摘 要： 旨在探討miR-137在黑山羊被毛顏色形成中的調(diào)控作用，為研究黑色素生成的分子機制提供新的視角。本研究選取4日齡黑山羊肩后約5 cm處皮膚組織分離黑色素細胞，通過免疫組化和免疫熒光試驗對黑色素細胞定位，采用多巴染色和免疫熒光的方法鑒定山羊黑色素細胞，裂解黑色素細胞測定黑色素的含量，通過細胞轉(zhuǎn)染、實時熒光定量PCR、Western blot等方法探究miR-137通過靶向黑素細胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子（melanocyte inducing transcription factor，MITF）對黑色素細胞生成黑色素的調(diào)控機制。結(jié)果顯示，在毛乳頭上方及外毛根鞘處有黑色素細胞的存在，黑色素細胞呈兩極或三極狀，多巴染色鑒定黑色素細胞呈棕黑色陽性，免疫熒光鑒定毛色生成有關(guān)的標記基因表達陽性。轉(zhuǎn)染過表達載體后的山羊黑色素細胞與NC組相比，黑色素含量降低（Plt;0.05），同時，inhibitor組趨勢相反（Plt;0.05）。通過RT-qPCR與Western blot對黑色素細胞生成相關(guān)基因的表達水平進行分析，結(jié)果顯示，過表達或抑制miR-137對靶基因MITF的mRNA表達水平影響并不顯著（P＞0.05）。而過表達miR-137對黑色素細胞生成的標志基因TYR、TYRP-1、TYRP-2的mRNA表達起抑制作用（P＜0.05），同時，inhibitor組趨勢相反（Plt;0.05）。MITF的蛋白質(zhì)表達水平mimic組顯著低于mimic NC組（P＜0.05），inhibitor組的蛋白質(zhì)表達水平顯著高于inhibitor NC組（P＜0.05），mimic組黑色素細胞生成的標志基因TYR、TYRP-1、TYRP-2的蛋白質(zhì)表達水平顯著低于mimic NC組（P＜0.05），inhibitor組高于inhibitor NC組（P＜0.05）。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-137不影響MITF的mRNA表達量，而是通過靶向MITF間接抑制山羊黑色素細胞黑色素的生成，這為研究miR-137在山羊膚色和毛色形成中的作用提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞： miR-137；MITF；黑色素細胞；黑色素生成；山羊

中圖分類號：S827.2"""" 文獻標志碼：A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）01-0189-12

收稿日期：2024-07-11

基金項目：青島市科技惠民示范專項（24-1-8-xdny-2-nsh；23-2-8-xdny-13-nsh）；畜禽生物育種全國重點實驗室開放課題（2024SKLAB6-110）；山東省農(nóng)業(yè)良種工程（2021LZGC010）

作者簡介：于鳳姣（2000-），女，山東威海人，碩士生，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：13173319898@163.com

*通信作者：賀建寧，主要從事羊遺傳改良與開發(fā)利用，E-mail：hexingxing104@163.com；高霄霄，主要從事羊遺傳改良與開發(fā)利用，E-mail：gaoxiaoxiao2021@qau.edu.cn

Mechanism of miR-137 Targeting MITF Regulating Melanogenesis in Goat Melanocytes

YU" Fengjiao， LIU" Kaidong， SONG" Weijie， LIU" Nan， LI" Hegang， ZHAO" Jinshan， GAO" Xiaoxiao*， HE" Jianning*

（College of Animal Science and Technology， Qingdao Agricultural University， Qingdao 266109， China）

