摘 要： 旨在探究玻璃化冷凍對(duì)豬孤雌激活（parthenogenetic activation， PA）囊胚基因組甲基化水平的影響。以豬第6天PA囊胚為研究對(duì)象，分別采用常規(guī)玻璃化冷凍液（玻璃化冷凍Ⅰ組）和改良玻璃化冷凍液（玻璃化冷凍Ⅱ組）進(jìn)行玻璃化冷凍-復(fù)蘇試驗(yàn)，每組選擇3枚復(fù)蘇形態(tài)良好的囊胚用于單細(xì)胞全基因組甲基化測(cè)序（single cell whole-genome bisulfite sequencing，scWGBS），分析囊胚基因組甲基化水平變化。結(jié)果顯示，與新鮮組相比，玻璃化冷凍Ⅰ組豬PA囊胚的基因組整體甲基化水平極顯著降低（18% vs. 20.9%， Plt;0.01），而玻璃化冷凍Ⅱ組顯著升高（21.5% vs. 20.9%， Plt;0.05）。與新鮮組相比，在玻璃化冷凍Ⅰ組共鑒定到2 717個(gè)差異甲基化區(qū)域（differential methylation region， DMR），而在玻璃化冷凍Ⅱ組共鑒定到1 964個(gè)DMRs?；蚬δ芨患治鼋Y(jié)果顯示，玻璃化冷凍導(dǎo)致胚胎發(fā)育、ATP代謝、MAPK信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路等生物學(xué)過程相關(guān)基因的甲基化水平發(fā)生紊亂。在玻璃化冷凍Ⅱ組中，Hippo信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路和mTOR信號(hào)通路等生物學(xué)過程更為活躍。綜上所述，玻璃化冷凍改變豬PA囊胚基因組甲基化水平，其可能通過擾亂胚胎發(fā)育、ATP代謝、MAPK信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路等相關(guān)基因的甲基化水平進(jìn)而損害豬PA囊胚凍后發(fā)育。此外，Hippo信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路和mTOR信號(hào)通路可作為緩解玻璃化冷凍損傷的候選途徑。

關(guān)鍵詞： 豬；孤雌激活；囊胚；玻璃化冷凍；scWGBS

中圖分類號(hào)： S828.2"""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：Anbsp;""" 文章編號(hào)： 0366-6964（2025）01-0222-10

收稿日期：2024-07-30

基金項(xiàng)目：重慶市技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用發(fā)展專項(xiàng)重點(diǎn)項(xiàng)目（cstc2021jscx-dxwtBX0004）；重慶市人民政府與中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院戰(zhàn)略合作資助項(xiàng)目（重慶地方豬胚胎冷凍保存技術(shù)研究與豬育種新材料創(chuàng)制，23310）

作者簡(jiǎn)介：楊柏高（1991-），男，重慶人，博士，主要從事動(dòng)物繁殖研究，E-mail：Yangbaigao915@163.com

*通信作者：潘紅梅，主要從事動(dòng)物繁殖育種與遺傳資源保存研究，E-mail：panhm_2118@163.com

YANG" Baigao 其在胚胎細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用^［1］。已有研究顯示，人^［2］、小鼠^［3］、豬^［4］等的胚胎在不同發(fā)育時(shí)期具有不同的基因組甲基化水平，甲基化水平的穩(wěn)態(tài)調(diào)控與其發(fā)育能力密切相關(guān)。玻璃化冷凍是廣泛應(yīng)用于人類輔助生殖、動(dòng)物資源保存的超低溫保存技術(shù)，然而，玻璃化冷凍導(dǎo)致小鼠^［5］、牛^［6］等胚胎基因組甲基化紊亂。豬孤雌激活（parthenogenetic actication，PA）胚胎是研究豬胚胎玻璃化冷凍技術(shù)的理想試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，已幫助研究人員探索諸多改良方案，但玻璃化冷凍對(duì)豬PA囊胚基因組甲基化的影響仍不清楚。

