摘 要： 為了探索豬圓環(huán)病毒2型（porcine circovirus type 2， PCV2）病毒樣顆粒三倍軸區(qū)域展示外源抗原表位的潛力，本研究借助結(jié)構(gòu)模擬和蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)展示，分析了PCV2核衣殼表面氨基酸殘基突變后的結(jié)構(gòu)差異。通過(guò)分析不同cap基因突變質(zhì)粒在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中所表達(dá)的突變體蛋白的可溶性和純化難易程度，確定合適的外源表位嵌合區(qū)。將嵌合PPV抗原表位的Cap蛋白經(jīng)體外組裝獲得重組的病毒樣顆粒，將此病毒樣顆粒免疫小鼠，通過(guò)抗體檢測(cè)來(lái)評(píng)價(jià)其免疫原性。結(jié)果顯示，PCV2核衣殼表面三倍軸區(qū)域存在兩個(gè)適合用于展示外源表位的氨基酸區(qū)域（分別命名為Motif A和Motif B）；相同表達(dá)條件下，Motif A區(qū)域的突變蛋白均以可溶性表達(dá)為主，且能一步純化獲得目的蛋白，而Motif B區(qū)域的突變蛋白多以包涵體形式存在；Motif A區(qū)域嵌合PPV表位后，純化的重組蛋白能在體外組裝成cVLPs，并通過(guò)間接免疫熒光試驗(yàn)證明其保留有野生型VLPs內(nèi)化PK15細(xì)胞的能力；形成的cVLPs能刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生分別針對(duì)PCV2 VLPs、B5-E1表位和PPV VP2蛋白的抗體。綜上表明，PCV2 Cap蛋白Loop GH區(qū)域Motif A能夠?qū)⑼庠幢砦徽故驹诓《緲宇w粒外表面，并且能夠被機(jī)體免疫細(xì)胞識(shí)別產(chǎn)生特異性抗體。

關(guān)鍵詞： 豬圓環(huán)病毒2型；病毒樣顆粒；三倍軸區(qū)域；外源表位

中圖分類號(hào)： S852.659.2"""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"""" 文章編號(hào)： 0366-6964（2025）01-0307-12

收稿日期：2024-02-19

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32202790）；湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2022JJ40183）；湖南省技術(shù)攻關(guān)“揭榜掛帥”項(xiàng)目（2021NK1030）；湖南省青年科技人才項(xiàng)目（2022RC1046）；湖南省教育廳科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（23A0194）

作者簡(jiǎn)介：蔡云鳳（1997-），女，江西豐城人，碩士，主要從事動(dòng)物病毒蛋白質(zhì)組學(xué)研究， E-mail： Yvonne_2019@stu.hunau.edu.cn

*通信作者：湛 洋，主要從事獸醫(yī)病毒學(xué)研究，E-mail： yangzhan@hunau.edu.cn

CAI" Yunfeng 一種單鏈DNA病毒，其基因組一般具有1 767～1 768個(gè)堿基，被認(rèn)為是PCV2相關(guān)疾?。╬orcine circovirus associated disease， PCVAD）的關(guān)鍵病原體，對(duì)全球養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失^［1］。PCV2核衣殼蛋白質(zhì)（capsid protein， Cap）是主要的病毒結(jié)構(gòu)蛋白，具有較高的免疫原性，是研制疫苗的重要目標(biāo)抗原^［2-3］?；诘鞍踪|(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，PCV2 Cap蛋白單體由8條反平行β-折疊片（β-strands）構(gòu)成一個(gè)典型的jelly-roll結(jié)構(gòu)，7個(gè)不同大小的loops（BC、CD、DE、EF、FG、GH、HI）結(jié)構(gòu)將β折疊片進(jìn)行連接^［4］。團(tuán)隊(duì)前期研究表明，Cap蛋白能在原核系統(tǒng)中表達(dá)，純化后的Cap蛋白能在體外組裝形成病毒樣顆粒（virus like particles， VLPs）^［5］。其中，Loop FG被包埋在病毒粒子內(nèi)部，Loop CD修飾PCV2 VLPs表面二倍軸區(qū)域，Loop GH修飾PCV2 VLPs表面三倍軸區(qū)域，Loop BC、Loop DE及Loop HI共同修飾PCV2 VLPs表面五倍軸區(qū)域，Cap蛋白的羧基端（C-terminal）和Loop EF分布于PCV2 VLPs表面五倍軸區(qū)域附近^［6］。