Abstract： The aim of this study was to investigate the regulation role of miR-137 in coat color formation in black goats， in order to provide a new perspective in investigating the molecular mechanism of melanogenesis. Melanocytes were isolated from skin tissues of 4-day-old black goats at about 5 cm behind the shoulder， the melanocytes were localized by immunohistochemistry and immunofluorescence assays， the goat melanocytes were identified by Dopa staining and immunofluorescence， the content of melanin were determined after melanocytes lysed， and miR-137 regulation mechanism of melanogenesis by targeting melanocyte inducing transcription factor （MITF） was explored by cell transfection， real-time fluorescence quantitative PCR， and Western blot. The results demonstrated the presence of melanocytes above the dermal papilla and at the outer hair root sheath， melanocytes were bipolar or tripolar， Dopa staining identified the melanocytes as brownish-black positive， and immunofluorescence identified the expression of marker genes related to hair color generation as positive. The melanin content of transfected goat melanocytes was reduced compared with that of the NC group （Plt;0.05）， meanwhile the trend of the inhibitor group was opposite （Plt;0.05）. The expression levels of melanocyte generation-related genes were analysed by RT-qPCR and Western blot， and it was found that overexpression or inhibition of miR-137 did not have a significant effect on the mRNA expression levels of the target gene MITF （Pgt;0.05）. While overexpression of miR-137 inhibited the expression of mRNA of TYR， TYRP-1 and TYRP-2， which are marker genes for melanogenesis （Plt;0.05）， meanwhile， the trend was opposite in the inhibitor group （Plt;0.05）. Regarding the protein expression level， the protein expression level of MITF in the mimic group was significantly lower than that in the mimic NC group （Plt;0.05），the protein expression level of MITF in the inhibitor group was significantly higher than that in the inhibitor NC group （Plt;0.05）.The protein expression levels of TYR， TYRP-1 and TYRP-2 were significantly lower in the mimic group than that in the mimic NC group （Plt;0.05）， and their expression in the inhibitor group was higher than that in the inhibitor NC group （Plt;0.05）. In this study， we found that miR-137 did not affect the mRNA expression of MITF， but indirectly inhibited melanin production in goat melanocytes by targeting MITF， which provides a theoretical basis for studying the role of miR-137 in the formation of skin and coat colour in goats.

Key words： miR-137; MITF; melanocytes; melanogenesis; goat

*Corresponding authors：HE Jianning， E-mail：hexingxing104@163.com; GAO Xiaoxiao， E-mail：gaoxiaoxiao2021@qau.edu.cn

我國綿、山羊種質(zhì)資源豐富，其中絨、毛、羔皮是山羊重要的經(jīng)濟產(chǎn)品之一，不同山羊品種的毛皮顏色也各具特點。例如全身白絨的內(nèi)蒙古絨山羊、黑白兩種被毛顏色的濟寧青山羊、被毛白色皮膚黑色的烏羊、棕黃而帶黑的成都麻羊、全身黑色被毛的大足黑山羊等^［1］。其不同的毛色類型是由皮膚中黑色素種類數(shù)量和比例決定的^［2］，山羊從白色到黑色跨度的毛色特征，反映了其皮膚中黑色素的變化^［3］。研究山羊黑色素生成調(diào)控有利于獲得山羊的毛色經(jīng)濟性狀，為我國地方山羊品種改良及遺傳分化提供理論依據(jù)。

黑色素細胞的生成過程涉及到多個階段，從神經(jīng)棘的細胞分裂開始，增殖分化過程受多種因素的影響^［4］。黑色素的合成有多種基因參與調(diào)控，這些基因主要通過各種信號通路傳導(dǎo)對其產(chǎn)生影響^［5］?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)TYR、TYRP1和TYRP2是黑色素生成相關(guān)的3種限速酶，同時其功能又受到MITF的調(diào)控^［6］。

微小RNA為microRNA，簡稱miRNA。長度通常約為21～25個核苷酸^［7］。動物皮膚中miRNAs的表達為研究動物毛色提供了基礎(chǔ)思路^［8］。在動物皮膚中表達多種miRNAs，它們與皮膚的形態(tài)和毛囊的發(fā)育密切相關(guān)^［9-13］。近年來，人們發(fā)現(xiàn)越來越多的miRNAs影響動物毛色的形成過程，如miRNA-25通過MITF對毛色產(chǎn)生影響^［14］，miRNA-193b影響綿羊黑色素細胞的功能^［15］，miRNA-146對綿羊黑色素細胞功能也有影響^［16］，這為科研工作者對動物毛色的產(chǎn)生和調(diào)控提供了新思路。