單細(xì)胞全基因組甲基化測(cè)序技術(shù)（single cell whole-genome bisulfite sequencing，scWGBS）能在單細(xì)胞水平分析全基因組甲基化水平，已被廣泛應(yīng)用于人^［7］、小鼠^［8］、綿羊^［9］等胚胎基因組甲基化水平研究。本研究基于scWGBS技術(shù)對(duì)新鮮組、玻璃化冷凍Ⅰ組和玻璃化冷凍Ⅱ組豬PA囊胚進(jìn)行全基因組甲基化水平分析，以期揭示玻璃化冷凍對(duì)其基因組甲基化水平的影響，為改良豬胚胎玻璃化冷凍技術(shù)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑

除有特殊標(biāo)注的試劑外，其余試劑均從美國(guó)Sigma公司購(gòu)買。

1.2 卵母細(xì)胞體外成熟

在當(dāng)?shù)赝涝讏?chǎng)獲取新鮮豬卵巢，利用含75 μg·mL^-1青霉素和50 μg·mL^-1鏈霉素的37℃生理鹽水進(jìn)行沖洗、保存和運(yùn)輸，2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。抽取直徑為2～8 mm的卵泡，卵泡液靜置15 min后，挑選含有2～3層卵丘細(xì)胞的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物（cumulus-oocyte complexes， COCs）。將復(fù)合物在含1%雙抗的緩沖液中洗滌3次，在M199中洗滌一次，隨后將復(fù)合物移入培養(yǎng)皿，每孔50枚，并加入500 μL體外成熟（in vitro maturation，IVM）液。IVM液的基礎(chǔ)液為TCM-199，加入10%豬卵泡液，0.55 g·L^-1 葡萄糖、0.07 g·L^-1半胱氨酸、0.1 g·L^-1 丙酮酸鈉，以及10 IU·mL^-1 LH、10 ng·mL^-1 EGF、10 IU·mL^-1 FSH。培養(yǎng)溫度38.5 ℃，CO 2濃度5%、飽和濕度，培養(yǎng)44 h。

1.3 孤雌激活

采用電激活和化學(xué)輔助激活結(jié)合的方式進(jìn)行豬成熟卵母細(xì)胞孤雌激活。提前配置電激活液（0.3 mol·L^-1甘露醇、0.1 mmol·L^-1 MgCl 2和50 μmol·L^-1 CaCl 2）和化學(xué)輔助激活液（PZM-3+5 μg·mL^-1 CB+10 μg·mL^-1放線菌酮）。

使用0.1%透明質(zhì)酸酶去除卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體中的卵丘細(xì)胞，獲得裸卵母細(xì)胞。設(shè)置電激活參數(shù)1.2 kV·cm^-1、30 μs，脈沖1次，在電激活液中預(yù)清洗卵母細(xì)胞，時(shí)間30 s，隨后移入電激活池進(jìn)行孤雌激活，完成后將母細(xì)胞移入化學(xué)輔助激活液中培養(yǎng)4 h，然后將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含PZM-3的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，挑選第6天的囊胚用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 玻璃化冷凍和解凍

采用Cryotop載體法進(jìn)行玻璃化冷凍。提前配置玻璃化冷凍液Ⅰ（PZM-3含7.5% EG、7.5% DMSO、20% FBS），冷凍液Ⅱ（PZM-3含0.4 mol·L^-1蔗糖、15% EG、15% DMSO、20% FBS），解凍液Ⅰ（PZM-3含0.3 mol·L^-1蔗糖、20% FBS）和解凍液Ⅱ（PZM-3含0.15 mol·L^-1蔗糖、20% FBS）。

玻璃化冷凍步驟：囊胚在冷凍液Ⅰ中平衡5 min，移入冷凍液Ⅱ中平衡20 s，轉(zhuǎn)移至Cryotop載片，投入液氮。玻璃化解凍步驟：預(yù)熱解凍液I，將含囊胚的Cryotop載片充分浸入其中，移除載片，平衡3 min后將胚胎轉(zhuǎn)移至解凍液Ⅱ中，平衡3 min。在PZM-3中輕緩洗滌3次，放入含PZM-3的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h，挑取形態(tài)良好的囊胚，移入裂解液，每管1枚，每組3個(gè)重復(fù)，在-80 ℃條件保存。玻璃化冷凍Ⅰ組（BB）采用常規(guī)玻璃化冷凍液，玻璃化冷凍Ⅱ組（CC）采用實(shí)驗(yàn)室改良玻璃化冷凍液（提高熱傳遞效率、緩解冷凍損傷、改善能量代謝等，專利號(hào)：202311731656.6），新鮮組（AA）直接移入裂解液。