值得關(guān)注的是，隨著養(yǎng)殖密度的提高和養(yǎng)殖環(huán)境的改變，在生豬養(yǎng)殖過(guò)程中存在多種病原的混合感染或者繼發(fā)感染。豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV）、豬細(xì)小病毒（porcine parvovirus， PPV）、豬瘟病毒（classical swine fever virus， CSFV）等多種病原與PCV2的混合感染將增加致病性，導(dǎo)致更嚴(yán)重的臨床癥狀^［7］。其中，PPV是導(dǎo)致豬繁殖障礙的主要病原體，有報(bào)道指出PPV可能通過(guò)降低宿主的免疫保護(hù)促進(jìn)PCV2感染^［8］。PPV有多個(gè)基因型，其中PPV1是首個(gè)被報(bào)道分離，且具有致病性^［9］。研究發(fā)現(xiàn)，PPV1 VP2蛋白能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生具有中和活性的抗體^［10］?；诮Y(jié)構(gòu)和免疫學(xué)研究，位于VP2蛋白中的²²⁸QQITDA²³³被鑒定為最小的B細(xì)胞線性表位，并且暴露在病毒粒子表面，能夠引起有效的免疫反應(yīng)^［11］。由此，團(tuán)隊(duì)前期將來(lái)源于PPV VP2蛋白質(zhì)抗原表位²²⁸QQITDA²³³在PCV2 VLPs的Loop CD（病毒粒子二倍軸區(qū)域）上展示，體外組裝成的嵌合型VLPs（Chimeric VLPs， cVLPs）能在豚鼠中產(chǎn)生針對(duì)PCV2和PPV的免疫保護(hù)^［12］。但是，PCV2 VLPs表面其他區(qū)域（如病毒粒子三倍軸區(qū)域）能否進(jìn)行外源抗原表位的展示，并產(chǎn)生良好的免疫原性，還需要進(jìn)一步的研究。

本項(xiàng)目擬結(jié)合前期試驗(yàn)基礎(chǔ)，選用PPV的抗原表位（²²⁸QQITDA²³³）在PCV2病毒粒子表面三倍軸區(qū)域進(jìn)行展示，將PPV VP2抗原表位嵌合插入到PCV2 Cap蛋白Loop GH兩個(gè)不同位置，分析嵌入后對(duì)重組Cap蛋白表達(dá)、純化及VLPs體外組裝的影響，揭示Loop GH區(qū)域展示外源抗原表位的潛力，為PCV2 cVLPs的研發(fā)提供重要的試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

PCV2 Cap蛋白表達(dá)用重組質(zhì)粒（pET100-PCV2-Cap）、PCV2兔源陽(yáng)性血清、DH5α感受態(tài)細(xì)胞和BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞、PK15細(xì)胞系、PPV VP2蛋白均由獸用蛋白質(zhì)工程疫苗湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。Easy Taq PCR聚合酶購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，膠回收試劑盒、普通純化試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自O(shè)mega公司。DL 5000 DNA Marker購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。Protein marker PM2500、限制性內(nèi)切酶、T4 連接酶、HRP 顯色液和細(xì)胞核染料DAPI均購(gòu)自Thermo Fisher 公司。HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗抗體和FITC標(biāo)記驢抗兔IgG的熒光二抗抗體均購(gòu)自 Invitrogen 公司。弗氏佐劑和IPTG購(gòu)自于Sigma公司。DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco公司。其他試劑均為分析純級(jí)別試劑。

1.2 PCV2核衣殼表面三倍軸區(qū)域的結(jié)構(gòu)模擬和插入位點(diǎn)展示

從蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.rcsb.org/）中獲取PCV2 Cap蛋白和VLPs的晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)（PDB ID：3R0R），利用三維分子模型軟件Pymol v1.8.4.0（http：//www.pymol.org/）將不同loops區(qū)域的氨基酸殘基采用不同顏色標(biāo)識(shí)，分析其在核衣殼表面的位置特征。參考筆者團(tuán)隊(duì)前期報(bào)道的研究方法^［6］，以上述PCV2 Cap蛋白晶體結(jié)構(gòu)作為同源性建模用模板，對(duì)Cap蛋白Loop GH兩個(gè)區(qū)域（Motif A和Motif B）嵌合PPV VP2蛋白質(zhì)的抗原表位（B5-E1）后的結(jié)構(gòu)使用同源建模軟件Modeller v10.2（http：//salilab.org/modeller/）進(jìn)行模擬，cVLPs按照PCV2 VLPs晶體結(jié)構(gòu)的矩陣信息使用VMD軟件 v1.9（http：//www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/）進(jìn)行重建，分析B5-E1抗原表位嵌入Loop GH后對(duì)PCV2 VLPs結(jié)構(gòu)的影響。

1.3 PCV2 Cap蛋白Loop GH突變體的設(shè)計(jì)

通過(guò)PCV2 Cap蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)氨基酸序列比對(duì)和三維結(jié)構(gòu)模擬分析，在Loop GH中共篩選出兩個(gè)候選區(qū)域，設(shè)計(jì)出兩組突變體：針對(duì)Motif A區(qū)域設(shè)計(jì)的一系列突變體稱為Group "分別是將該區(qū)域的氨基酸缺失（GH-D1），突變成不帶電荷的丙氨酸（GH-M1）或帶正電荷的精氨酸（GH-M3），以及將該區(qū)域氨基酸替換成B5-E1表位多肽（GH-I1）；針對(duì)Motif B區(qū)域設(shè)計(jì)的一系列突變體稱為Group" 與Group 1相對(duì)應(yīng)的突變體分別被命名為GH-D2、GH-M2、GH-M4、GH-I 設(shè)計(jì)方式如圖1所示。

