摘 要： 為探究沐川烏骨雞生長早期黑色素沉積的選育指標和分子標記，本研究選取35日齡54只沐川烏骨雞作為研究對象，測定胸肌黑色素含量和皮膚色差，利用實時熒光定量PCR檢測PMEL17基因在不同組織中的表達，利用Sanger測序挖掘PMEL17基因的SNPs位點，統(tǒng)計突變位點基因型頻率，與胸肌黑色素含量進行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明，胸肌黑色素含量與胸皮黃度b值存在極顯著正相關(guān)，與腿皮L值存在顯著正相關(guān)；PMEL17基因在皮膚組織中表達量最高；在PMEL17基因上共發(fā)現(xiàn)5處突變位點，其中SNP G-553A位點與沐川烏骨雞黑色素沉積相關(guān)，且該突變位點上AG基因型為優(yōu)勢基因型。綜上所述，35日齡時沐川烏骨雞胸皮黃度b值和腿皮亮度L值可作為胸肌黑色素含量初步估測的指標；PMEL17基因與沐川烏骨雞胸肌黑色素沉積有關(guān)聯(lián)，顯著相關(guān)的SNP G-553A位點可作為胸肌黑色素沉積的分子標記，本研究為沐川烏骨雞的選育提供了理論基礎，豐富了地方品種種質(zhì)資源特性。

關(guān)鍵詞： 沐川烏骨雞；黑色素沉積；PMEL17；SNPs

中圖分類號：S831.2"""" 文獻標志碼：A """"文章編號： 0366-6964（2025）01-0168-10

收稿日期：2024-06-19

基金項目：高層次人才、嶺南學者科研啟動費（CGZ07001）；廣東省基礎與應用基礎研究區(qū)域聯(lián)合基金-青年基金項目（2022A1515111078）

作者簡介：尹 瓊（1998-），女，四川洪雅人，碩士生，主要從事動物遺傳育種和繁殖研究，E-mail： 2200816811@qq.com

*通信作者：葉 菲，主要從事動物遺傳育種和繁殖研究，E-mail：yefei0831@fosu.edu.cn

YIN" Qiong GAO" Mingchao2， YAO" Xiumei LIU" Kunyu LIU" Wei JIE" Hongwei LI" Hua 黑色素小體的形成和成熟是黑色素沉積的前提條件。前黑素小體蛋白17（pre-melanosomal protein 17，PMEL17）是前黑素小體蛋白（pre-melanosome protein， PMEL）基因家族中重要成員，編碼黑色素細胞特異性跨膜糖蛋白，促進黑色素小體結(jié)構(gòu)的形成與成熟^［1］。酪氨酸酶（tyrosinase，TYR）有助于黑色素的生成，而PMEL17蛋白與TYR基因家族3個成員編碼的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)非常相似，因此PMEL17基因也被稱作為TYR基因家族的第4個成員，能促進黑色素的形成^［2］。黑色素體生物發(fā)生的核心作用也歸因于PMEL17^［3］。PMEL17的功能喪失導致皮膚、頭發(fā)和眼睛中黑色素的喪失^［4-5］。PMEL17基因的表達受小眼相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（melanocyte inducing transcription factor， MITF）、眼白化病Ⅰ型因子（ocular albinism type I， OAI）、α-黑色素細胞刺激素（α-melanocyte stimula-ting hormone， α-MSH）等因素的調(diào)節(jié)^［6-8］。PMEL17基因突變導致小鼠^［9］、鴨^［10］、雞^［11］等物種毛色、羽色發(fā)生改變。彭燦陽^［12］以雪峰烏骨雞為試驗材料發(fā)現(xiàn)，在PMEL17基因內(nèi)含子2上的一個位點以及外顯子6上的兩個位點都與胸肌黑色素含量相關(guān)。喻世剛等^［13］以52周齡沐川烏骨雞為試驗材料通過轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)篩選到PMEL基因與黑色素沉積相關(guān)。PMEL17作為黑色素沉積選育候選分子標記，是否可用于沐川烏骨雞需要進一步的探究。

烏骨雞是特色家禽品種，因富含黑色素而備受大眾喜愛，黑色素具有增強免疫的功能^［14］和治療各種疾病的藥用價值^［15-16］，一直被作為藥用家禽，“烏雞白鳳丸”即是以烏骨雞為主要原料制成^［17］。沐川烏骨雞是我國四川省優(yōu)良地方品種，屬藥肉兼用型雞種。烏色是沐川烏骨雞的重要性狀，而黑色素含量是烏色性狀的關(guān)鍵^［18］。目前，沐川烏骨雞群體存在黑膚不全不純現(xiàn)象，與直接測量或可觀察的特征相比，例如羽毛顏色、皮膚色素沉積、體型等^［19-21］，胸肌黑色素含量無法用肉眼辨別，也不能對活體直接檢測，且常規(guī)選育方法進程慢^［22］，給烏骨雞的選育及保種帶來困難，嚴重影響其經(jīng)濟價值。隨著分子標記輔助選擇的發(fā)展^［23-25］，利用分子標記在生產(chǎn)實踐中對烏骨雞的膚色進行早期選擇^［26］。該技術(shù)在烏骨雞選育的應用不僅節(jié)約了雞只飼養(yǎng)成本，還快速提高了烏骨雞的選育進展。結(jié)合已有烏骨雞分子標記研究，挖掘沐川烏骨雞胸肌黑色素含量選育遺傳標記，對沐川烏骨雞的遺傳選育具有重要的指導意義和應用價值。

