摘 要： 旨在探究雞主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）定位的TRIM39.2過表達對雞巨噬細胞轉(zhuǎn)錄表達譜的影響。本研究通過RT-qPCR構(gòu)建雞TRIM39.2基因組織表達譜，克隆雞TRIM39.2基因并構(gòu)建攜帶標(biāo)簽的重組表達載體。分別轉(zhuǎn)染空載體和TRIM39.2真核表達載體至HD11細胞內(nèi)，收獲RNA制備文庫并進行轉(zhuǎn)錄組測序及生物信息學(xué)分析。篩選差異表達基因，隨后進行GO和KEGG富集分析，并用RT-qPCR方法進一步驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果。結(jié)果表明，與其他組織相比，脾臟中TRIM39.2的表達最高。成功克隆了雞TRIM39.2基因，并構(gòu)建了攜帶Myc標(biāo)簽的重組表達載體pCAGGS-Myc-TRIM39. 并驗證了重組載體成功在雞HD11細胞中表達TRIM39.2重組蛋白。轉(zhuǎn)錄組測序分析獲得了33個顯著差異表達基因。GO分析主要富集于細胞因子的活性特性及其參與介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑。KEGG分析則主要富集于細胞因子與受體間的相互作用及RIG-I樣受體信號等通路。雞TRIM39.2基因在巨噬細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答和信號傳導(dǎo)中具有重要的調(diào)控作用，尤其對RIG-I樣受體介導(dǎo)的I型干擾素信號通路具有正調(diào)控作用，本研究為進一步豐富雞RIG-I樣受體信號通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： TRIM39.2；雞巨噬細胞；轉(zhuǎn)錄組；GO；KEGG

中圖分類號：S831.2"""" 文獻標(biāo)志碼：A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）01-0178-11

收稿日期：2024-07-23

基金項目：國家自然科學(xué)基金（32002271）；國家肉雞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-41）

作者簡介：吳 雙（1999-），女，江蘇東海人，碩士，主要從事家禽免疫學(xué)研究，E-mail：775216658@qq.com

*通信作者：陳世豪，主要從事家禽免疫與分子抗病育種研究，E-mail： mrrchen@yzu.edu.cn

The Effect of TRIM39.2 Overexpression on the Transcriptional Expression of Chicken

Macrophages

WU" Shuang YIN" Na YU" Mohan PING Yuyu2， BAI" Hao CHEN" Shihao "CHANG" Guobin¹

（1.College of Animal Science and Technology， Yangzhou University， Yangzhou 225009， China;

2.College of Veterinary Medicine，Yangzhou University， Yangzhou 225009， China）

Abstract： "The study aimed to explore the effect of overexpression of TRIM39.2， localized in the chicken major histocompatibility complex （MHC）， on the transcription expression of chicken macrophages. The tissue expression profile of chicken TRIM39.2 gene was constructed using RT-qPCR.The chicken TRIM39.2 gene was cloned and a recombinant expression vector carrying the tag was constructed. HD11 cells were transfected with either an empty vector or a TRIM39.2 eukaryotic expression vector.RNA was harvested to prepare a library， and transcriptome sequencing and bioinformatics analysis were performed. Differentially expressed genes were screened， followed by GO and KEGG enrichment analysis， and RT-qPCR method was used to further verify the transcriptome sequencing results. The results showed that the expression of TRIM39.2 was the highest in the spleen compared to other tissues. The chicken TRIM39.2 gene was successfully cloned， and a recombinant expression vector carrying a Myc tag， pCAGGS-Myc-TRIM39.2，was constructed， and confirmed to express TRIM39.2 recombinant protein in chicken HD11 cells.Transcriptome sequencing analysis identified 33 significantly differentially expressed genes. GO analysis was primarily enriched in the active characteristics of cytokines and their involvement in signal transduction pathways.KEGG analysis mainly focused on the interactions between cytokines and receptors， as well as pathways such as RIG-I-like receptor signaling pathway. The chicken TRIM39.2 gene plays a significant regulatory role in macrophage-mediated immune responses and signal transduction， particularly in positively regulating the type I interferon signaling pathway mediated by RIG-I-like receptors. This study lays the foundation for further exploration of the regulatory mechanism of RIG-I-like receptor signaling pathway in chickens.