1.4 Over-lap PCR擴(kuò)增目的片段

以實(shí)驗(yàn)室保存的pET100-PCV2-Cap質(zhì)粒為模板，使用Over-lap PCR方法分別擴(kuò)增GH-D GH-D GH-M GH-M GH-M3，GH-M4，GH-I GH-I2的A、B片段，然后以膠回收的A、B片段為模板擴(kuò)增目的片段，引物信息見表1（基因缺失區(qū)域所在的兩個(gè)堿基加粗標(biāo)記，突變堿基和插入堿基用下劃線標(biāo)注）。擴(kuò)增A和B片段的PCR反應(yīng)體系：pET100-PCV2-Cap質(zhì)粒1 μL，2× Easy Taq PCR 酶25 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，雙蒸水20 μL。擴(kuò)增目的片段的PCR反應(yīng)體系：A片段2 μL，B片段2 μL，2× Easy Taq PCR 酶25 μL，上、下游引物各2 μL，雙蒸水17 μL。PCR溫度與循環(huán)的設(shè)定：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72 ℃延伸30 s（分別擴(kuò)增A和B片段）或延伸50 s（擴(kuò)增目的片段），進(jìn)行35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增；最后72 ℃延伸7 min。將50 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，利用膠回收試劑盒回收目的片段。

1.5 Cap蛋白Loop GH突變體表達(dá)載體的構(gòu)建

使用BamHⅠ和NdeⅠ對(duì)膠回收片段以及pET100載體進(jìn)行酶切反應(yīng)，酶切后的片段使用普通純化試劑盒進(jìn)行純化，酶切后的載體利用膠回收試劑盒純化。純化后的載體與目的片段按適當(dāng)比例使用T4連接酶，在22 ℃進(jìn)行連接反應(yīng)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后的菌液均勻涂在含有氨芐抗生素（ampicillin， Amp）的LB 固體培養(yǎng)基上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取白色單個(gè)菌落到5 mL含Amp的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)14～16 h，最后利用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，并送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.6 重組蛋白的表達(dá)、可溶性分析以及純化

蛋白表達(dá)：測(cè)序成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后的菌液均勻涂在含有Amp的LB固體培養(yǎng)基，在37℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單個(gè)白色菌落在 10 mL含Amp的LB 液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)14～16 h，將菌液置于1 L TB 液體培養(yǎng)基中，37℃ 200 r·min^-1 振蕩培養(yǎng)，在OD "600 nm 值為 0.6～0.8 時(shí)，加入終濃度為1 mmol· L^-1 IPTG 后，30℃ 150 r·min^-1誘導(dǎo) 9 h，分兩步進(jìn)行：1）吸取2 mL菌液分裝于2個(gè)1 mL離心管，9 000 r·min^-1離心1 min，去掉上清，將沉淀存于4 ℃冰箱，用于蛋白質(zhì)的可溶性分析；2）剩下的1 L菌液9 000 r·min^-1離心1 min后，棄掉上清液，存于-80 ℃超低溫冰箱用于后續(xù)蛋白質(zhì)純化。

可溶性分析：上步1）中獲得的1 mL樣品沉淀加入400 μL 裂解液，超聲處理2 min（振幅15%），加入100 μL 上樣緩沖液，煮沸5 min后，作為總蛋白（T）用于SDS-PAGE分析；另外1 mL樣品沉淀加入500 μL 裂解液，超聲處理2 min，13 000 r·min^-1離心5 min，得到的樣品，取400 μL置于一新的2 mL離心管中，加入100 μL 上樣緩沖液，煮沸5 min后，作為上清（S）用于SDS-PAGE分析，剩下的樣品棄掉上清，用400 μL 裂解液懸浮沉淀，13 000 r·min^-1離心5 min，加入100 μL 上樣緩沖液，超聲處理2 min，再煮沸5 min后，作為沉淀（P）用于SDS-PAGE分析。

蛋白純化：上步2）的1 L菌液4℃解凍，使用裂解液將沉淀重懸并進(jìn)行超聲破碎，在4 ℃ 13 000 r·min^-1離心收集上清液，將上清液與鎳柱填料室溫結(jié)合1 h，使用含低濃度咪唑的洗脫液洗去雜蛋白，再用含高濃度咪唑的洗脫液洗脫目的蛋白，并收集3管2 mL的蛋白洗脫液。

1.7 重組蛋白 SDS-PAGE 及 Western blot 鑒定

將上述收集的蛋白進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳，然后將SDS-PAGE膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上；用3% BSA 室溫封閉1 h；以1% BSA為溶劑分別稀釋 PCV2 兔源陽(yáng)性血清（1∶1 000）、第三次免疫cVLPs后的小鼠血清（1∶1 000）、HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗抗體（1∶3 000）和 HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗抗體（1∶3 000），將膜與一抗血清室溫孵育1 h 后，用PBST（含0.05%吐溫-20的PBS，pH=7.4）清洗3次，每次5 min，然后加入稀釋好的二抗在室溫孵育1 h 后，同上述步驟用PBST進(jìn)行清洗；最后使用HRP顯色液進(jìn)行顯色拍照。

