摘 要： 旨在以竹葉黃酮（BLF）為添加物，探究BLF對過氧化氫（H 2O 2）誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞（BMECs）焦亡的保護(hù)作用。本研究以BMECs為研究對象，分為對照組、80 μg·mL^-1 BLF處理組、800 μmol·L^-1 H 2O 2處理組和80 μg·mL^-1 BLF+800 μmol·L^-1 H 2O 2處理組。利用RT-qPCR、Western blot、免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)，檢測細(xì)胞焦亡相關(guān)基因和蛋白表達(dá)以及凋亡相關(guān)微粒樣蛋白（ASC）熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明，與對照組相比，800 μmol·L^-1 H 2O 2處理BMECs 8 h顯著增加了奶牛乳腺上皮細(xì)胞的焦亡（P＜0.05）；H 2O 2處理后，NLRP3、ASC、GSDMD、IL-18、IL-1β 等焦亡相關(guān)基因的相對表達(dá)量均顯著升高（P＜0.05），尤其是NLRP3，說明H 2O 2顯著增加BMECs焦亡。與H 2O 2處理組相比，BLF可以降低正常細(xì)胞焦亡水平，顯著降低NLRP3、Nek7、ASC、GSDMD、IL-18、IL-1β基因mRNA上調(diào)的趨勢，顯著緩解了H 2O 2導(dǎo)致的NLRP3、ASC、Nek7、pro-caspase1、caspase1 p20、GSDMD-N、IL-18和IL-1β胞內(nèi)焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的升高（P＜0.05），ASC的熒光強(qiáng)度顯著降低（P＜0.05）。綜上所述，H 2O 2顯著上調(diào)NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18焦亡基因和蛋白表達(dá)水平，誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞焦亡。BLF通過降低NLRP3炎癥小體通路蛋白和基因表達(dá)，降低了炎癥因子水平，從而緩解奶牛乳腺上皮細(xì)胞焦亡。

關(guān)鍵詞： 竹葉黃酮；奶牛乳腺上皮細(xì)胞；細(xì)胞焦亡

中圖分類號： S823.91"""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）01-0281-14

收稿日期：2024-03-14

基金項目：家禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市創(chuàng)新團(tuán)隊（BAICO5）；乳業(yè)全產(chǎn)業(yè)鏈“綠色數(shù)智”技術(shù)集成創(chuàng)新與產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用［SNSPKJ（2022）］

作者簡介：王 靖（2001-），女，北京人，碩士生，主要從事反芻動物營養(yǎng)與飼料活性物質(zhì)開發(fā)與應(yīng)用研究，E-mail： 13718216147@163.com

*通信作者：蔣林樹，主要從事奶牛營養(yǎng)與免疫研究，E-mail：jls@bua.edu.cn；郭 剛，博士，正高級畜牧師，北京首農(nóng)畜牧發(fā)展有限公司，主要從事奶牛營養(yǎng)研究，E-mail：guogang2180@126.com

The Protective Effect of Bamboo Leaf Flavonoids on H 2O 2-induced Pyroptosis in

Bovine Mammary Epithelial Cells

WANG" Jing GUAN" Shuwen ZHAO" Xiaobo WANG" Linwei GUO" Gang ， JIANG" Linshu^1*

（1.Beijing Key Laboratory of Dairy Cow Nutrition， Beijing University of Agriculture，

Beijing 102206，

China;

2.Beijing Shounong Animal Husbandry Development Co.， Ltd， Beijing 100076，" China）