MITF是一種堿性螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子，主要在黑色素細胞、視網(wǎng)膜和大腦松果體中表達^［17］。MITF是多個miRNA的靶基因，這些miRNA包括miR-137、miR-182等^［18］。MITF在黑色素細胞分化和功能中起著關(guān)鍵作用，影響黑色素細胞的增殖分化^［19］。TYR是一種含銅的氧化還原酶，廣泛存在于微生物、動植物和人體中^［20］。在山羊上，TYR基因位于29號染色體上，負責編碼酪氨酸酶，是黑色素合成途徑中的關(guān)鍵基因^［21］。酪氨酸酶在黑色素合成過程中調(diào)控黑色素的生成，對黑色素形成起著重要作用^［22］。其中，MITF對TYR活性的調(diào)控有重要作用，MITF通過與酪氨酸酶啟動子區(qū)域的結(jié)合調(diào)控TYR及其相關(guān)蛋白的表達^［23］。TYR基因在其他物種中的位置和功能也具有相似性，并且同樣負責編碼酪氨酸酶^［24］。TYR與TYRP1、TYRP2高度同源，調(diào)控黑色素的生成^［25］。研究發(fā)現(xiàn)，TYRP1與黑色素的生成有關(guān)，TYRP2與黑色素細胞的活性密切相關(guān)^［26］。目前，在山羊中缺乏關(guān)于MITF、TYR與TYRP1、TYRP2的研究。已有研究表明，在小鼠的黑色素細胞中miRNA-137與黑色素合成的重要調(diào)控基因MITF的3′UTR結(jié)合，并下調(diào)MITF^［27］。在人黑色素細胞系中的研究表明，miR-137的表達下調(diào)MITF表達^［28］。這些研究表明，miR-137與MITF基因存在靶向關(guān)系，故本研究選擇分離山羊黑色素細胞，探究miR-137靶向MITF調(diào)控山羊黑色素細胞生成黑色素的機制，有助于深入了解山羊毛色的遺傳規(guī)律和多樣性，為保護和培育黑山羊品種提供理論依據(jù)，對羊毛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

CO 2恒溫培養(yǎng)箱（ESCO）、倒置顯微鏡（Zen）、低速離心機（TDL5M，湖南湘立科學(xué)儀器有限公司）、冰箱（美的）、移液器（艾本德）、顯微剪（康華醫(yī)美器械，14 cm直頭）、6孔細胞板（思科捷）、無水乙醇（國藥）、二甲苯（國藥）、多聚甲醛（索萊寶）、胎牛血清（Gibco）、0.25%胰蛋白酶（Hyclone）、雙抗（青-鏈霉素）（Hyclone）、胰酶（Hyclone）、M-254培養(yǎng)基（Thermo）、DMEM/F12培養(yǎng)基（Hyclone）、TESCA緩沖液（索萊寶）、膠原酶Ⅰ（索萊寶）、0.25% Ⅱ型中性蛋白酶（Hyclone）、40 μm細胞篩（索萊寶）、70 μm細胞篩（索萊寶）、磷酸鹽緩沖液（Hyclone）、TYR抗體（ABconal）、TYRP-1抗體（Sigma）、TYRP-2抗體（Sigma）、MITF抗體（HUABIO）、HRP標記的二抗（抗兔/小鼠）（碧云天）、GP-transfect-Mate轉(zhuǎn)染試劑（吉瑪基因）、山羊抗兔IgG （H+L）二抗（賽默飛世爾科技）、Invitrogen TRIzol試劑（賽默飛世爾科技）、Trizol 試劑（思科捷）、RNA 提取試劑盒（思科捷）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（genstar）、qPCR試劑盒（艾科瑞生物）。

1.2 樣品的采集

本試驗選用出生后4天的健康膠東黑山羊，首先，采集黑山羊的背部、腹部以及頸部皮膚組織，分別放置于-80℃的冰箱凍存和4%多聚甲醛溶液中固定，用于后續(xù)試驗檢測。選取肩后約5 cm處的背部皮膚組織，用刀片將被毛刮凈，消毒后采集皮膚組織（2.0 cm×2.0 cm），用止血鉗夾住皮膚，剪刀剪下背部皮膚組織（1.0 cm×1.0 cm），然后立即浸泡于黑色素細胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（含有100 μg·mL^-1雙抗的DMEM-F12培養(yǎng)基），4℃保存，然后1 h內(nèi)帶到細胞間用于黑色素細胞的分離培養(yǎng)試驗。