1.8 PCV2 VLPs和cVLPs的組裝及驗(yàn)證

將純化鑒定好的蛋白裝入透析袋中，在組裝液（0.1 mol·L^-1 NaH 2PO 4·2H 2O， 0.5 mol·L^-1 NaCl， 0.1 mol·L^-1 KCl， 0.01 mol·L^-1 Tris-HCl， 0.5% Triton X-100， 0.1 mmol·L^-1 PMSF， pH 7.4），4℃條件下透析48 h。透析過(guò)程中，更換兩次組裝液。收集上步處理后的蛋白樣品，10 000×g離心5 min，取上清液在4℃保存。取 20 μL上清液放置于銅網(wǎng)膜上，液體充分吸收后用濾紙片吸干剩余液體，用2%磷鎢酸復(fù)染5 min，待完全干燥后置于透射電子顯微鏡（JEOL）下觀察是否形成VLPs，確定VLPs的形態(tài)。為進(jìn)一步驗(yàn)證VLPs的體外組裝效率，取100 μL上清液使用快速蛋白質(zhì)液相色譜（fast protein liquid chromatography， FPLC）進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析，采用Superdex^TM 200 Increase 10/300 GL小規(guī)模 SEC層析預(yù)裝柱（Cytiva），過(guò)樣的流速設(shè)置為0.75 mL·min^- 體積設(shè)置為1.5 CV（36 mL），全程在280 nm紫外波長(zhǎng)下連續(xù)監(jiān)測(cè)樣品的光密度值，并用牛血清白蛋白（bovine serum albumin， BSA， 66.43 ku）作為對(duì)照區(qū)分PCV2 VLPs和PCV2 Cap蛋白單體。

1.9 間接免疫熒光試驗(yàn)

利用間接免疫熒光方法（indirect immunofluorescence assay， IFA）對(duì)VLPs和cVLPs的特異性進(jìn)行檢測(cè)，具體操作方法如下：將PK15細(xì)胞接種至48孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞密度長(zhǎng)至60%左右，加入5 μg PCV2 VLPs或cVLPs（陰性對(duì)照組不作處理），37℃條件下孵育30 min，用PBST洗滌3次，加入200 μL含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h；培養(yǎng)結(jié)束后，用PBST清洗，用4%多聚甲醛固定20 min，用PBST清洗，加入0.2%的 Triton X-100處理10 min，用PBST清洗，再用 3% BSA 封閉 30 min；棄掉封閉液，加入PCV2 兔源陽(yáng)性血清（1∶1 000）孵育1 h，用PBST清洗，再加入FITC標(biāo)記驢抗兔IgG的熒光二抗（1∶2 000）避光孵育1 h，用PBST清洗，用DAPI染核，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.10 小鼠免疫試驗(yàn)

選取15只6周齡的雌性KM小鼠并隨機(jī)分為3組，每組5只，分別命名為對(duì)照組（PBS）、VLPs組（PCV2 野生型VLPs）以及cVLPs組（GH-I1 cVLPs）。每只小鼠的免疫劑量均為200 μL，其中，VLPs組和cVLPs組的小鼠免疫 20 μg 對(duì)應(yīng)抗原（等體積混合100 μL佐劑），對(duì)照組注射PBS（等體積混合100 μL佐劑），試驗(yàn)過(guò)程中共進(jìn)行三次免疫，免疫方式為腹腔注射，第一次免疫所用佐劑為弗氏完全佐劑，第二、三次免疫使用弗氏不完全佐劑，每次免疫間隔兩周，在免疫前和每次免疫后兩周（0、14、28、42 d）進(jìn)行小鼠眼眶后靜脈叢采血，分離血清并進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.11 小鼠血清特異性抗體檢測(cè)及抗體效價(jià)分析

利用間接ELISA方法檢測(cè)特異性抗體：將 PCV2 VLPs（2 μg·mL^-1）、偶聯(lián)BSA的B5-E1表位多肽（4 μg·mL^-1）和PPV VP2蛋白（4 μg·mL^-1）分別作為抗原，4℃過(guò)夜包被，5%脫脂奶粉封閉3 h，用PBST清洗，再加入稀釋至1∶200的待測(cè)小鼠血清，陰性對(duì)照為免疫PBS的小鼠血清，37℃孵育1 h，用PBST清洗，加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗抗體（1∶3 000稀釋），37℃孵育30 min，用PBST清洗，加入 TMB 底物顯色液50 μL，避光顯色10 min，2 mol·L^-1 H 2SO 4終止反應(yīng)，用酶聯(lián)免疫反應(yīng)測(cè)定儀讀取OD 450 nm值。