1.5 甲基化測(cè)序文庫構(gòu)建及上機(jī)測(cè)序

單細(xì)胞全基因組甲基化測(cè)序文庫構(gòu)建：將CA磁珠加入裂解液，充分震蕩，離心5 min，收集CA磁珠，利用EZ-96 DNA Methylation-Direct^TMMagPrep （Zymo）進(jìn)行重亞硫酸鹽處理，完成CT轉(zhuǎn)換，并將模板變?yōu)閱捂湣Ｊ褂脦в猩锼豣iotin 標(biāo)記的oligo1引物合成第一鏈，利用AMP磁珠純化多余的oligo1引物，然后使用oligo2合成二鏈，利用PCR引入Index，再利用AMP磁珠純化多余的oligo2引物，對(duì)以上擴(kuò)增子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用AMP磁珠純化產(chǎn)物后作為測(cè)序文庫。利用極客基因科技有限公司illlumina Novaseq6000 PE150平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.6 生物信息學(xué)分析

利用FstqQC（https：//www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc）檢查原始數(shù)據(jù)質(zhì)量，隨后采用Trimmomatic^［10］過濾adapter序列、低質(zhì)量的堿基和受污染的序列。利用BS_seeker2^［11］的bs_seeker2-align.pybt2（參數(shù)：-p 1-aligner=bowtie2-m 0.06-bt2-local）將保留序列比對(duì)至豬參考基因組（Sscrofa11.1），利用bs_seeker2-call_methyl.py檢測(cè)甲基化位點(diǎn)數(shù)和數(shù)量（參數(shù)：rm-CCGG；rm-overlap），隨后使用CGmaptools^［12］工具，按50 kb劃分窗口統(tǒng)計(jì)基因組甲基化水平、基因元件（gene element）甲基化水平，基于基因及側(cè)翼2 kb序列（gene body and flanking，基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游2 000 bp至轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)下游2 000 bp）分析差異甲基化區(qū)域（differential methylation regions， DMRs），基于覆蓋度≥2×的CpG位點(diǎn)，將Plt;0.00 △mC≥0.5的區(qū)域鑒定為DMR。使用CGmaptools進(jìn)行繪圖。利用KOBAS^［13］進(jìn)行 Gene Ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）基因功能富集分析。

2 結(jié) 果

2.1 scWGBS測(cè)序數(shù)據(jù)

從9個(gè)測(cè)序文庫中平均獲得22 012萬條讀數(shù)/樣本，過濾后保留20 677萬條讀數(shù)/樣本，Q20在96.41%～96.29%之間，Q30在89.48%～90.00%之間，甲基化位點(diǎn)轉(zhuǎn)化率在99.14%～99.27%之間。原始測(cè)序數(shù)據(jù)已上傳到CNSA數(shù)據(jù)庫，項(xiàng)目號(hào)為：CNP0005392。

2.2 新鮮組（AA）、玻璃化冷凍Ⅰ組（BB）和玻璃化冷凍Ⅱ組（CC）豬PA囊胚全基因組甲基化水平

基于全基因組甲基化位點(diǎn)分析，結(jié)果顯示，與新鮮組相比，玻璃化冷凍Ⅰ組豬PA囊胚基因組甲基化水平極顯著降低（18% vs. 20.9%， Plt;0.01），玻璃化冷凍Ⅱ組豬PA囊胚基因組甲基化水平顯著升高（21.5% vs. 20.9%， Plt;0.05）；聚類分析結(jié)果顯示，新鮮組和玻璃化冷凍Ⅱ組聚為一類（圖1A-D）。