Abstract： "In this study， bamboo leaf flavonoids （BLF） was used as an additive to explore its protective effect on hydrogen peroxide （H 2O 2）-induced pyroptosis of bovine mammary epithelial cells （BMECs）. In this experiment， the concentration of BLF was 80 μg·mL^-1 and the concentration of H 2O 2 was 800 μmol·L^-1. The BMECs without BLF treatment were set as the control group， and the treatment groups were BLF treatment group， H 2O 2 treatment group， BLF and H 2O 2 co-treatment group. The expression of pyroptosis-related genes and related proteins and the fluorescence intensity of apoptosis-related microparticle-like protein（ASC） were detected by RT-qPCR， Western blot， immunofluorescence and flow cytometry. The results showed that compared with the control group， 800 μmol·L^-1 H 2O 2 treatment of BMECs for 8 h significantly increased the pyroptosis of bovine mammary epithelial cells （Plt;0.05）. After H 2O 2 treatment， the relative expression levels of NLRP3， ASC， GSDMD， IL-18， IL-1β genes which related to pyroptosis genes were significantly increased （Plt;0.05）， especially the expression of NLRP3， indicating that H 2O 2 significantly increased the pyroptosis of BMECs. Compared with the H 2O 2 treatment group， BLF could reduce the pyroptosis level of normal cells， significantly reduce the mRNA up-regulation trend of NLRP3， Nek7， ASC， GSDMD， IL-18， IL-1β， and significantly alleviate the increase of intracellular pyroptosis protein expression of NLRP3， ASC， Nek7， pro-caspase caspase1 p20， GSDMD-N， IL-18 and IL-1β induced by H 2O 2 （Plt;0.05）， and the fluorescence intensity of ASC was significantly reduced （Plt;0.05）. In summary， H 2O 2 significantly up-regulated the expression levels of pyroptosis-related genes and proteins such as NLRP3， ASC， Caspase- GSDMD， IL-1β， and IL-18， and induced pyroptosis in bovine mammary epithelial cells. In conclusion， BLF reduced the level of inflammatory factors by reducing the expression of NLRP3 inflammasome pathway proteins and genes， thereby alleviating the pyroptosis of dairy cow mammary epithelial cells.

Key words： bamboo leaf flavonoids; dairy cow mammary epithelial cells; pyroptosis of cells

*Corresponding authors： 英文通信作者JIANG Liushu，E-mail：jls@bua.edu.cn;GUO Gang， E-mail：guogang2180@126.com

細(xì)胞焦亡，也稱細(xì)胞炎癥性壞死，是一種程序性細(xì)胞死亡^［1］。在規(guī)?；膛Ｉa(chǎn)中，由于環(huán)境、溫度、管理等因素的影響，奶牛機(jī)體內(nèi)會產(chǎn)生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），當(dāng)其超過機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的清除能力時，過量的ROS會損傷機(jī)體內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)^［2］，刺激核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3活化（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3， NLRP3）與凋亡相關(guān)微粒樣蛋白（apoptosis-associated apeck-like protein，ASC）形成NLRP3炎癥小體^［3］，激活細(xì)胞焦亡通路^［4］，從而加劇奶牛機(jī)體的炎癥級聯(lián)擴(kuò)增^［5-7］，嚴(yán)重影響奶牛健康狀況及泌乳性能。這與盧德勛^［8］先生提出的氧化應(yīng)激-炎癥反應(yīng)-免疫應(yīng)激三方聯(lián)動效應(yīng)失衡的理念相一致。大量研究發(fā)現(xiàn)，天然植物活性成分可調(diào)控細(xì)胞焦亡，減輕炎性癥狀^［9］。竹葉黃酮（bamboo leaves flavone，BLF）作為竹葉中的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、緩解氧化應(yīng)激的生物功能^［10-11］，可降低血清中IgG和IL-10及血液中IL-1β和TNF-α含量^［12-13］。侯昆等^［14］研究發(fā)現(xiàn)，對患有隱性乳房炎的奶牛飼喂BLF能夠降低奶牛血清中TNF-α含量和乳中體細(xì)胞數(shù)，在一定程度上提高奶牛的產(chǎn)奶性能，增強(qiáng)機(jī)體免疫；在體外細(xì)胞試驗中，添加BLF可抑制奶牛乳腺上皮細(xì)胞ROS的生成，提高Nrf2及抗氧化酶的活性，緩解奶牛乳腺上皮的線粒體損傷，降低凋亡相關(guān)基因的表達(dá)^［15-16］。本實驗室前期研究也證明了800 μmol·L^-1的H 2O 2能夠建立穩(wěn)定的氧化應(yīng)激模型，80 μg·mL^-1的BLF能緩解奶牛乳腺上皮細(xì)胞（bovine mammary epithelial cells，BMECs）的氧化應(yīng)激，并闡述了其相關(guān)作用機(jī)制^［15-17］，但BLF對BMECs焦亡是否具有保護(hù)效果尚未明晰。因此，本研究通過構(gòu)建H 2O 2誘導(dǎo)的BMECs焦亡模型，深入探討B(tài)LF對細(xì)胞焦亡的影響，為BLF作為緩解BMECs焦亡的天然植物飼料添加劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與耗材