抗體效價(jià)分析：對(duì)第三次免疫后的血清樣品（42 d）以 1∶400 作為最低稀釋倍數(shù)，2 倍倍比稀釋至12 800倍采用上述ELISA檢測(cè)，計(jì)算陽(yáng)性血清 OD "450 nm數(shù)值（P）與陰性血清 OD "450 nm 數(shù)值（N）的比值，將P/Ngt;2 時(shí)的最高血清稀釋倍數(shù)作為 ELISA 的抗體效價(jià)。

1.12 數(shù)據(jù)分析

本研究得到的試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，通過(guò) GraphPad Prism 5 軟件對(duì)所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析并作圖，組間比較采用單因素方差分析，組間的比較采用T Test，*.Plt;0.05 表示差異顯著，**.Plt;0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 PCV2 VLPs表面三倍軸區(qū)域氨基酸殘基的分布特征和外源抗原表位的模擬展示

根據(jù)Loop GH（aa 162-194）氨基酸殘基在PCV2核衣殼表面的分布特征，可將其分成兩部分，第一部分修飾PCV2核衣殼的表面，包含兩個(gè)不連續(xù)的區(qū)域，其中第一個(gè)區(qū)域?yàn)?sup>166VLDRTIDY¹⁷³（圖 Motif A，藍(lán)色標(biāo)記），與相鄰兩個(gè)Cap亞基中的相同部分形成了三倍軸的中心，第二個(gè)區(qū)域位于第一個(gè)區(qū)域的周圍，為¹⁸⁹TTGNVD¹⁹⁴（圖 Motif B，紫色標(biāo)記），與位于二倍軸區(qū)域的Loop CD（圖 綠色標(biāo)記）毗鄰；第二部分位于PCV2核衣殼內(nèi)部，包括¹⁶²TPKP¹⁶⁵和¹⁷⁴FQPNNKRNQLWLRLQ¹⁸⁸（圖 青色標(biāo)記）。

將PPV VP2蛋白質(zhì)的抗原表位（B5-E1）分別展示在PCV2核衣殼表面Motif A和Motif B區(qū)域，分別命名為GH-I1和GH-I 并對(duì)cVLPs的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬分析，結(jié)果顯示，Motif A和Motif B區(qū)域均能將B5-E1抗原表位展示在PCV2核衣殼表面（圖 紅色標(biāo)記）。

2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建和驗(yàn)證

將獲得的質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析可見，重組質(zhì)粒通過(guò)BamHⅠ和NdeⅠ雙酶切鑒定，在5 400 bp（載體片段）和660～690 bp（目的片段）位置可見2條大小不一致的 DNA 條帶（圖 3），該結(jié)果與預(yù)期相符。測(cè)序結(jié)果顯示，構(gòu)建的重組質(zhì)粒核苷酸序列與預(yù)期一致，無(wú)堿基突變，表明8個(gè)突變體目的片段成功連接到 pET100 載體。

2.3 重組蛋白質(zhì)的可溶性表達(dá)分析

將上述缺失型和突變型PCV2 Cap蛋白重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，用相同的方法和條件表達(dá)對(duì)應(yīng)重組蛋白，收取總蛋白、上清以及沉淀進(jìn)行可溶性分析，Motif A相關(guān)重組蛋白質(zhì)的SDS-PAGE結(jié)果（圖4）顯示，重組蛋白質(zhì)（GH-D MW： 27.5 ku；GH-M MW： 28.1 ku；GH-M3， MW： 28.8 ku）均在大腸桿菌中以可溶性形式表達(dá)。Motif B相關(guān)重組蛋白的SDS-PAGE結(jié)果（圖4）顯示，重組蛋白GH-D2（MW： 27.9 ku）在大腸桿菌中以可溶性形式表達(dá)，但是重組蛋白GH-M2（MW： 28.3 ku）和GH-M4（MW： 28.9 ku）在大腸桿菌中主要以包涵體的不溶性聚集物表達(dá)，提示Motif B突變后影響蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)。

將外源表位分別插入Motif A和Motif B區(qū)域之后，對(duì)嵌合外源表位的重組蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)，蛋白質(zhì)可溶性分析結(jié)果顯示，重組蛋白GH-I1（MW： 28.2 ku）在大腸桿菌中以可溶性形式表達(dá)，但是重組蛋白GH-I2（MW： 28.6 ku）在大腸桿菌中主要以包涵體的不溶性聚集物表達(dá)（圖5）。

2.4 重組蛋白質(zhì)的純化

根據(jù)蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)結(jié)果，選取Loop GH motif A區(qū)域相關(guān)重組蛋白質(zhì)（GH-D1、GH-M1、GH-M3和GH-I1）進(jìn)行純化。

