。

SADS-CoV是一種單股正鏈RNA病毒，基因組全長約27 kb，與蝙蝠冠狀病毒HKU2親緣關(guān)系密切，核苷酸同源性超過90%，基因組結(jié)構(gòu)從5′端到3′端依次為開放閱讀框（open reading frame，ORF）1a和1b、纖突蛋白（spike，S）、輔助蛋白NS3a、小膜蛋白（envelope，E）、膜蛋白（membrane，M）、核衣殼蛋白（nucleocapsid，N）以及輔助蛋白NS7a和NS7b^［3-4］。SADS-CoV N蛋白可以與病毒RNA形成核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）復(fù)合物，在病毒裝配及轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮著重要的作用。此外，N蛋白能夠抑制宿主Ⅰ型干擾素的表達(dá)，進而拮抗宿主的天然免疫系統(tǒng)，促進病毒的復(fù)制^［5-6］。N蛋白的免疫原性強，在不同毒株之間高度保守，且在病毒感染過程中大量表達(dá)，因此常作為病毒診斷的首選蛋白。

相關(guān)研究報道，SADS-CoV在體外具有對多個物種細(xì)胞的感染嗜性，并可感染多種人類呼吸道和腸道原代細(xì)胞，這表明該病毒具有跨物種傳播給人類的潛在威脅^［7］。因此，除了嚴(yán)格的生物安全措施外，開發(fā)一種快速、靈敏的方法監(jiān)測豬群中SADS-CoV的流行對阻斷該病毒的流行至關(guān)重要。由于SADS-CoV與PEDV、TGEV和PDCoV同屬于冠狀病毒，且感染仔豬后可引起相似的臨床癥狀，而病原的鑒別診斷是疫病防控的關(guān)鍵，因此快速靈敏地鑒別檢測這幾種腹瀉病原尤為重要。迄今為止，SADS-CoV感染的診斷方法主要依賴于病毒核酸檢測，例如采用基于TaqMan的實時定量RT-PCR^［8］、實時逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法（RT-LAMP）^［9］、基于SYBR-green的實時定量RT-PCR^［10］、基于TaqMan探針的多重實時定量PCR^［11-12］、微流控RT-LAMP芯片^［13］、新型逆轉(zhuǎn)錄液滴式數(shù)字PCR^［14］、多重RT-LAMP聯(lián)合CRISPR/Cas12a^［15］等方法。SADS-CoV的血清學(xué)診斷方法報道較少，最常見的SADS-CoV血清學(xué)檢測方法是間接免疫熒光法（IFA）和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）。PCR檢測主要針對病毒核酸，其靈敏度很大程度上取決于樣品的質(zhì)量和引物的特異性，且需要昂貴的儀器；IFA檢測需要針對抗原的特異性抗體和熒光標(biāo)記抗體，過程耗時耗力且程序繁雜；ELISA因其操作簡單、特異性強、靈敏度高等特點，廣泛應(yīng)用于現(xiàn)地檢測和疫苗評價^［16］。冠狀病毒N蛋白具有較高的免疫原性和保守性，是開發(fā)血清學(xué)方法的理想抗原。因此，本研究以SADS-CoV N蛋白作為包被抗原，建立了檢測SADS-CoV特異性抗體的間接ELISA方法，為臨床監(jiān)測SADS-CoV流行情況提供有效的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料及實驗動物