原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所智慧畜牧業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊惠贈；98%竹葉黃酮由浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院贈予。其余試劑與耗材如表1所示。

1.2 主要儀器設(shè)備

本研究所用主要儀器設(shè)備如表2所示。

1.3 試劑配制

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)液

DMEM/F-12 +10% FBS+1%雙抗，配制為細(xì)胞完全培養(yǎng)液；DMEM/F-12 +2% FBS，為細(xì)胞維持培養(yǎng)液；BLF處理液取純度98%的BLF 5 mg加5 mL維持培養(yǎng)基，得到1 mg·mL^-1的儲備液，根據(jù)所需培養(yǎng)基體積進(jìn)行稀釋，使BLF濃度最終為80 μg·mL^-1；H 2O 2處理液：取100 μL 30%的H 2O 2與870 μL的細(xì)胞維持培養(yǎng)基配制成1 mmol·L^-1的H 2O 2儲備液；將一定體積的H 2O 2貯備液加入到一定體積的細(xì)胞維持培養(yǎng)基中進(jìn)一步稀釋處理細(xì)胞，使H 2O 2的濃度為800 μmol·L^- 以上試劑現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 Western blot用試劑

1.3.2.1 2 L SDS-PAGE電泳液：

6 g Tris+28.8 g甘氨酸+2 g SDS+800 mL去離子水，混勻后定容至2 L，備用。

1.3.2.2 2 L轉(zhuǎn)膜液：6 g Tris+28.8 g甘氨酸+200 mL甲醇+800 mL去離子水，4℃冰箱儲存。當(dāng)?shù)鞍追肿恿看笥?0 ku時，轉(zhuǎn)膜液中另需添加2 g的SDS。

1.4 試驗方法

1.4.1 試驗分組

試驗分為對照組、BLF組、H 2O 2組和BLF+H 2O 2共處理組。按上述方法將BMECs培養(yǎng)在60 mm平皿中，融合度達(dá)85%，添加處理液：對照組不添加H 2O 2和BLF；BLF組濃度為80 μg·mL^-1；H 2O 2組用800 μmol·L^-1 H 2O 2處理細(xì)胞24 h；BLF與H 2O 2共處理組先用80 μg·mL^-1 BLF預(yù)處理24 h后，再用800 μmol·L^-1 H 2O 2處理細(xì)胞8 h。

1.4.2 細(xì)胞培養(yǎng)

1.4.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇：

轉(zhuǎn)移液氮中裝有奶牛乳腺上皮細(xì)胞的凍存管至37 ℃水浴鍋快速融化，移入裝有預(yù)熱完全培養(yǎng)液的15 mL離心管中，吹打混勻，1 500 r·min^-1離心5 min，棄去上清，重懸后移至60 mm培養(yǎng)皿孵育。

1.4.2.2 細(xì)胞換液：

培養(yǎng)2 d后看培養(yǎng)基顏色和細(xì)胞狀態(tài)，培養(yǎng)基變?yōu)榈S色則吸出培養(yǎng)液，PBS洗2遍后加入新培養(yǎng)液繼續(xù)孵育。

1.4.2.3 細(xì)胞傳代：

細(xì)胞融合度達(dá)85%，PBS沖洗2次，吸取1 mL 0.25%胰酶于平皿作用1 min，吸取1 mL培養(yǎng)液迅速停止消化。收集細(xì)胞懸液，上述條件離心后棄上清，重懸至新培養(yǎng)皿孵育。

1.4.3 RT-qPCR 檢測焦亡相關(guān)基因

1.4.3.1 細(xì)胞總RNA的提?。?/p>

將細(xì)胞培養(yǎng)皿置于冰盒上或盛滿冰塊的鐵盤中，吸取培養(yǎng)基，PBS沖洗2次。各孔加入500 μL TRIzol，作用均勻后刮凈細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL無RNA酶管；加入100 μL氯仿，震蕩混勻后放置2 min；離心15 min（4℃，12 000×g）。取上層300 μL移至新無RNA酶管，另取等量異丙醇搖勻靜放10 min，離心10 min（4℃，12 000×g）；留沉淀加75%乙醇離心5 min（4℃，7 500×g）沖洗2次；棄上清離心3 min（4℃，12 000×g），開蓋靜置3～5 min后加50 μL DEPC。NanoDrop微量分光光度計測量總RNA濃度。-80℃儲存。