Key words： TRIM39.2; chicken macrophages; transcriptome; GO; KEGG

*Corresponding author： CHEN Shihao，E-mail：mrrchen@yzu.edu.cn

TRIM（tripartite motif）家族蛋白通常有RING、B-box和Coiled-Coil這3個自N端依次排列的結(jié)構(gòu)域^［1］。此外，其C端還連接著一至兩個極具多變性且決定其功能特異性的結(jié)構(gòu)域^［2］。不同的TRIM基因在組織中的表達存在差異^［3］。已有研究表明，TRIM家族蛋白參與細胞生長、分化和凋亡等生物過程，其中大都還與天然免疫調(diào)控和疾病的發(fā)生有關(guān)^［4-5］。

主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）廣泛指代一類編碼關(guān)鍵免疫識別分子的基因群，是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在抗原呈遞和免疫應(yīng)答方面起重要作用^［6］。研究報道，位于人MHC基因座上的TRIM10、TRIM15、TRIM26、TRIM27、TRIM31、TRIM38、TRIM39和TRIM40這8個TRIM基因均與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)^［7-10］。例如，人TRIM38是一個先天性免疫的負調(diào)控因子，通過催化底物蛋白（如TRAF6、TRIF和IKKα/IKKβ）發(fā)生K48連接的多泛素化修飾，促進其被蛋白酶體識別并降解的過程，能夠有效抑制TLR（Toll樣受體）及RLR（視黃酸誘導(dǎo)基因I樣受體）信號通路的活化^［11-13］。人TRIM39具有炎性調(diào)控作用，它通過依賴E3泛素酶活性穩(wěn)定鈣調(diào)蛋白以減弱TLR和TNF-α介導(dǎo)的RelA/p65易位，抑制IL-6和IL-8的表達^［14］。在哺乳動物中，TRIM39還具有通過調(diào)節(jié)I型干擾素（IFN）反應(yīng)和宿主免疫防御來預(yù)防病毒感染的功能^［15］。

雞TRIM39.2屬于TRIM蛋白家族的一員，并且定位在16號染色體雞主要組織相容性復(fù)合體。雖有研究表明，雞TRIM39.2具有抑制J亞型禽白血病病毒復(fù)制的作用^［16］，但它在免疫調(diào)控方面的功能仍需進一步明確。本研究旨在通過轉(zhuǎn)錄組測序探究過表達雞TRIM39.2對雞巨噬細胞HD11表達譜的影響，深入分析TRIM39.2基因表達所涉及的信號通路，為認(rèn)識TRIM39.2基因及其雞MHC基因組功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

雞HD11巨噬細胞系由本實驗室傳代保存；真核表達載體pCAGGS-Myc由本實驗室保存。采集5只21日齡SPF級白色來航雞（來自浙江立華農(nóng)業(yè)科技有限公司）的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、法氏囊、十二指腸、空腸等組織放入液氮速凍后，轉(zhuǎn)移保存在-80℃冰箱中。

2×Phanta Max Master Mix、DL2000 DNA Marker、DNA純化試劑盒、DH5α感受態(tài)細胞均購自諾唯贊生物科技公司；質(zhì)粒小提試劑盒購自江蘇康為世紀(jì)生物科技公司；鼠源Myc標(biāo)簽抗體（1∶1 000）購自日本MBL生物公司；PBS和DMEM購自Hyclone公司；胎牛血清購自Gibco公司。