SADS-CoV由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)馬靜云教授惠贈，PEDV、TGEV、PDCoV、PRRSV、PoRV和PCV的陽性血清以及pET-32a（+）載體均由本實驗室保存。50份臨床待檢豬血清樣品，采自黑龍江省不同市（縣）的5家豬場。SADS-CoV N蛋白單克隆抗體（MAb）由本實驗室制備并保存；HRP標(biāo)記的兔抗豬IgG（HRP-IgG）購自Sigma公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；E. coli DH5α及E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞、限制性內(nèi)切酶Kpn Ⅰ與EcoRⅠ購自寶生物工程（大連）有限公司；ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit購自南京諾唯贊生物科技公司；E.Z.N.A. "Gel Extraction Kit購自O(shè)mega公司；DL2000 DNA Marker、蛋白Marker、羊抗鼠IgG（H+L）-DyLight^TM 800等均購自賽默飛世爾科技公司；Alexa Fluor^TM 594羊抗鼠IgG購自Invitrogen公司；96孔酶標(biāo)板購自康寧生物科技有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂糖均購自天根生化科技（北京）有限公司；雙組分TMB顯色液購自TaKaRa公司。

1.2 pET-32a-N重組質(zhì)粒的構(gòu)建

結(jié)合pET-32a（+）載體的多克隆酶切位點設(shè)計合成SADS-CoV N基因同源重組的特異性引物，上游引物F：5′-ACAGCCCAGATCTGGGTACCAT-GGCCACTGTTAATTGGGGTG-3′，下游引物R：5′-GACGGAGCTCGAATTCCTAATTAATAAT-CTCATCCACCATCTCAACCTCC-3′，下劃線分別為Kpn Ⅰ與EcoRⅠ酶切位點，由吉林省庫美生物科技有限公司合成。引物合成后經(jīng)PCR擴增N基因片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后與pET-32a（+）載體連接，經(jīng)PCR鑒定并測序正確后重組質(zhì)粒命名為pET-32a-N。

1.3 pET-32a-N的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及鑒定

將重組質(zhì)粒pET-32a-N轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）表達(dá)感受態(tài)中，37 ℃、220 r·min^-1培養(yǎng)，待菌液OD 600 nm值為0.6時，加入終濃度為1 mmol·L^-1的IPTG，于16 ℃誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)5 h后12 000 r·min^-1離心5 min收集菌液沉淀，適量的PBS洗滌后，加入細(xì)菌裂解液重懸沉淀，進行超聲處理10 min（超聲3 s，停3 s），超聲后12 000 r·min^-1離心20 min，分別收集上清和沉淀，加入適量PBS溶解沉淀。取適量樣品加入SDS-PAGE上樣緩沖液煮樣15 min，進行SDS-PAGE鑒定。pET-32a-N蛋白成功表達(dá)后，按上述確定的蛋白表達(dá)條件擴大培養(yǎng)，利用Ni層析介質(zhì)（NTA）重力預(yù)裝柱摸索蛋白純化的條件大量純化蛋白，并測定純化后的蛋白濃度。將純化的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，以鼠SADS-CoV N MAb 3E9（1∶1 000）為一抗，以羊抗鼠IgG（H+L）-DyLight^TM 800（1∶10 000）為二抗，對純化的重組N蛋白進行Western blot鑒定。

1.4 ELISA方法的建立及條件優(yōu)化

依據(jù)方陣滴定法，確定間接ELISA N蛋白最佳包被濃度（1 μg·mL^-1、0.5 μg·mL^-1、0.25 μg·mL^-1、0.125 μg·mL^-1、0.0625 μg·mL^-1）；SADS-CoV血清最佳稀釋度（1∶400、1∶500、1∶600）；酶標(biāo)二抗最佳稀釋度（1∶2 500、1∶5 000、1∶10 000），按照間接ELISA操作程序進行操作，每組試驗設(shè)置3個重復(fù)，在此基礎(chǔ)上分別對封閉液、封閉條件、抗原抗體作用時間、酶標(biāo)二抗的作用時間、底物顯色時間等反應(yīng)條件進行優(yōu)化，建立檢測血清中針對SADS-CoV抗體的間接ELISA方法。