1.4.3.2 cDNA合成反應(yīng)液：

參考Erik的cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，反應(yīng)條件與本實驗室?；?sup>［18^］的前期研究一致。

1.4.3.3 實時熒光定量PCR：

使用ACTB和GAPDH作為內(nèi)參，將反轉(zhuǎn)錄成功的NLRP3、Nek7、ASC、p65、GSDMD、IL-18和 IL-1β樣品的cDNA加入PCR反應(yīng)系統(tǒng)，體系配制和擴(kuò)增條件參考本實驗室前期研究^［16］。2^-ΔΔCt法被用于計算mRNA相對表達(dá)量。引物序列如表3所示。

1.4.4 Western blot檢測焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

1.4.4.1 制備細(xì)胞蛋白樣品：

分組培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)PBS沖洗2次，每次3 min，取1 mL以100∶1∶2混合的RIPA+PMSF+磷酸酶抑制劑于培養(yǎng)皿，刮蹭細(xì)胞移至1.5 mL離心管中；離心10 min（4℃，12 000 r·min^-1）取上液。BCA試劑盒測定濃度后加入SDS Loading Buffer保持濃度一致。沸水浴10 min，保存至-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4.2 電泳：

根據(jù)蛋白分子量大小參考試劑盒說明選取對應(yīng)的濃度配置分離膠（8%、10%、12%）和濃縮膠（5%）；倒入電泳液沒過內(nèi)側(cè)玻璃板，加入10 μL樣品至拔出梳子后的孔，最左孔添加5 μL彩" 色預(yù)染蛋白（Marker）進(jìn)行參考。加入電泳液電泳；濃縮膠（80 V，30 min），分離膠（120 V，1 h）。

1.4.4.3 轉(zhuǎn)膜：

根據(jù)彩色預(yù)染蛋白切出所需凝膠，轉(zhuǎn)移至厚濾紙上，將剪切好并且經(jīng)甲醇浸泡的PVDF膜鋪滿凝膠，上蓋一張厚濾紙，閉合轉(zhuǎn)膜所需夾子。全程注意氣泡。轉(zhuǎn)膜與分子量大小同等的時間（20 ku以下小蛋白直流 300 mA；其余蛋白直流350 mA）。如需30 min以上的轉(zhuǎn)膜，則置于裝滿冰水的盆中進(jìn)行。

1.4.4.4 封閉：

TBST洗膜5 min，快速封閉液在37℃封閉15 min。

1.4.4.5 一、二抗孵育：

膜在TBST 中洗3次，每次5 min，后經(jīng)一抗4℃孵育過夜；次日在TBST中 沖洗3次，每次進(jìn)行15 min，處理后經(jīng)二抗室溫孵育60 min。

1.4.4.6 顯色：

TBST 中沖洗3次，每次為15min，置于天能化學(xué)發(fā)光成像儀，膜上滴滿ECL顯色液曝光。用Image J檢測分析圖像。

1.4.5 免疫熒光技術(shù)檢測ASC熒光強(qiáng)度

1.4.5.1 分組：

同“1.4.1”，將細(xì)胞接種至6孔板培養(yǎng)。

1.4.5.2 固定：

吸取各培養(yǎng)孔上清，用PBS沖洗3次，每次操作5 min，每孔1 mL 4%多聚甲醛固定30 min，晾干。

1.4.5.3 通透及封閉：

PBS沖洗3次，每次3 min，再加入 0.3%Triton X-100進(jìn)行25 min通透；再用PBS沖洗3次，每次3 min，最后3% BSA 等待60 min，封閉抗原。

1.4.5.4 一、二抗孵育：

棄封閉液+ASC一抗（1∶100），濕盒37 ℃孵育2 h；PBS沖洗5次，每次3 min再用FITC（1∶100）處理1 h。

1.4.5.5 封片：

用PBS沖洗5次，每次3min，再抗熒光猝滅封片液（含DAPI）處理5 min。熒光顯微鏡觀察。

1.4.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測BLF和H 2O 2對奶牛乳腺上皮細(xì)胞焦亡的影響

根據(jù)說明書操作，每組1×10^5～6細(xì)胞收集于1.5 mL離心管，離心取沉淀1 mL細(xì)胞染色緩沖液重懸；加入5 μL Hoechst 33341和5 μL PI染色，4℃搖床孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測紅藍(lán)熒光。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗結(jié)果在Office16的 Excel中進(jìn)行處理，得出的數(shù)據(jù)經(jīng)過SPSS 26.0進(jìn)行ANOVA的單因素方差分析，使用Duncan’s 法進(jìn)行組間多重比較，P≤0.05為差異顯著，Pgt;0.05為差異不顯著。最終結(jié)果由origin 2021捕捉數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖呈現(xiàn)。