1.3 免疫組化和免疫熒光試驗對黑色素細胞進行組織定位

免疫組化試驗操作步驟如下：將山羊皮膚組織從4%多聚甲醛固定液中取出，用紗布包好，在流水中沖洗1 h，經(jīng)過梯度乙醇脫水（50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、無水乙醇），使用二甲苯透明15 min，浸蠟后進行石蠟包埋。用石蠟切片機將組織切成10 μm厚度的石蠟切片，分別用二甲苯、無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇進行脫蠟水化。復(fù)性劑煮沸法進行切片抗原修復(fù)，滴加滅活酶試劑室溫避光處理，滴加3%BSA-PBS進行濕盒封閉1 h。每張切片滴加50 μL MITF抗體（1∶100），4℃孵育過夜。切片經(jīng)PBS洗滌后，滴加HRP標記的二抗孵育。每張切片滴加50 μL蘇木素體細胞快速染色，1%鹽酸-乙醇迅速脫色后終止。然后，經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯浸泡后加中性樹膠后加蓋玻片，在顯微鏡下觀察拍照。

免疫熒光試驗操作步驟如下：皮膚切片在3% BSA-PBS中封閉后。滴加50 μL TYR抗體，4℃孵育過夜。滴加按照1∶500比例稀釋的山羊抗兔IgG （H+L）二抗25 μL，室溫孵育2 h，DAPI室溫放置，用PBS浸泡清洗。取蓋玻片加封片劑，在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.4 山羊黑色素細胞的分離與培養(yǎng)

將新鮮的皮膚組織從培養(yǎng)基中取出沖洗，用眼科剪將皮膚剪成條狀（1 cm×0.2 cm），經(jīng)1 mL 0.25%中性蛋白酶于37℃ CO 2培養(yǎng)箱消化1.5 h。體視鏡下分離表皮和皮下組織，去除皮下脂肪，獲得毛囊，加0.25% Ⅰ型膠原酶進行消化，用70 μm的細胞篩過濾。經(jīng)0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）孵育，再用40 μm篩網(wǎng)過濾，分離得到黑色素細胞。將接種培養(yǎng)瓶的細胞置于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。當細胞密度達到約80%時，使用M-254培養(yǎng)基、10%胎牛血清、100 μg·mL^-1青-鏈霉素的完全培養(yǎng)基以1∶2的比例接種繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5 多巴染色鑒定黑色素細胞

細胞爬片融合度達90%左右，4%多聚甲醛固定細胞，加0.3%tritonx-100通透，PBS清洗；加0.1% L-Dopa染色液，放入培養(yǎng)箱孵育；使用顯微鏡觀察。

1.6 免疫熒光鑒定黑色素細胞

接種細胞至6孔板，待細胞爬片融合度達80%左右，每孔加適量4%的多聚甲醛細胞組織固定液，37℃固定10 min，PBS清洗。每孔加適量0.25%的Triton-x100固定，5%BSA室溫封閉1 h。每孔滴加MITF（1∶100）和TYR（1∶500）一抗各800 μL，4℃孵育過夜。每孔滴加800 μL二抗山羊抗兔IgG （H+L）（1∶500）于細胞中，37℃孵育1 h。在載玻片上滴加抗熒光猝滅劑后進行激光聚焦觀察。

1.7 轉(zhuǎn)染

將鑒定合格的細胞懸液加到6孔板中，每孔含細胞懸液約300～400 μL，待細胞培養(yǎng)融合度達70%時，將試驗分為4組：miR-137 mimic、miR-137 mimic NC、miR-137 inhibitor、miR-137 inhibitor NC（每組3個重復(fù)），使用GP-transfect-Mate轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)48 h后收集細胞，以檢測miR-137和靶基因的表達。