結(jié)果顯示，將該區(qū)域氨基酸缺失（GH-D1）后，在27 ku左右出現(xiàn)目的蛋白條帶，將該區(qū)域氨基酸替換成聚丙氨酸序列（GH-M1）或聚精氨酸序列（GH-M3）之后均能獲得目的蛋白（圖6），表明該區(qū)域氨基酸改變之后不會(huì)影響重組蛋白質(zhì)的純化。同時(shí)，在Motif A區(qū)域嵌合B5-E1抗原表位（GH-I1）后也能獲得目的蛋白"" （圖6），表明B5-E1抗原表位的展示在motif A區(qū)域不影響重組蛋白質(zhì)的純化。

2.5 PCV2 VLPs和cVLPs的電鏡鑒定和分子篩驗(yàn)證

電鏡結(jié)果顯示，野生型PCV2 Cap蛋白和嵌合B5-E1抗原表位的突變體蛋白質(zhì)（GH-I1）均可在體外條件下組裝成直徑大小約為17 nm的cVLPs（圖7C），形態(tài)與野生型PCV2 VLPs一致（圖7B），而陰性對(duì)照的BSA蛋白經(jīng)透析后未組裝成VLPs（圖7A）。凝膠層析色譜結(jié)果（圖7）顯示，cVLPs在10 mL左右出現(xiàn)單一吸收峰，洗脫位置和野生型PCV2 VLPs一致，而BSA蛋白在14 mL左右出現(xiàn)吸收峰，證明cVLPs的組裝效率較高，可用于后續(xù)動(dòng)物免疫試驗(yàn)。

2.6 PCV2 VLPs和cVLPs的特異性鑒定

將制備的PCV2 VLPs和cVLPs內(nèi)化生長(zhǎng)良好的 PK15 細(xì)胞，IFA 結(jié)果顯示（圖8），在 PK15 細(xì)胞核周圍有大量的特異性綠色熒光，而陰性對(duì)照組的細(xì)胞周圍無(wú)特異性綠色熒光，表明制備的 PCV2 cVLPs能入侵 PK15 細(xì)胞，與野生型PCV2 VLPs特異性一致，能被PCV2抗體識(shí)別。

2.7 PCV2 cVLPs的免疫原性評(píng)價(jià)

將GH-I1 cVLPs與PCV2 VLPs分別免疫小鼠，抗體檢測(cè)結(jié)果顯示，在免疫后的第14、28和42天，PCV2 VLPs和GH-I1 cVLPs組均檢測(cè)到針對(duì)PCV2 VLPs 的特異性IgG抗體，但是PCV2 VLPs組 IgG 抗體水平顯著高于cVLPs組（Plt;0.01）（圖9A）。在免疫后的第28、42天，在GH-I1 cVLPs組檢測(cè)到針對(duì)B5-E1抗原表位的特異性IgG抗體，而在PCV2 VLPs組和PBS組內(nèi)未檢測(cè)到針對(duì)B5-E1的IgG抗體（Plt;0.01）（圖9B）。以上結(jié)果表明在Loop GH Motif A區(qū)域嵌合B5-E1抗原表位后，所形成的cVLPs可以誘導(dǎo)小鼠機(jī)體同時(shí)產(chǎn)生針對(duì)B5-E1抗原表位的IgG抗體和PCV2 VLPs 的IgG抗體。將第三次免疫后的血清樣品（42 d），進(jìn)一步稀釋處理后（1∶400，1∶800，1∶1 600，1∶3 200，1∶6 400，1∶12 800），利用間接 ELISA 測(cè)定制備的多克隆抗體的效價(jià)，結(jié)果表明cVLPs制備的小鼠抗PCV2 VLPs的抗體效價(jià)達(dá)1∶3 200，cVLPs制備的小鼠抗B5-E1表位的抗體效價(jià)達(dá)1∶1 600。此外，使用表達(dá)、純化的PPV VP2蛋白（～70 ku）（圖9C）作為抗原，免疫GH-I1 cVLPs后的小鼠血清能和PPV VP2蛋白反應(yīng)（圖9D）。按照4 μg·mL^-1 PPV VP2蛋白包備ELISA板，用第三次免疫后的小鼠血清樣品（PBS組，PCV2 VLPs組和GH-I1 cVLPs組）分別作為一抗進(jìn)行試驗(yàn)，僅GH-I1 cVLPs組檢測(cè)到針對(duì)PPV VP2蛋白的特異性IgG抗體，而在PCV2 VLPs組和PBS組內(nèi)未檢測(cè)到針對(duì)PPV VP2蛋白的IgG抗體（Plt;0.01）（圖9E）。