1.5 臨界值的確定

以最佳的ELISA反應(yīng)條件檢測32份SADS-CoV陰性樣品的OD 450 nm值，每組試驗設(shè)置3個重復(fù)，讀取各孔OD 450 nm值后計算OD 450nm平均值（）+3×標(biāo)準(zhǔn)差（s）的值，根據(jù)統(tǒng)計學(xué)原理，當(dāng)OD 450nm≥+3 s時，判定為陽性；反之，OD 450nmlt;+3 s時判定為陰性。

1.6 特異性試驗

以最佳的ELISA反應(yīng)條件分別檢測PEDV、TGEV、PDCoV、PRRSV、PoRV和PCV陽性血清，每份血清樣品重復(fù)3孔，同時設(shè)置SADS-CoV陽性對照和陰性對照，確定該方法的特異性。

1.7 重復(fù)性試驗

批內(nèi)重復(fù)試驗采用同一批次誘導(dǎo)純化制備的SADS-CoV N蛋白作為包被抗原，以最佳的ELISA反應(yīng)條件檢測隨機選取的6份SADS-CoV抗體水平不同的豬血清樣本；批間重復(fù)試驗采用不同批次誘導(dǎo)純化制備的SADS-CoV N蛋白作為包被抗原，以最佳的ELISA反應(yīng)條件檢測上述6份豬血清樣本，不同時間點重復(fù)檢測3次。每份豬血清樣品重復(fù)3孔，根據(jù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差計算變異系數(shù)，變異系數(shù)（CV）=標(biāo)準(zhǔn)差（s）/OD 450 nm平均值（）×100%，分析該方法的重復(fù)性。

1.8 敏感性試驗

將SADS-CoV陽性血清經(jīng)2倍倍比稀釋（1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600）后作為一抗，Alexa Fluor^TM 594標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶300）作為二抗。將能檢出熒光的細(xì)胞孔對應(yīng)血清最大稀釋度作為IFA檢測結(jié)果，同步應(yīng)用ELISA方法進行檢測，比較2種檢測方法的靈敏度。

1.9 符合率試驗

由于目前無SADS-CoV商品化的抗體檢測試劑盒，因此應(yīng)用IFA和本研究建立的SADS-CoV N蛋白的ELISA方法對來自黑龍江省不同市（縣）的50份臨床豬血清樣品分別檢測，比較2種方法的檢測結(jié)果，并計算二者的符合率。

2 結(jié) 果

2.1 重組蛋白N表達(dá)純化及鑒定

SDS-PAGE結(jié)果顯示在約70 ku處出現(xiàn)條帶，與重組N蛋白的大小相符，該蛋白主要表達(dá)于上清中且純化效果較好，純化后的重組N蛋白質(zhì)量濃度為2.1 mg·mL^-1。Western blot結(jié)果顯示，在約70 ku處出現(xiàn)單一條帶，說明純化的N蛋白能夠被針對SADS-CoV N蛋白的特異性抗體所識別。上述結(jié)果表明，目的蛋白以可溶形式表達(dá)，純化效果較好，且具有良好的反應(yīng)原性（圖1）。

2.2 ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化確定

優(yōu)化后確定了ELISA最佳反應(yīng)條件：N蛋白最佳包被濃度為0.5 μg·mL^-1；血清最佳稀釋度1∶600；最佳封閉條件為5%脫脂乳37 ℃作用60 min；HRP-兔抗豬IgG最佳稀釋度為1∶5 000，反應(yīng)時間為60 min；最佳顯色時間為15 min。

2.3 臨界值的判定

用建立的ELISA抗體檢測方法對32份SADS-CoV陰性血清進行檢測，讀取OD 450nm值。根據(jù)生物學(xué)統(tǒng)計分析方法，計算出32份數(shù)據(jù)的平均值（）為0.124、標(biāo)準(zhǔn)差（s）為0.028，+3 s值為0.208，因此將OD 450 nm值≥ 0.208判定為陽性，OD 450 nmlt;0.208判定為陰性（圖2）。