1.8 黑色素含量的測定

山羊黑色素細胞轉(zhuǎn)染48 h后，加入0.25%胰蛋白酶37℃消化3 min，用完全培養(yǎng)基終止消化，加0.2 mol·L^-1的NaOH溶液裂解黑色素細胞；放置在80℃的金屬浴中15 min，使黑色素細胞裂解充分；將裂解后的黑色素細胞懸液轉(zhuǎn)移至96孔板中，每組5個重復(fù)；使用酶標儀測490 nm波長時的吸光光度值，計算各組細胞的黑色素含量。

1.9 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

從-80℃的超低溫冰箱中取出試驗所需的膠東黑山羊背部、頸部以及腹部皮膚組織，小心將組織表面羊毛除去，僅保留毛皮下面的皮膚組織，然后將取下的皮膚組織用剪刀剪成黃豆粒大小，分別放入不同的離心管中，做好標記。按照RNA提取說明書的操作步驟，使用TRIzol試劑提取山羊背部、頸部、腹部皮膚組織以及黑色素細胞的總RNA，使用紫外分光光度計檢測總RNA濃度及OD 260 nm/OD 280 nm的比值。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書，獲得后續(xù)試驗需要的cDNA。

1.10 熒光定量PCR鑒定基因表達水平

使用NCBI網(wǎng)站設(shè)計引物，并由擎科生物科技股份有限公司合成山羊MITF、TYR、TYRP1以及TYRP2基因引物的序列，如表1所示。分別對山羊的背部、腹部、頸部這3個不同的皮膚組織中MITF、TYR、TYRP-1以及TYRP-2基因的表達量進行檢測，使用SYBR Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒對目的基因以及轉(zhuǎn)染后的目的基因進行實時熒光定量PCR試驗（RT-qPCR），在96孔板中加樣品，每個樣品3個重復(fù)。將每個基因的mRNA表達水平標準化為GAPDH水平，并通過2^-ΔΔCT方法計算相對基因表達量。

1.11 蛋白質(zhì)免疫印跡試驗

轉(zhuǎn)染48 h后，使用RIPA裂解液提取總蛋白，并使用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測濃度。將總蛋白質(zhì)與5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液混合后在沸水中加熱5 min，每孔上樣量6 μL。保證每孔總蛋白量20 ng。經(jīng)過電泳轉(zhuǎn)膜后，加5%的BSA封閉，加入TYR（1∶500）、TYRP-1（1∶500）、TYRP-2（1∶500）、MITF（1∶500）一抗4℃孵育過夜。使用TBST緩沖液洗膜后加入HRP標記的二抗（1∶2 000）避光搖晃孵育1 h。在避光條件下使用Pierce^TM ECL Western 印跡底物檢測蛋白質(zhì)信號。

1.12 數(shù)據(jù)分析

通過IBM SPSS軟件使用獨立樣本t檢驗和單因素方差分析。結(jié)果表示為“平均值±標準偏差”。Plt;0.05的數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MITF、TYR、TYRP-1和TYRP-2在山羊不同組織中的表達

檢測MITF、TYR、TYRP-1和TYRP-2黑色素生成標志基因在山羊不同皮膚組織中的表達量。如圖1所示，RT-qPCR結(jié)果顯示，MITF、TYR、TYRP1和TYRP2在各皮膚組織中廣泛表達，MITF在背部皮膚中的表達量極顯著高于頸部皮膚（Plt;0.01），顯著高于腹部皮膚（Plt;0.05）；TYR、TYRP-1和TYRP-2基因在背部皮膚中的表達量極顯著高于腹部皮膚（Plt;0.01），顯著高于頸部皮膚（Plt;0.05）；所有基因在頸部皮膚與腹部皮膚中的表達量差異顯著（Plt;0.05）；在背部皮膚組織中表達量最高，與其他皮膚組織表達量差異顯著（Plt;0.05），故本研究選擇使用山羊背部皮膚分離黑色素細胞，以供后續(xù)研究。

2.2 黑色素細胞在山羊背部皮膚組織中的分布

采集山羊背部皮膚組織，進行組織形態(tài)學(xué)分析，在表型上確定黑色素細胞在皮膚毛囊中的表達定位，如圖2所示，通過石蠟切片免疫組化的方法初步鑒定在毛囊中有黑色素細胞。為進一步確定黑色素細胞在皮膚毛囊中的位置，選擇組織免疫熒光的方法，如圖3結(jié)果顯示，從200倍和400倍的橫切與縱切切片上，可以看出在毛囊的毛乳頭上方以及外根鞘處均有黑色素細胞的存在。