3 討 論

群體免疫是控制病原體流行的最有效方法，國(guó)內(nèi)多種類型的PCV2疫苗的研發(fā)及上市，對(duì)于防控PCVAD起到了積極的作用^［13］。值得注意的是，蛋白質(zhì)納米顆粒（如VLPs）疫苗相比于其他傳統(tǒng)疫苗具有高的生物安全性，因其具有病毒的天然構(gòu)象，能更好地刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)病毒的中和性抗體，是當(dāng)今病毒性疫苗研究的熱點(diǎn)之一^［14］。此外，PCV2 VLPs能作為一種納米載體，在其表面展示外源抗原表位形成cVLPs，有助于進(jìn)一步研發(fā)動(dòng)物二聯(lián)苗及多聯(lián)苗。值得注意的是，在設(shè)計(jì)和研發(fā)cVLPs的過(guò)程中，需要探索與解決以下問(wèn)題：1）PCV2 VLPs表面哪些區(qū)域適合于展示抗原表位？即：基于病毒粒子結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)以及氨基酸保守性分析，篩選合適的嵌入位點(diǎn)；2）外源抗原表位嵌合到PCV2 Cap蛋白后的影響？即：探究突變型Cap蛋白表達(dá)的可溶性、純化量及cVLPs的組裝能力；3）成功構(gòu)建形成的cVLPs是否具有良好的免疫原性？即：在不影響PCV2抗體產(chǎn)生的同時(shí)能產(chǎn)生高水平的針對(duì)外源抗原的特異性抗體。

大量研究以PCV2 VLPs作為載體展示外源抗原表位，探索cVLPs的免疫原性^［15-18］。其中，PCV2 Cap蛋白的核定位信號(hào)區(qū)域、C-terminal和Loops區(qū)域可作為抗原表位的插入位點(diǎn)，位點(diǎn)的選取將影響cVLPs的免疫原性。例如，將PCV2的核定位信號(hào)區(qū)域替換成CSFV T細(xì)胞表位（1 446—1 460 aa）和B細(xì)胞表位（693—716 aa），雖然成功的制備了cVLPs，但是卻沒(méi)有產(chǎn)生針對(duì)CSFV的中和性抗體^［17］；而在PCV2的Cap蛋白 C-terminal插入長(zhǎng)度為14 aa的生長(zhǎng)抑素基因后并不影響Cap蛋白的表達(dá)，也不影響cVLPs的組裝，并能降低體內(nèi)病毒血癥和組織病毒含量^［18］；本團(tuán)隊(duì)前期研究將外源抗原表位展示在Loop CD和Loop EF區(qū)域，均不影響cVLPs的組裝，且展示在Loop CD區(qū)域后的cVLPs能產(chǎn)生較高的體液免疫和細(xì)胞免疫^［19-20］。結(jié)合蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模擬分析^{［4，6］}，相比于位于VLPs內(nèi)部的核定位信號(hào)區(qū)域，位于VLPs表面的大部分Loops區(qū)域更有利于展示外源抗原表位。

本研究通過(guò)蛋白結(jié)構(gòu)模擬和展示，在PCV2 VLPs表面三倍軸區(qū)域選取到兩個(gè)位置（Loop GH Motif A和Motif B）作為抗原表位展示候選區(qū)域。進(jìn)一步經(jīng)過(guò)突變蛋白質(zhì)的可溶性分析，Motif B區(qū)域氨基酸殘基的改變會(huì)影響重組Cap蛋白的可溶性表達(dá)，多以包涵體形式存在，而Motif A區(qū)域的突變蛋白均以可溶性形式表達(dá)為主，后續(xù)試驗(yàn)將PPV VP2蛋白質(zhì) B5-E1表位多肽展示在Loop GH Motif A（¹⁶⁶VLDRTIDY¹⁷³）區(qū)域。將PPV抗原表位成功展示在PCV2 VLPs后，形成的cVLPs（GH-I1）免疫小鼠后能產(chǎn)生分別針對(duì)PCV2、B5-E1表位和PPV VP2蛋白的抗體。然而，PCV2 Cap的Loop GH Motif A區(qū)域嵌合B5-E1抗原表位后，形成的cVLPs產(chǎn)生的抗體識(shí)別野生型PCV2 VLPs的能力有所降低，采用更高劑量的cVLPs進(jìn)行免疫是否可以提供更好的免疫原性有待進(jìn)一步研究。Motif A區(qū)域附近存在一個(gè)被報(bào)道的PCV2誘餌表位（¹⁶⁹STIDYFQPNNKRC¹⁸⁰）^［21］，該突變?cè)O(shè)計(jì)（GH-I1）在破壞誘餌表位的同時(shí)能夠?qū)⑼庠幢砦徽故驹谕獗砻妗５?，將B5-E1外源表位多肽嵌入上述Motif A區(qū)域是否會(huì)影響抗原遞呈細(xì)胞對(duì)PCV2 誘餌表位的識(shí)別還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

PCV2 Cap蛋白Loop GH Motif A區(qū)域更適合嵌合PPV抗原表位，體外組裝成的cVLPs可以在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)針對(duì)PPV抗原表位和PPV VP2蛋白的特異性免疫應(yīng)答。

參考文獻(xiàn)（References）：

［1］ FRANZO G， SEGALS J. Porcine circovirus 2 genotypes， immunity and vaccines： multiple genotypes but one single serotype［J］. Pathogens， 2020， 9（12）：1049.

［2］ LIU C， LIU Y C， FENG H， et al. PCV cap proteins fused with calreticulin expressed into polymers in Escherichia coli with high immunogenicity in mice［J］. BMC Vet Res， 2020， 16（1）：313.