2.4 特異性試驗

用建立的ELISA抗體檢測方法分別對SADS-CoV、PEDV、TGEV、PDCoV、PRRSV、PoRV和PCV豬陽性血清進行檢測，結(jié)果顯示，SADS-CoV豬陽性血清的OD 450 nm值大于0.208，為陽性，其余血清樣品的OD 450 nm值小于0.208，均為陰性，說明建立的ELISA方法與PEDV、TGEV、PDCoV、PRRSV、PoRV和PCV陽性血清均不發(fā)生交叉反應(yīng)，表明該方法具有良好的特異性。

2.5 重復(fù)性試驗

用建立的ELISA抗體檢測方法檢測隨機選取的6份血清樣品，重復(fù)性檢測結(jié)果表明批內(nèi)變異系數(shù)為1.3%～8.8%，批間變異系數(shù)為2.5%～9.7%，變異系數(shù)均小于10%。結(jié)果表明該檢測方法具有良好的重復(fù)性。

2.6 敏感性試驗

將SADS-CoV陽性血清2倍倍比稀釋后，用IFA和建立的間接ELISA方法進行檢測，確定2種檢測方法的靈敏度。結(jié)果顯示，采用IFA檢測時，SADS-CoV陽性血清稀釋至1∶400時細(xì)胞孔可見熒光，而當(dāng)陽性血清稀釋至1∶800時，細(xì)胞孔未見熒光，表明IFA的敏感性為1∶400；采用建立的ELISA方法檢測時，SADS-CoV陽性血清抗體效價為1∶3 200時，檢測的OD 450 nm值仍然大于0.208，而當(dāng)稀釋至1∶6 400時，其OD 450 nm值小于0.208。因此該方法的敏感性為1∶3 200，表明本試驗建立的ELISA方法具有較高的靈敏度。

2.7 符合率試驗

對50份來自黑龍江省不同市（縣）的臨床豬血清樣品分別通過本研究建立的ELISA方法和IFA進行檢測。如表1所示，間接ELISA方法檢測出5份陽性臨床樣品，45份陰性臨床樣品；IFA檢測出4份陽性臨床樣品，46份陰性臨床樣品，經(jīng)計算間接ELISA方法和IFA的陽性符合率為100.0%，陰性符合率為97.8%，總符合率為98.0%，以上結(jié)果表明本試驗建立的間接ELISA方法較為可靠，可用于SADS-CoV的臨床檢測。

3 討 論

自2017年以來，SADS-CoV疫情已導(dǎo)致中國南方近2.5萬頭仔豬死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失^［17］。然而目前并沒有商品化的診斷試劑盒對疫病的發(fā)生進行診斷，也沒有有效的疫苗或臨床批準(zhǔn)的藥物來預(yù)防和治療SADS-CoV的感染。因此，建立一種快速靈敏的SADS-CoV檢測方法對防控SADS-CoV的流行具有重要意義?；谂R床診斷過程的及時性和準(zhǔn)確性原則，間接ELISA方法具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、可批量檢測樣品等優(yōu)點，常被作為臨床血清樣本檢測的首選方法^［18］。