2 結(jié) 果

2.1 H 2O 2對奶牛乳腺上皮細(xì)胞焦亡的影響

本實驗室前期研究顯示，800 μmol·L^-1 H 2O 2處理BMECs 8 h對奶牛乳腺上皮細(xì)胞有顯著損傷^［9］。使用Hoechst 33342/PI雙染細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞檢測，確認(rèn)該濃度下H 2O 2對奶牛乳腺上皮細(xì)胞焦亡的影響，如圖1所示，右上角長方形框內(nèi)即為焦亡細(xì)胞，結(jié)果顯示，使用800 μmol·L^-1 H 2O 2處理BMECs 8 h顯著增加了奶牛乳腺上皮細(xì)胞的焦亡（P＜0.05）。

2.2 H 2O 2對奶牛乳腺上皮細(xì)胞焦亡相關(guān)基因的影響

在提取總RNA后，使用RT-qPCR對焦亡相關(guān)mRNA表達(dá)進(jìn)行分析，確定800 μmol·L^-1的H 2O 2處理8 h是否是誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞焦亡的直接誘因。NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD、 IL-18、IL-1β被重點監(jiān)測。結(jié)果如圖2所示，與對照組相比，在H 2O 2的誘導(dǎo)下NLRP3、ASC、GSDMD、IL-18、IL-1β的相對表達(dá)量均顯著升高（P＜0.05），尤其是NLRP3炎癥小體相關(guān)的表達(dá)。說明H 2O 2處理8 h顯著提高了細(xì)胞焦亡相關(guān)基因的表達(dá)和炎癥小體的表達(dá)活性，表明細(xì)胞受到氧化損傷后出現(xiàn)了細(xì)胞焦亡。

2.3 H 2O 2對奶牛乳腺上皮細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白的影響

如圖3，Western blot結(jié)果進(jìn)一步驗證了800 μmol·L^-1 H 2O 2處理BMECs 8 h顯著提高胞內(nèi)焦亡通路相關(guān)蛋白NLRP3、ASC、Nek7、pro-caspase1、caspase1 p20、GSDMD-N、IL-18和IL-1β的表達(dá)水平（P＜0.05）。說明800 μmol·L^-1 H 2O 2處理8 h后通過升高NLRP3和ASC等焦亡相關(guān)蛋白，致使奶牛乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞焦亡。同時也說明H 2O 2處理8 h后能建立穩(wěn)定有效的BMECs焦亡模型。

2.4 BLF對奶牛乳腺上皮細(xì)胞焦亡的影響

為探究BLF對奶牛乳腺上皮細(xì)胞以及對H 2O 2誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞焦亡的影響，加入BLF處理組和BLF+H 2O 2共處理組，以明確BLF的保護(hù)作用。BLF的處理時間24 h與濃度80 μg·mL^-1的設(shè)定參考本實驗室詹經(jīng)緯等^［17］的前期研究。如圖4所示，BLF的加入可以降低正常細(xì)胞的焦亡水平，并且BLF+ H 2O 2共處理組的焦亡水平顯著低于僅用H 2O 2處理的結(jié)果。

2.5 BLF對焦亡相關(guān)基因的影響

本研究還通過對H 2O 2誘導(dǎo)組與BLF組、BLF+H 2O 2共處理組的焦亡相關(guān)mRNA表達(dá)進(jìn)行對比（圖5），可以看出BLF單獨處理可以使ASC、Nek7和IL-1β的mRNA水平低于對照組（P＜0.05）；同時，盡管H 2O 2引起了NLRP3、Nek7、ASC、GSDMD、IL-18、IL-1β的mRNA上調(diào)，但BLF的添加顯著降低了這種趨勢，使其恢復(fù)到正常水平甚至更低（P＜0.05）。