2.3 黑色素細胞的分離培養(yǎng)與鑒定

通過熒光顯微鏡觀察黑色素細胞形態(tài)，細胞接種第5天細胞貼壁生長，形態(tài)一致，傳代培養(yǎng)后依然生長狀況良好。如圖4A所示，細胞培養(yǎng)第10天后，細胞密度可達80%左右，即可傳代培養(yǎng)。由于黑色素細胞有酪氨酸酶，具有氧化多巴生成黑色物質(zhì)的特性，如圖4B和4C所示，多巴染色結(jié)果表明，酶消化分離的山羊黑色素細胞呈兩極或三極狀，通過多巴染色黑色素細胞為棕黑色陽性，初步鑒定為山羊黑色素細胞。選擇毛色形成有關(guān)的標記基因MITF和TYR，結(jié)果顯示MITF（圖4D、E、F）與TYR（圖4G、H、I）表達陽性，因此通過鑒定，確定分離培養(yǎng)出的細胞為山羊黑色素細胞。為進一步研究miR-137對山羊被毛顏色的形成機制提供了基礎(chǔ)。

2.4 miR-137抑制山羊黑色素細胞生成黑色素

為了研究miR-137的表達水平，用mimics、inhibitors和NCs分別轉(zhuǎn)染山羊黑色素細胞。如圖5所示，轉(zhuǎn)染24 h后，經(jīng)轉(zhuǎn)染效率檢測顯示，micmic組miR-137的表達極顯著高于NC組（Plt;0.05），同時，inhibitor組趨勢相反（Plt;0.05），證明成功轉(zhuǎn)染miR-137。通過測定黑色素在特定波長下的吸光度來間接確定黑色素含量，miR-137轉(zhuǎn)染后的山羊黑色素細胞的黑色素含量顯著低于NC組（Plt;0.05），同時，inhibitor組山羊黑色素細胞的黑色素含量極顯著高于NC組（Plt;0.05）。試驗結(jié)果證實了過表達miR-137對山羊黑色素細胞生成黑色素有抑制作用。

2.5 轉(zhuǎn)染miR-137后黑色素細胞MITF、TYR、TYRP-1和TYRP-2的mRNA表達水平

通過RT-qPCR檢測了miR-137對MITF及其下游基因TYR、TYRP-1、TYRP-2表達的影響。結(jié)果顯示（圖6），試驗組與對照組相比，miR-137組MITF的差異不顯著，TYR、TYRP-1的mRNA顯著降低（P＜0.05），TYRP-2的mRNA顯著降低（P＜0.05）。由此可以得出，miR-137不影響MITF基因的mRNA表達量，可能通過MITF來調(diào)控TYR、TYRP-1和TYRP-2的mRNA表達。

2.6 蛋白質(zhì)免疫印記試驗檢測MITF、TYR、TYRP-1、TYRP-2的蛋白質(zhì)表達水平

如圖7所示，mimic組MITF、TYR、TYRP-1、TYRP-2表達量的變化的蛋白質(zhì)表達水平顯著低于mimic NC組；inihibitor組蛋白質(zhì)表達水平顯著高于NC組（Plt;0.05）。

3 討 論

我國地方山羊品種眾多，并且不同山羊品種的毛皮顏色也各具特點，其中白色羊絨具有可染性，因此在工業(yè)生產(chǎn)中具有更強的商業(yè)價值^［29］。然而為了避免化學(xué)染料的使用損害人類健康和自然環(huán)境，對自然毛色羊毛的研究具有重要的應(yīng)用價值，并且被毛顏色與機體生長發(fā)育的調(diào)控，瘦肉率的控制以及疾病的預(yù)防等生產(chǎn)性能的調(diào)節(jié)有著密切聯(lián)系^［30］。