N蛋白是冠狀病毒中含量最豐富的蛋白，由于N蛋白不含糖基化位點，這使得它易于在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)與純化^［19］。此外，N蛋白在病毒感染期間大量表達(dá)，并且具有較強的免疫原性^［20］。S蛋白位于病毒表面，是高度糖基化的Ⅰ型跨膜糖蛋白，同樣具有良好的免疫原性，大量試驗數(shù)據(jù)證明冠狀病毒S蛋白不僅可以結(jié)合宿主細(xì)胞受體，還可以誘導(dǎo)病毒-細(xì)胞膜融合，在病毒入侵及誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用^［21］。因此，N蛋白和S蛋白都可能成為SADS-CoV抗體檢測的潛在靶點。相關(guān)研究表明，N蛋白與大多數(shù)新冠病毒感染患者的血清和感染急性期（新冠病毒感染后5～10 d）的血清樣本發(fā)生反應(yīng)。相比之下，新冠病毒感染急性期的血清樣本對S蛋白則沒有反應(yīng)，這表明針對N蛋白的抗體比S蛋白的抗體更早產(chǎn)生^［20］。因此，作者開發(fā)并評估了用于檢測SADS-CoV N蛋白抗體的間接ELISA方法。本研究首先構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a-N，誘導(dǎo)表達(dá)后并純化制備N蛋白，以純化的N蛋白作為包被抗原，通過方陣滴定法，優(yōu)化各反應(yīng)條件，建立SADS-CoV N蛋白的間接ELISA抗體檢測方法。通過對32份豬陰性血清OD 450 "nm值的測定，計算出臨界值+3s為0.208。批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗的變異系數(shù)均小于10%，證明建立的間接ELISA抗體檢測方法具有良好的重復(fù)性。

豬腸道冠狀病毒（PEDV、TGEV、SADS-CoV和PDCoV）引起的疫病具有相似的臨床癥狀和發(fā)病機制，未經(jīng)實驗室診斷無法區(qū)分，并且豬腸道冠狀病毒共感染現(xiàn)象普遍，同時會加重疫病的嚴(yán)重程度^［22-23］。本研究建立的間接ELISA方法與PEDV、TGEV、PDCoV、PoRV、PRRSV和PCV陽性血清均無交叉反應(yīng)，具有較高的特異性。為了評估建立的間接ELISA方法的準(zhǔn)確性，同時鑒于針對PEDV的商品化疫苗通過Vero細(xì)胞生產(chǎn)可能產(chǎn)生針對Vero細(xì)胞中相應(yīng)蛋白的抗體而導(dǎo)致假陽性結(jié)果^［24］，因此作者使用豬回腸上皮細(xì)胞系IPI-2I對樣品進行IFA檢測，結(jié)果顯示本研究所建立的間接ELISA方法和IFA的總符合率為98%，證明該方法結(jié)果可靠。

雖然目前檢測SADS-CoV的ELISA方法已有報道，但大多是針對SADS-CoV S蛋白，如Zhou等^［3］基于SADS-CoV S1亞基建立的ELISA方法，用于檢測病毒感染的母豬以及與病豬密切接觸的豬場工人的血清樣本；Yang等^［7］基于SADS-CoV全病毒蛋白建立的ELISA方法，用于檢測小鼠和豬的血清樣品；Pan等^［12］將免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G融合到SADS-CoV S蛋白的Fc端，基于S-Fc重組蛋白建立的間接ELISA方法。S蛋白具有多個抗原表位但容易發(fā)生變異，將其作為靶標(biāo)雖然可以快速與被檢血清中的抗體反應(yīng)，但可能無法檢測S蛋白變異后所誘導(dǎo)的抗體，從而產(chǎn)生假陰性的結(jié)果；而N蛋白高度保守，在病毒感染早期大量表達(dá)，因此是建立ELISA方法的理想靶標(biāo)。目前已有學(xué)者成功利用N蛋白作為靶標(biāo)建立了PEDV、PDCoV等豬腸道冠狀病毒ELISA抗體檢測方法，用于相應(yīng)腸道冠狀病毒的早期診斷^［25-26］。因此，本試驗建立的針對N蛋白的間接ELISA檢測方法在臨床樣品的檢測中具有潛在的應(yīng)用價值，并且對SADS-CoV疫情監(jiān)測具有重要的公共衛(wèi)生意義。

4 結(jié) 論

本試驗所建立的SADS-CoV N蛋白間接ELISA抗體檢測方法具有較高的敏感性、特異性、重復(fù)性及穩(wěn)定性，為SADS-CoV的早期監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查提供了有效手段，同時也為今后開展SADS-CoV疫苗的研究奠定了良好基礎(chǔ)。

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（編輯 白永平）