2.3 新鮮組（AA）、玻璃化冷凍Ⅰ組（BB）和玻璃化冷凍Ⅱ組（CC）豬PA囊胚基因組基因及側(cè)翼2 kb序列差異甲基化區(qū)域分析

基于基因及側(cè)翼2 kb序列對(duì)新鮮組、玻璃化冷凍Ⅰ組和玻璃化冷凍Ⅱ組豬PA囊胚基因組甲基化水平進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示，玻璃化冷凍Ⅰ組的平均甲基化水平低于新鮮組和玻璃化冷凍Ⅱ組（圖2A-C）。

與新鮮組相比，從玻璃化冷凍Ⅰ組鑒定到865個(gè)高甲基化DMRs，1 852個(gè)低甲基化DMRs，共注釋到2 132個(gè)差異甲基化基因（differential methylation genes， DMGs），其中284個(gè)具有啟動(dòng)子區(qū)DMRs（圖2D，圖2G，圖2J-K）。此外，從玻璃化冷凍Ⅱ組鑒定到1 090個(gè)高甲基化DMRs，874個(gè)低甲基化DMRs，共注釋到1 666個(gè)DMGs，其中169個(gè)具有啟動(dòng)子區(qū)DMRs（圖2E，圖2H，圖2J-K）。玻璃化冷凍Ⅱ組與玻璃化冷凍Ⅰ組相比，共鑒定到1 916個(gè)高甲基化DMRs，749個(gè)低甲基化DMRs，共注釋到2 080個(gè)DMGs，其中318個(gè)具有啟動(dòng)子區(qū)DMRs（圖2F，圖2I，圖2J-K）。

2.4 基因功能富集分析

對(duì)高甲基化DMGs和低甲基化DMGs分別進(jìn)行基因功能富集分析，GO分析結(jié)果顯示，與新鮮組相比，玻璃化冷凍Ⅰ組的高甲基化DMGs被顯著富集到早期內(nèi)質(zhì)體、沙弗側(cè)支-CA1突觸、核質(zhì)等360個(gè)GO條目（Plt;0.05），低甲基化DMGs被富集到GTP酶激活劑活性、肌動(dòng)蛋白絲結(jié)合、鈣離子結(jié)合等506個(gè)GO條目（圖3A）。與新鮮組相比，玻璃化冷凍Ⅱ組的高甲基化DMGs被顯著富集到GTP酶激活劑活性、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、肽基酪氨酸磷酸化440個(gè)GO條目，低甲基化DMGs被顯著富集到谷氨酸能突觸、突觸后密度、細(xì)胞粘附等316個(gè)GO條目（圖3C，Plt;0.05）。玻璃化冷凍Ⅱ組與玻璃化冷凍Ⅰ組相比，高甲基化DMGs被顯著富集到GTP酶活性的正向調(diào)節(jié)、GTP酶激活劑活性、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等470個(gè)GO條目，低甲基化DMGs顯著被富集谷氨酸能突觸、蛋白質(zhì)二聚化活性、細(xì)胞連接等330個(gè)GO條目（圖3E，Plt;0.05）。

KEGG分析結(jié)果顯示，與新鮮組相比，玻璃化冷凍Ⅰ組的高甲基化DMGs被顯著富集到PI3K-Akt信號(hào)通路、粘附點(diǎn)、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)等121個(gè)KEGG信號(hào)通路，低甲基化DMGs被顯著富集到cGMP-PKG 信號(hào)通路、病灶粘附、軸突導(dǎo)向等107個(gè)KEGG信號(hào)通路（圖3B，Plt;0.05）。與新鮮組相比，玻璃化冷凍Ⅱ組的高甲基化DMGs被顯著富集到鈣離子信號(hào)通路、谷氨酸能突觸、催產(chǎn)素信號(hào)通路108個(gè)KEGG信號(hào)通路，低甲基化DMGs被顯著富集到Hippo信號(hào)通路、mTOR信號(hào)通路、松弛素信號(hào)通路55個(gè)KEGG信號(hào)通路（圖3D，Plt;0.05）。玻璃化冷凍Ⅱ組與玻璃化冷凍Ⅰ組相比，高甲基化DMGs被顯著富集到Rap1信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路、泛素介導(dǎo)的蛋白水解等76個(gè)KEGG信號(hào)通路，低甲基化DMGs被顯著富集到Ras信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、催產(chǎn)素信號(hào)通路57個(gè)KEGG信號(hào)通路（圖3F，Plt;0.05）。