1.2 引物設(shè)計與合成

通過NCBI在線數(shù)據(jù)庫查詢到序列信息設(shè)計載體構(gòu)建引物及熒光定量引物，合成的引物序列信息見表1。

1.3 真核表達載體pCAGGS-Myc-TRIM39.2的構(gòu)建及鑒定

以HD11細胞cDNA為模板，PCR擴增TRIM39.2基因。對符合預(yù)期特征的電泳條帶進行回收，同時對pCAGGS-Myc載體進行雙酶切。將切膠回收得到的片段與雙酶切載體和PCR產(chǎn)物真核表達載體進行重組連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，再經(jīng)涂板、挑菌、搖菌等一系列流程，選取陽性克隆菌送往金唯智生物公司進行測序，測序結(jié)果正確的菌繼續(xù)擴大培養(yǎng)，最終進行質(zhì)粒小提并保存于-20 ℃。

1.4 蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測重組質(zhì)粒的表達

按照Highgene轉(zhuǎn)染試劑說明書，將制備的pCAGGS-Myc-TRIM39.2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至巨噬細胞，培養(yǎng)24 h后將細胞收集到1.5 mL無酶管中。使用1 mL預(yù)冷PBS溶液洗滌細胞后每管加入100 μL配制好的細胞裂解液及蛋白酶抑制劑于冰上裂解細胞，后續(xù)Western blot試驗操作參考文獻［17］。

1.5 轉(zhuǎn)錄組測序及分析

將1 μg pCAGGS-Myc-TRIM39.2和1 μg pCAGGS-Myc分別轉(zhuǎn)染至HD11細胞，每組設(shè)3個重復(fù)，培養(yǎng)24 h后用1 mL Trizol試劑收集細胞并將其轉(zhuǎn)入1.5 mL無酶管中，放入裝有冰袋的泡沫箱內(nèi)低溫運送至廣州基迪奧生物科技有限公司，進行RNA樣本制備、文庫制備及文庫質(zhì)檢。對測序所得的原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)控，得到有效數(shù)據(jù)進行后續(xù)的分析。

1.6 基因差異表達分析

使用DESeq2軟件進行基因差異表達分析，步驟分為以下三步：首先對基因表達水平分析中得到的reads count數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化；其次根據(jù)模型進行假設(shè)檢驗概率（P value）的計算；最后進行多重假設(shè)檢驗校正，得到FDR值（錯誤發(fā)現(xiàn)率）。

基于差異分析結(jié)果，設(shè)定閾值為log 2FCgt;1和FDRlt;0.05，篩選顯著差異表達基因。

基于GO數(shù)據(jù)庫和有關(guān)Pathway的主要公共數(shù)據(jù)庫進行GO和KEGG富集分析，取FDR值最小的前15項GO和KEGG富集結(jié)果進行作圖。

1.7 統(tǒng)計分析

RT-qPCR數(shù)據(jù)結(jié)果采用2^-△△Ct法處理。使用GraphPad Prism 8.0這一統(tǒng)計軟件工具進行統(tǒng)計分析，并以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）”的形式呈現(xiàn)結(jié)果，以確保數(shù)據(jù)的精確表達與解讀。

2 結(jié) 果

2.1 雞不同組織中TRIM39.2基因的表達分析

由圖1可知，TRIM39.2基因在21日齡的SPF級白色來航雞的各個組織中均有表達，其中在脾臟中的表達量最高，表明TRIM39.2可能參與脾臟中的免疫反應(yīng)；在腎臟和空腸中表達量次之；在肺臟中表達量最低。

2.2 真核表達載體的構(gòu)建與鑒定

PCR擴增TRIM39.2基因的電泳結(jié)果如圖2A所示，在靠近1 500 bp處有條帶，與目的條帶1 392 bp較為相符；對條帶進行切膠回收并與pCAGGS-Myc雙酶切載體進行重組連接。后續(xù)菌檢顯示，1號、3號、4號和5號在靠近1 500 bp處均有條帶（圖2B），選擇1號菌液送至金唯智生物科技公司進行測序；測序結(jié)果表明融合Myc標(biāo)簽的雞TRIM39.2重組載體構(gòu)建正確，命名為pCAGGS-Myc-TRIM39.2。