2.6 BLF對焦亡相關(guān)蛋白的影響

Western blot結(jié)果見圖6，與H 2O 2單獨處理組相比，BLF顯著緩解了H 2O 2導(dǎo)致的NLRP3、ASC、Nek7、pro-caspase1、caspase1 p20、GSDMD-N、IL-18和IL-1β等胞內(nèi)焦亡蛋白表達(dá)的升高（P＜0.05），尤其是caspase1 p20和Nek7的蛋白表達(dá)量（P＜0.05），但并沒有使其恢復(fù)到對照組的水平。

2.7 BLF對ASC斑點的影響

應(yīng)用熒光顯微鏡觀察不同處理組ASC斑點的形成，ASC斑點熒光強(qiáng)度表明細(xì)胞焦亡的程度（圖7）。使用帶有FITC熒光的二抗與ASC一抗結(jié)合，檢測焦亡中的重要蛋白ASC，可以看到BLF單獨處理的ASC斑點沒有被激活；在H 2O 2誘導(dǎo)下ASC斑點形成，其熒光強(qiáng)度顯著高于對照組（P＜0.05）；而使用BLF預(yù)處理后再用H 2O 2誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞，可以看到ASC的熒光強(qiáng)度顯著降低（P＜0.05），說明BLF可降低細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，在一定程度上對細(xì)胞具有保護(hù)作用。

3 討 論

奶牛在圍產(chǎn)后期和泌乳期代謝旺盛，易導(dǎo)致機(jī)體能量負(fù)平衡，引發(fā)氧化應(yīng)激并產(chǎn)生過量ROS^［19］。過量的ROS將導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)大分子發(fā)生氧化損傷，最終可能引起細(xì)胞焦亡、細(xì)胞衰老、死亡和基因突變等嚴(yán)重后果^［20］。細(xì)胞焦亡作為一種Caspase-1/Caspase-11依賴性的程序性細(xì)胞死亡過程，起源于炎性小體的形成，最終激活包括IL-1β和IL-18在內(nèi)的多種炎癥因子并通過新開的膜孔通道釋放^［21］。焦亡的經(jīng)典通路主要由Gasdermin D （GSDMD）執(zhí)行，其過程中細(xì)胞不斷擴(kuò)張直至破裂，釋放細(xì)胞內(nèi)容物，觸發(fā)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)^［22-23］。GSDMD蛋白在一定刺激下激活Caspase- 激活后切割GSDMD蛋白釋放氨基端，氨基端GSDMD蛋白高度聚集后結(jié)合膜脂質(zhì)，破壞細(xì)胞膜完整性，形成穿孔性膜孔，導(dǎo)致細(xì)胞逐漸腫脹并最終破裂死亡^［24-25］。機(jī)體代謝過程中產(chǎn)生的ROS充當(dāng)信號分子參與了先天和適應(yīng)性免疫細(xì)胞的激活。研究表明，ROS作為NLRP3炎性小體的觸發(fā)和調(diào)節(jié)因子，參與NLRP3炎性小體的激活，從而誘導(dǎo)Caspase-1依賴的細(xì)胞焦亡^［26］。葛子碩等^［27］研究結(jié)果表明，心肌缺血缺氧引起大量Ca²⁺內(nèi)流和ROS累積，通過激活NLR識別信號，導(dǎo)致NLRP3炎性小體的組裝。蘇日娜等^［28］的研究發(fā)現(xiàn)，H 2O 2處理巨噬細(xì)胞可導(dǎo)致IL-1β分泌水平顯著增加和Caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡率升高，提示H 2O 2具有誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞焦亡的能力。本研究結(jié)果表明，H 2O 2處理后的BMECs出現(xiàn)明顯的細(xì)胞損傷，其NLRP3、ASC、GSDMD、IL-18、IL-1β的mRNA相對表達(dá)量均呈顯著上升趨勢，尤其是NLRP3炎癥小體的mRNA表達(dá)量。另外，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞壞死比例增加，證實了H 2O 2顯著提高了BMECs焦亡水平，與前人的研究結(jié)果一致^［29］。因此，本試驗采用H 2O 2處理BMECs構(gòu)建焦亡模型。