3 討 論

3.1 單細(xì)胞全基因組甲基化測(cè)序技術(shù)

常用于單細(xì)胞甲基化測(cè)序的方法包括全基因組亞硫酸氫鹽測(cè)序（WGBS）、簡(jiǎn)化代表性亞硫酸氫鹽測(cè)序（RRBS）、甲基化敏感限制性內(nèi)切酶（MSRE）等，前兩者基于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化法，后者基于酶對(duì)甲基化位點(diǎn)的親和性^［14］，重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化法被認(rèn)為是甲基化分析的金標(biāo)準(zhǔn)，被廣泛應(yīng)用于單細(xì)胞甲基化測(cè)序^{［7，9］}。本研究基于scWGBS技術(shù)獲得新鮮組、玻璃化冷凍Ⅰ組和玻璃化冷凍Ⅱ組豬PA囊胚的全基因組甲基化測(cè)序數(shù)據(jù)，經(jīng)過數(shù)據(jù)質(zhì)量檢查和過濾，滿足后續(xù)分析要求。

3.2 玻璃化冷凍對(duì)豬PA囊胚基因組甲基化水平的影響

已有研究表明，玻璃化冷凍導(dǎo)致小鼠囊胚基因組甲基化水平下降^［15］，與之類似，本研究發(fā)現(xiàn)玻璃化冷凍Ⅰ組中豬PA囊胚基因組甲基化水平極顯著降低（18% vs. 20.9%，Plt;0.01），然而，基因組不同區(qū)域的甲基化水平變化趨勢(shì)存在差異（圖1B）。

玻璃化冷凍-解凍豬胚胎伴隨著存活率低、凍后發(fā)育能力受損、ATP含量下降等問題^［16］。在本研究中，從玻璃化冷凍Ⅰ組鑒定到的2 132個(gè)DMGs，基因功能富集分析結(jié)果顯示，其中有55個(gè)基因被富集到胚胎植入（PPARD）、子宮內(nèi)胚胎發(fā)育（INPP5B、CHD7、BMPR1A等）、胚胎發(fā)育調(diào)控（TRIP12）等22條胚胎發(fā)育相關(guān)GO條目。PPARD在胚胎發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其缺失引起心血管發(fā)育異常^［17］。INPP5B在胚胎發(fā)育過程及后續(xù)胎兒腎臟、脾臟、腦等組織中表達(dá)，其缺失影響胚胎發(fā)育乃至死亡^［18］。CHD7是一種ATP依賴性核小體重塑因子，其缺失將導(dǎo)致心臟、神經(jīng)細(xì)胞等發(fā)育異常進(jìn)而引起胚胎發(fā)育障礙^［19］。BMPR1A在胚胎分化過程中發(fā)揮重要作用，BMPR1A缺失導(dǎo)致小鼠原腸胚發(fā)育失敗^［20］。TRIP12基因編碼E3泛素蛋白連接酶，通過調(diào)節(jié)TGFβ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與胚胎發(fā)育^［21］。因此，玻璃化冷凍引起的胚胎發(fā)育相關(guān)基因甲基化異常，可能導(dǎo)致豬PA囊胚后續(xù)發(fā)育受阻。