［3］ 武樂(lè)祎， 吳素芳， 車 影， 等. 穩(wěn)定表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的CHO-K1細(xì)胞系的建立及免疫原性分析［J］. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2019， 50（5）：1056-1063.

WU L Y， WU S F， CHE Y， et al. The establishment of CHO-K1 cell line stably expressing high level PCV2-cap and immunogenicity analysis［J］. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica， 2019， 50（5）：1056-1063. （in Chinese）

［4］ KHAYAT R， BRUNN N， SPEIR J A， et al. The 2. 3-angstrom structure of porcine circovirus 2［J］. J Virol， 201 85（15）：7856-7862.

［5］ ZHAN Y， YU W T， CAI X， et al. The carboxyl terminus of the porcine circovirus type 2 capsid protein is critical to virus-like particle assembly， cell entry， and propagation［J］. J Virol， 2020， 94（9）：e00042-20.

［6］ WANG N D， ZHAN Y， WANG A B， et al. In silico analysis of surface structure variation of PCV2 capsid resulting from loop mutations of its capsid protein （Cap）［J］. J Gen Virol， 2016， 97（12）：3331-3344.

［7］ OUYANG T， ZHANG X W， LIU X H， et al. Co-infection of swine with porcine circovirus type 2 and other swine viruses［J］. Viruses， 2019， 11（2）：185.

［8］ MSZ ROS I， OLASZ F， CS GOLA A， et al. Biology of porcine parvovirus （Ungulate parvovirus 1）［J］. Viruses， 2017， 9（12）：393.

［9］ XING X L， ZHOU H， TONG L， et al. First identification of porcine parvovirus 7 in China［J］. Arch Virol， 2018， 163（1）：209-213.

［10］ XU Y G， LI Y J. Induction of immune responses in mice after intragastric administration of Lactobacillus casei producing porcine parvovirus VP2 protein［J］. Appl Environ Microbiol， 2007， 73（21）：7041-7047.

［11］ SUN J H， HUANG L P， WEI Y W， et al. Identification of three PPV1 VP2 protein-specific B cell linear epitopes using monoclonal antibodies against baculovirus-expressed recombinant VP2 protein［J］. Appl Microbiol Biotechnol， 2015， 99（21）：9025-9036.

［12］ WANG N D， ZHANG S J， WANG D L， et al. Protective humoral immunity in guinea pigs induced by PCV2 virus-like particles displaying the B cell linear epitope （²²⁸QQITDA²³³） of PPV1［J］. Vet Microbiol， 2019， 235：86-92.

［13］ GUO J S， HOU L， ZHOU J W， et al. Porcine circovirus type 2 vaccines： commercial application and research advances［J］. Viruses， 2022， 14（9）：2005.

［14］ DHAKAL S， RENUKARADHYA G J. Nanoparticle-based vaccine development and evaluation against viral infections in pigs［J］. Vet Res， 2019， 50（1）：90.

［15］ LIU X Y， LIU Y K， ZHANG Y Y， et al. Incorporation of a truncated form of flagellin （TFlg） into porcine circovirus type 2 virus-like particles enhances immune responses in mice［J］. BMC Vet Res， 2020， 16（1）：45.

［16］ LI X， MENG X P， WANG S N， et al. Virus-like particles of recombinant PCV2b carrying FMDV-VP1 epitopes induce both anti-PCV and anti-FMDV antibody responses［J］. Appl Microbiol Biotechnol， 2018， 102（24）：10541-10550.

［17］ ZHANG H W， QIAN P， LIU L F， et al. Virus-like particles of chimeric recombinant porcine circovirus type 2 as antigen vehicle carrying foreign epitopes［J］. Viruses， 2014， 6（12）：4839-4855.

［18］ LI W L， WANG X W， BAI J， et al. Construction and immunogenicity of recombinant porcine circovirus-like particles displaying somatostatin［J］. Vet Microbiol， 2013， 163（1-2）：23-32.

［19］ 張素姣， 王東亮， 李 萌， 等. Loop EF區(qū)嵌合豬細(xì)小病毒B細(xì)胞表位對(duì)豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒組裝的影響［J］. 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)， 2019， 49（2）：176-182.

ZHANG S J， WANG D L， LI M， et al. Effect of chimeric porcine parvovirus B cell epitope in Loop EF region on assembly of porcine circovirus type 2 virus-like particles［J］. Chinese Veterinary Science， 2019， 49（2）：176-182. （in Chinese）

［20］ HU G W， WANG N D， YU W T， et al. Generation and immunogenicity of porcine circovirus type 2 chimeric virus-like particles displaying porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5 epitope B［J］. Vaccine， 2016， 34（16）：1896-1903.

［21］ TRIBLE B R， SUDDITH A W， KERRIGAN M A， et al. Recognition of the different structural forms of the capsid protein determines the outcome following infection with porcine circovirus type 2［J］. J Virol， 2012， 86（24）：13508-13514.

（編輯 白永平）