BLF是一種從竹葉中提取的新型天然抗氧化劑，其黃酮類成分主要以槲皮素、異鼠李素為主^［30］。已有研究證實BLF具有抑菌作用，可有效降低血液中甘油三酯、膽固醇等含量，促進(jìn)低密度脂蛋白在肝中的降解，具有強(qiáng)烈的自由基清除能力，同時抑制亞硝酸鹽的形成^［31-32］。研究表明，BLF的特異性結(jié)構(gòu)，尤其是2-苯基色原酮，是其發(fā)揮抗炎、抗氧化、增強(qiáng)免疫等功能的基礎(chǔ)，對保護(hù)奶牛乳腺上皮細(xì)胞至關(guān)重要^{［14，33-34］}。詹經(jīng)緯等^［17］的研究證實了BLF對H 2O 2誘導(dǎo)的BMECs凋亡和ROS生成的抑制作用，通過緩解線粒體損傷、恢復(fù)抗氧化能力保護(hù)BMECs免受氧化損傷。袁書立^［35］的研究表明，BLF中的葒草苷有助于促進(jìn)運動骨骼肌受損大鼠中Nrf2的轉(zhuǎn)錄和核轉(zhuǎn)位，從而減輕骨骼肌的炎癥和氧化應(yīng)激。盡管以上研究已經(jīng)充分證明了BLF在抗炎、抗痛、抗氧化等方面的廣泛作用，然而關(guān)于其對細(xì)胞焦亡的影響仍鮮有研究。在本試驗中，研究對H 2O 2刺激的BMECs進(jìn)行800 μg·mL^-1BLF預(yù)處理以模擬H 2O 2對BLF預(yù)處理細(xì)胞的影響，探究BLF預(yù)處理是否對H 2O 2誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡具有保護(hù)作用。結(jié)果表明，BLF顯著降低了由H 2O 2誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡的相關(guān)基因（NLRP3、Nek7、ASC、GSDMD、IL-18、IL-1β）的mRNA及相關(guān)蛋白（NLRP3、ASC、Nek7、pro-caspase1、caspase1 p20、GSDMD-N、IL-18和IL-1β）表達(dá)量上調(diào)，恢復(fù)了ASC斑點熒光水平，BLF通過經(jīng)典途徑緩解了NLRP3、ASC、caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡（圖8）。但是BLF對相關(guān)基因及蛋白的影響程度并不是完全一致的，對比對照組、BLF組發(fā)現(xiàn)：BLF添加可顯著降低Nek7、ASC、IL-18 mRNA表達(dá)量至對照水平以下，GSDMD mRNA表達(dá)量與對照組相比具有下降趨勢，并且細(xì)胞焦亡程度也有所下降，可能是BLF調(diào)控了BMECs自身由線粒體產(chǎn)生的ROS，影響了焦亡相關(guān)mRNA表達(dá)量，但焦亡相關(guān)蛋白可能處于穩(wěn)態(tài)，BLF尚未對其產(chǎn)生影響效果。該推測與詹經(jīng)緯等^［17］的試驗結(jié)果具有一致性，即BLF能夠緩解線粒體ROS的產(chǎn)生。結(jié)合對照組、H 2O 2組、BLF組、共處理組的相關(guān)基因及蛋白的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：共處理組的Nek7、IL-18 mRNA表達(dá)量顯著低于對照組，NLRP3等其他mRNA水平僅下降至對照組水平；且共處理組的Nek7 、ASC、caspase1 p20、IL-18蛋白表達(dá)量顯著下降，但焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)量均無法下降至對照組水平。與紀(jì)凌云等^［36］研究結(jié)果一致，加入黃芩-黃連對后顯著降低了主動脈組織中NLRP3、ASC、caspase-1、IL-18等mRNA表達(dá)水平；降低主動脈組織中ASC、IL-18等焦亡蛋白的表達(dá)。由此，BLF可能是通過調(diào)控焦亡相關(guān)mRNA降低了焦亡相關(guān)蛋白從而實現(xiàn)緩解細(xì)胞焦亡的過程而非直接影響焦亡相關(guān)蛋白，特別是Nek7、IL-18 mRNA可能是BLF影響強(qiáng)度較大的基因，蛋白表達(dá)水平與mRNA降低趨勢一致。

綜上所述，BLF能夠干預(yù)H 2O 2誘導(dǎo)的BMECs中NLRP3炎癥小體的調(diào)控，保護(hù)細(xì)胞免受過量ROS引起的細(xì)胞焦亡。

4 結(jié) 論

4.1 H 2O 2顯著上調(diào)NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18等焦亡相關(guān)基因和蛋白水平，誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞焦亡。

4.2 BLF通過降低NLRP3炎癥小體通路蛋白和基因的表達(dá)，降低炎癥因子水平，緩解奶牛乳腺上皮細(xì)胞焦亡。

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