ATP是維持胚胎正常發(fā)育的必要能源，其生成、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝等生物學(xué)過程相關(guān)基因甲基化的異常可能導(dǎo)致胚胎生長(zhǎng)障礙。在玻璃化冷凍Ⅰ組豬PA囊胚中有315個(gè)DMGs被富集到三羧酸循環(huán)（SDHC）、ATP酶活性（KIF1B、MYO9B、KIFC1等）、ATP結(jié)合（EPHB2、MTOR）等相關(guān)生物學(xué)過程。SDHC編碼琥珀酸脫氫酶亞基，琥珀酸脫氫酶位于線粒體內(nèi)，是三羧酸循環(huán)中ATP生成的重要功能酶。KIF1B編碼驅(qū)動(dòng)蛋白，行使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸功能，在小鼠早期胚胎發(fā)育過程中參與紡錘體組裝、染色體聚集和線粒體分布等，其缺失引起ATP含量降低、胚胎發(fā)育受損^［22］。MYO9B編碼肌球蛋白，參與激動(dòng)蛋白組成，同時(shí)作為GTP酶激活蛋白，參與胚胎表皮細(xì)胞遷移，其缺失導(dǎo)致小鼠胚胎發(fā)育異常^［23］。KIFC1屬于驅(qū)動(dòng)蛋白家族，參與ATP合成運(yùn)輸、微絲組裝、紡錘體遷移等，其缺失引起小卵母細(xì)胞減數(shù)分裂異常^［24］。EPHB2編碼一種受體酪氨酸激酶跨膜糖蛋白，參與調(diào)節(jié)內(nèi)胚層發(fā)育^［25］。MTOR編碼mTOR通路關(guān)鍵蛋白，在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用^［26］。因此，玻璃化冷凍引起的ATP相關(guān)功能基因甲基化水平的升高可能導(dǎo)致豬PA囊胚ATP水平下降，進(jìn)而引發(fā)胚胎發(fā)育障礙。

此外，玻璃化冷凍還引起豬PA囊胚基因組中MAPK信號(hào)通路（MAPK1、MKNK1、MAPK8IP3等）、Wnt信號(hào)通路（WNT3、LEF1、CCND2等）、細(xì)胞衰老（RB1、RBL2、NFATC2等）等相關(guān)基因甲基化水平異常。MAPK信號(hào)通路在胚胎生長(zhǎng)、分化過程中發(fā)揮重要作用^［27］，相關(guān)基因甲基化水平的升高可能引起MAPK通路活性下降，進(jìn)而影響胚胎發(fā)育進(jìn)程。Wnt/β-catenin信號(hào)途徑參與早期胚胎發(fā)育^［28］，該途徑相關(guān)基因甲基化水平升高，可能導(dǎo)致胚胎細(xì)胞周期紊亂，如CCND2是細(xì)胞周期關(guān)鍵調(diào)控基因^［29］。此外，細(xì)胞衰老與細(xì)胞增殖、分化密切相關(guān)，如RB1、RBL2在胚胎內(nèi)胚層干細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用，相關(guān)基因甲基化水平異?？赡軐?dǎo)致胚胎細(xì)胞增殖異常^［30］。

3.3 改良玻璃化冷凍液成分對(duì)玻璃化冷凍豬PA囊胚基因組甲基化水平的影響

玻璃化冷凍Ⅱ組在常規(guī)冷凍液基礎(chǔ)上，通過提高降溫速率、緩解冷凍損傷、改善能量代謝等途徑，以期緩解玻璃化冷凍對(duì)豬PA囊胚基因組甲基化水平的影響。scWGBs測(cè)序分析結(jié)果顯示，相較于新鮮組，玻璃化冷凍Ⅱ組豬PA囊胚基因組甲基化水平受玻璃化冷凍的影響小于玻璃化冷凍Ⅰ組（21.5% vs. 20.9%， Plt;0.01; 18% vs. 20.9%， Plt;0.05），玻璃化冷凍Ⅱ組豬PA囊胚的基因組甲基化模式更接近于新鮮組（圖1D）。以新鮮組為參照，相比于玻璃化冷凍Ⅰ組，從玻璃化冷凍Ⅱ組豬PA囊胚基因組鑒定到的DMRs減少753個(gè)，同時(shí)高甲基化DMRs比例增多（1 090∶874 vs. 865∶1 852），涉及的DMRs減少467個(gè)。研究表明，在玻璃化冷凍過程中，溫度變化速度直接影響冷凍效果，提高降溫和升溫速率，可以降低結(jié)晶溫度停留時(shí)間，減少冰晶生成帶來的冷凍損傷^［31］。本研究通過改善玻璃化冷凍液和解凍液的熱傳遞效率，以提高冷凍過程中的變溫速率，減少冰晶生成導(dǎo)致的機(jī)械損傷。然而，由玻璃化冷凍導(dǎo)致的ATP下降^［32］、線粒體損傷^［33］、活性氧損傷^［34］等仍不可避免。因此本研究通過調(diào)整玻璃化冷凍液和解凍液成分，以緩解玻璃化冷凍損傷，改善胚胎能量代謝等，進(jìn)而改善胚胎冷凍效果。基于數(shù)據(jù)分析結(jié)果，本研究通過改良玻璃化冷凍液在一定程度上有助于緩解玻璃化冷凍對(duì)豬PA囊胚基因組甲基化水平的擾亂。