毛色的形成是一個復(fù)雜的過程，涉及到黑色素細胞的產(chǎn)生、黑色素的合成與分布以及毛干中黑色素的沉積等3個重要過程^［31-34］。在小鼠的黑色素細胞中，miRNA-137可以通過兩條信號通路對黑色素的生成產(chǎn)生影響，一條是通過抑制c-kit/SCF信號通路中c-kit的表達來抑制黑色素的生成，另外一條是通過a-MSH/MC1R信號通路抑制MITF的生成，從而抑制TYR、TYRP1、TYRP2的轉(zhuǎn)錄，減少黑色素的合成^［35］。已有研究表明，miR-137在小鼠黑色素瘤細胞中可靶向調(diào)節(jié)MITF，并下調(diào)其表達^［36］。MITF是黑色素細胞發(fā)育成熟、細胞凋亡和黑素沉著的主要調(diào)節(jié)因子，而MITF可以通過與黑色素生成的標記基因TYR及其TYRP1、TYRP2的啟動子區(qū)域結(jié)合來控制MITF的轉(zhuǎn)錄^［37］，暗示了miR-137的過量表達通過調(diào)控MITF間接調(diào)控了TYR及其TYRP1、TYRP2的表達，因此miR-137可能通過調(diào)控MITF的表達來影響黑色素瘤的生物學(xué)行為。黃晶^［38］研究發(fā)現(xiàn)，浙東白鵝的TYR和MITF基因突變可能與其白羽的毛色形成有密切聯(lián)系。隨后，馬淑慧等^［39］研究發(fā)現(xiàn)，miR-137與小鼠的毛色形成有關(guān)，驗證了miR-137通過靶向MITF間接對TYR及其下游基因TYRP1、TYRP2產(chǎn)生影響，影響小鼠中黑色素細胞內(nèi)黑色素的生成，使小鼠毛色變淺。

為了研究miR-137靶向MITF對山羊黑色素細胞生成黑色素調(diào)控的影響，本研究分離培養(yǎng)出生長狀態(tài)良好的山羊黑色素細胞，通過多巴染色和免疫熒光分別在細胞形態(tài)和蛋白水平上鑒定了黑色素細胞，本研究得到黑色素細胞的分離培養(yǎng)方法簡單，且培養(yǎng)基成品少，鑒定方法全面可靠，并可直觀顯示山羊黑色素細胞的表達定位。有研究表明，在綿羊黑色素細胞中通過對黑色素細胞進行轉(zhuǎn)染后測定黑色素的含量，與NC組相比，miR-137試驗組的黑色素含量降低（Plt;0.05），inhibitor組顯著提高（Plt;0.05）^［40］，與本試驗的測定結(jié)果一致。有研究表明，在人黑色素細胞中過表達miR-101會降低MITF和EZH2的蛋白水平^［41］，在本研究發(fā)現(xiàn)，在山羊黑色素細胞中過表達或抑制miR-137對MITF的mRNA表達量沒有顯著影響（Pgt;0.05），而過表達miR-137會顯著降低MITF的蛋白水平（Plt;0.05），抑制則會顯著提高其蛋白水平（Plt;0.05）。試驗表明，miR-137通過靶向MITF調(diào)控了黑色素生成的標志基因TYR、TYRP1、TYRP 對黑色素細胞的黑色素生成具有抑制作用。

關(guān)于MITF、TYR、TYRP1、和TYRP2在不同物種上對黑色素細胞的研究與本試驗結(jié)果基本一致，這為山羊毛色的遺傳機制提供了理論依據(jù)。已有研究表明，TYR的表達活性會隨著山羊年齡的增長而變化^［42-43］。造成這樣的原因可能是山羊的毛色隨著年齡增長發(fā)生變化，其毛發(fā)和皮膚中黑色素細胞的黑色素含量也會發(fā)生變化^［44］。山羊毛色形成機制的研究為培育天然彩色山羊提供理論基礎(chǔ)，同時有利于得到育種目標或市場所需的毛色類型。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，miR-137通過靶向MITF間接抑制黑色素細胞生成標志基因TYR、TYRP-1、TYRP-2的表達，從而調(diào)控山羊黑色素細胞黑色素的生成，這可能會對山羊品種改良和遺傳分化產(chǎn)生一定的影響。

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