2.3 Western blot檢測雞TRIM39.2蛋白表達

為檢測TRIM39.2融合蛋白表達情況，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HD11細胞并進行了Western blot分析。試驗結(jié)果清晰地展示了Myc標(biāo)簽蛋白能夠有效識別目標(biāo)重組蛋白，且該蛋白的分子量約為55 ku，與預(yù)期一致（圖3）。進一步分析表明，所構(gòu)建的pCAGGS-Myc-TRIM39.2重組載體成功表達了帶有Myc標(biāo)簽的TRIM39.2重組蛋白，為后續(xù)的過表達試驗奠定了基礎(chǔ)。

2.4 轉(zhuǎn)錄組測序差異基因的篩選

通過應(yīng)用Fastp軟件對原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)控（表2），最終6個樣本獲得了37 817 626～46 438 132條高質(zhì)量的有效數(shù)據(jù)。其中Q20值和Q30值均大于99％，表明測序數(shù)據(jù)質(zhì)量的優(yōu)質(zhì)性，且符合后續(xù)試驗分析及研究需求的標(biāo)準(zhǔn)。

2.5 差異表達基因分析

對MOCK和TRIM39.2組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析發(fā)現(xiàn)，顯著差異表達基因共有33個，其中24個基" 因上調(diào)，9個基因下調(diào)（圖4）。

2.6 差異基因的GO生物學(xué)功能分析

經(jīng)過GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，差異表達基因顯著富集于多個關(guān)鍵生物學(xué)過程，包括細胞因子活性調(diào)控、細胞因子和趨化因子介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)路徑，以及中性粒細胞定向遷移能力等（圖5）。

2.7 差異基因的KEGG代謝與信號通路分析

KEGG富集分析顯示，這些通路主要聚焦于免疫與疾病相關(guān)的信號傳導(dǎo)上。其中，富集到的前5條通路分別為細胞因子-細胞因子受體相互作用通路、RIG-I樣受體信號通路、胞質(zhì)DNA識別與應(yīng)答途徑、甲型流感病毒以及I型單純皰疹病毒感染（圖6）。

2.8 實時熒光定量PCR驗證

為進一步確認(rèn)轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，隨機挑選5個顯著差異基因 （SAMD9L、IFNW1、IFIH1、CCL19和LYZ） 進行qPCR驗證。結(jié)果如圖7所示，過表達TRIM39.2導(dǎo)致SAMD9L、IFNW1、IFIH1及CCL19基因的表達量均顯著上調(diào)，而LYZ基因的表達量顯著下調(diào)。結(jié)果顯示這些基因表達趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致，表明轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)可信。

2.9 TRIM39.2對RIG-I樣受體信號通路相關(guān)免疫基因表達水平的影響

KEGG分析結(jié)果表明，RIG-I樣受體信號通路是第二富集的信號通路，推測TRIM39.2在RIG-I樣受體信號通路中具有重要的調(diào)控作用。因此，又進一步檢測了TRIM39.2過表達對RIG-I樣受體信號通路相關(guān)基因表達的影響。結(jié)果由圖8可知，與對照組相比，過表達雞TRIM39.2能顯著促進poly（I：C）誘導(dǎo)的MDA5、IFNβ、OASL和MX1的表達水平（Plt;0.05），而對TRIM25、TBK1、IRF7的表達無顯著影響（Pgt;0.05）。

3 討 論

主要組織相容性復(fù)合體（MHC）作為一類高度多態(tài)的基因家族，在抗原呈遞過程中發(fā)揮核心作用，同時還與宿主的免疫應(yīng)答能力和疾病易感性密切相關(guān)^［18］。雞TRIM39.2定位在雞MHC-B基因座^［19］，已有研究發(fā)現(xiàn)TRIM39.2的表達可以顯著抑制禽白血病病毒復(fù)制，且RING結(jié)構(gòu)域和B-box結(jié)構(gòu)域在抑制禽白血病病毒復(fù)制過程中起著重要的作用^［16］。而雞TRIM39.2是否具有免疫調(diào)控作用還未證實。本研究通過分析SPF雞不同組織中的TRIM39.2基因表達，結(jié)果表明TRIM39.2基因主要在免疫器官中表達。脾臟作為重要的免疫器官，TRIM39.2基因表達量最高，暗示其可能在免疫調(diào)節(jié)和抗病毒防御等方面起到重要作用。