基因功能富集分析結(jié)果顯示，相比于玻璃化冷凍Ⅰ組，玻璃化冷凍Ⅱ組豬PA囊胚中有82個(gè)低甲基化DMGs顯著富集到ATP酶活性（MYO9B、ATP2A3、ABCC11等）、ATP結(jié)合（FARS2、MAP4K3、MYO3B）、GTP酶活性（TBC1D22B、ARHGAP22、TBC1D22A）等相關(guān)GO條目（Plt;0.05），表明玻璃化冷凍Ⅱ組豬PA囊胚ATP代謝相關(guān)功能更為活躍。此外，與新鮮組相比，玻璃化冷凍Ⅱ組豬PA囊胚中有32個(gè)低甲基化DMGs與Hippo信號(hào)通路（STK3、LATS2、DLG4）、PI3K-Akt信號(hào)通路（PI3K3CB、PIK3R5、AKT3等）和mTOR信號(hào)通路（WNT7A、MTOR、EIF4E2、AKT3等）顯著相關(guān)（Plt;0.05）。Mst1/2（STK3）、Lats1/2（LATS2）、Dlg（DLG4）是Hippo信號(hào)通路的重要調(diào)節(jié)因子，通過調(diào)節(jié)下游效應(yīng)因子YAP/TAZ參與胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)形成、滋養(yǎng)層分化、胚胎器官發(fā)育等^［35］。已有研究顯示，PI3K-Akt參與小鼠胚胎發(fā)育，抑制Akt活性導(dǎo)致小鼠桑葚胚發(fā)育阻滯^［36］、豬囊胚質(zhì)量下降^［37］，PI3K3CB、PIK3R5、AKT3等基因甲基化水平的下調(diào)可能促進(jìn)PI3K-Akt信號(hào)通路活性。mTOR信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)大鼠胚胎葉酸攝入，抑制mTOR信號(hào)通路導(dǎo)致胚胎發(fā)育受損^［26］。此外，據(jù)報(bào)道，PI3K/Akt/mTOR途徑廣泛參與調(diào)節(jié)生殖細(xì)胞增殖^［26］、胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞融合^［38］、胎盤代謝^［39］等生物學(xué)功能，其下調(diào)引起小鼠流產(chǎn)^［40］。因此，玻璃化冷凍Ⅱ組豬PA囊胚基因組中PI3K-Akt和mTOR信號(hào)通路等相關(guān)基因甲基化水平的變化可能參與調(diào)節(jié)凍后胚胎發(fā)育，而AKT3或許是關(guān)鍵調(diào)控基因之一。

綜上所述，玻璃化冷凍可能通過擾亂豬PA囊胚基因組中胚胎發(fā)育、ATP代謝、MAPK信號(hào)通路等相關(guān)基因的甲基化水平，進(jìn)而引起其凍后發(fā)育能力下降?；跀?shù)據(jù)分析，Hippo信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路和mTOR信號(hào)通路可作為緩解玻璃化冷凍甲基化損傷的候選途徑。然而，仍需對(duì)豬PA囊胚基因組甲基化-轉(zhuǎn)錄-翻譯水平的進(jìn)一步綜合探究。

4 結(jié) 論

本研究基于單細(xì)胞全基因組甲基化測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，玻璃化冷凍改變了豬PA囊胚基因組的甲基化水平，其可能通過擾亂胚胎發(fā)育、ATP代謝、MAPK信號(hào)通路等相關(guān)基因的甲基化水平損害胚胎凍后發(fā)育能力。此外，Hippo信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路和mTOR信號(hào)通路可作為緩解玻璃化冷凍損傷的候選途徑，本研究為促進(jìn)豬胚胎玻璃化冷凍技術(shù)的發(fā)展提供一定理論依據(jù)。

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