通過轉(zhuǎn)錄組測序分析發(fā)現(xiàn)，雞巨噬細胞過表達TRIM39.2導(dǎo)致一些與免疫應(yīng)答和信號傳導(dǎo)相關(guān)的信號通路被富集。細胞因子與細胞因子受體相互作用通路是顯著富集的通路，它涉及免疫反應(yīng)和炎癥過程。例如，TRIM39.2過表達導(dǎo)致趨化因子CCL19和CCL20表達顯著改變，其中CCL19表達量上調(diào)，而CCL20表達量下調(diào)。這一發(fā)現(xiàn)揭示了TRIM39.2基因在調(diào)控細胞因子受體相互作用通路中的復(fù)雜性，不同趨化因子在特定生理或病理條件下可能扮演著截然不同的角色^［20］。IFNK和IFNW1都是I型干擾素家族的成員，在宿主防御病毒感染中發(fā)揮重要作用^［21］。這些結(jié)果表明，TRIM39.2過表達導(dǎo)致I型干擾素顯著激活，揭示了其在天然免疫調(diào)控中的重要作用。本課題組先前的研究表明，SAMD9L表達能顯著抑制ALV-J復(fù)制^［17］，同樣有研究表明TRIM39.2具有抗ALV-J的作用^［16］，其涉及的分子機制或與此密切相關(guān)。

RIG-I樣受體是一類模式識別受體（（pattern recognition receptor，PRR），它在抗RNA病毒先天性免疫中發(fā)揮重要作用^［22-23］。雞基因組天然缺乏RIG-I基因，因此目前普遍認(rèn)為另一個識別受體基因IFIH1（又名MDA5）在此通路中承擔(dān)更重要的生物學(xué)功能^［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，TRIM39.2過表達導(dǎo)致IFIH1基因顯著上調(diào)，同時RIG-I樣受體信號通路顯著被富集。隨后對此通路進行進一步qPCR分析結(jié)果表明，TRIM39.2過表達顯著促進MDA5介導(dǎo)的I型干擾素信號通路（胞內(nèi)poly（I：C）-HMW被MDA5特異性識別），并促進下游抗病毒基因如OASL和MX1的表達顯著升高，對信號傳導(dǎo)分子TRIM25、TBK1、IRF7表達無顯著影響，推測與TRIM25泛素化^［25］、TBK1^［26］和IRF7^［27］磷酸化等修飾有關(guān)，需要進一步用Western blot檢測相關(guān)表達。

總之，本研究通過解析TRIM39.2組織表達譜并利用過表達檢測其轉(zhuǎn)錄組表達譜，證明了雞TRIM39.2在天然免疫調(diào)控中具有重要作用。本研究結(jié)果表明，TRIM39.2過表達正調(diào)節(jié)RIG-I樣受體通路，暗示了其抗RNA病毒的潛力，同時表明了TRIM39.2抑制ALV-J復(fù)制的潛在分子機制，但它如何調(diào)控RIG-I樣受體通路仍需進一步明確。

4 結(jié) 論

雞TRIM39.2基因在脾臟中表達最高。TRIM39.2基因過表達可促進雞巨噬細胞的轉(zhuǎn)錄表達過程中細胞因子和信號傳導(dǎo)活性，影響諸多免疫相關(guān)基因的表達。尤其，TRIM39.2過表達顯著促進RIG-I樣受體信號激活，為雞TRIM39.2在抗RNA病毒中的應(yīng)用和天然免疫調(diào)節(jié)中的作用機制解析提供了科學(xué)基礎(chǔ)。

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