1 材料與方法

1.1 樣品的來源和收集

沐川烏骨雞購買于沐川縣黑鳳凰烏骨雞業(yè)有限公司，從1日齡開始飼養(yǎng)于佛山市動物育種工程技術(shù)研究中心，飼養(yǎng)至35日齡。全期自由采食飲水，按照規(guī)范的飼養(yǎng)管理進行飼養(yǎng)，日糧中各營養(yǎng)水平和飼養(yǎng)管理條件保持一致，各階段基礎日糧配方和營養(yǎng)水平一致。選擇54只健康沐川烏骨雞母雞進行采樣和后續(xù)試驗。取胸肌相同部位組織保存于-80℃，用于黑色素含量的測定。利用檸檬酸鈉抗凝劑真空采血管從翅靜脈采集全血 2 mL，保存于-20℃。采集皮膚、胸肌、肝臟組織樣品置于液氮速凍后-80℃保存。

1.2 皮膚色差和黑色素的測定

屠宰后利用色差儀（天翔飛域科技有限公司，SCQ-1A）測量左側(cè)胸部、左側(cè)腿部、背部皮膚色差、左側(cè)胸肌色差，同部位測量位點一致，記錄亮度值（L）、紅度值（a）、黃度值（b），L值越大表示膚色越白，a值越大表示膚色越紅，b值越大表示膚色越黃。每只雞取100 mg胸肌組織，按照雞ELISA黑色素提取試劑盒（上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司，YJ500392）測定黑色素含量，選擇450 nm波長測定OD值，并將OD值代入標準曲線，計算黑色素含量。

1.3 實時熒光定量PCR

取100 mg胸肌組織置于無菌無RNA酶2 mL研磨管中，加入1 mL預冷RNA isolater進行研磨，按照試劑盒說明書（南京諾唯贊生物科技有限公司，R401）進行總RNA的提取。提取完成后利用凝膠電泳檢測RNA完整性，利用核酸蛋白測定儀（Quawell，Q5000）檢測RNA純度和濃度。質(zhì)量合格的RNA按照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書（南京諾唯贊生物科技有限公司，R323）進行cDNA的合成。參照實時熒光定量PCR試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司，Q711）進行PCR。qPCR反應總體積為20 μL，其中包括10 μL 2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix，正、反向引物各0.4 μL，DNA模板1 μL，加ddH 2O補齊20 μL。實時熒光定量PCR反應程序為：首先預變性95℃ 30s；然后變性95℃ 10 s，退火60℃ 30 s，變性退火進行40個循環(huán)；最后95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中目的基因PMEL17（XM_040654744.2）和內(nèi)參基因GADPH（NM_204305.2）mRNA序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計引物，引物詳情見表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 基因組DNA提取和Sanger測序

每只雞取全血10 μL，按照血液基因組提取試劑盒說明書進行DNA提取。根據(jù)參考文獻［27］設計PMEL17基因外顯子2～6的區(qū)域引物，引物詳情見表 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以基因組DNA為模版進行PCR擴增。PCR擴增總體積為50 μL，其中包含2×T5 Super PCR mix（Basic） 25 μL，正、反向引物（10 μmol·L^-1）各2 μL，DNA模板1 μL，ddH 2O 20 μL。PCR擴增反應條件：98℃預變性3 min；98℃變性10 s，62.2℃退火10 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃保存。PCR產(chǎn)物由擎科生物科技股份有限公司進行Sanger測序。

1.5 SNPs位點篩選及分型

利用SnapGene軟件查看測序峰圖，確定SNPs位點，進行基因分型和基因型頻率的計算，利用LDBlockShow（版本號：v1.33）構(gòu)建單倍型估計連鎖不平衡參數(shù)。

1.6 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

實時熒光定量PCR的結(jié)果以2^-ΔΔCt方式表示。采用excel 2016、Prism 8.0和SPSS 20.0軟件計算、分析基因型頻率與黑色素含量的相關(guān)性并繪制圖表。Plt;0.05表示差異顯著，Plt;0.01表示差異極顯著，Pgt;0.05表示差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 皮膚色差測定結(jié)果

亮度L值均值大小排序為胸皮gt;腿皮gt;背皮，其中背皮與胸皮存在極顯著差異（Plt;0.01），背皮和腿皮存在顯著差異（Plt;0.05）。紅度a值均值大小排序為背皮gt;腿皮gt;胸皮，背皮與胸皮、背皮與腿皮均存在極顯著差異（Plt;0.01）。黃度b值均值大小排序為背皮gt;胸皮gt;腿皮，背皮與腿皮、胸皮與腿皮均存在極顯著性差異（Plt;0.01），如圖1所示。

2.2 胸肌黑色素表達

胸肌黑色素含量均值為118.161 mg·mL^- 最高為181.25 mg·mL^- 最低為96.953 mg·mL^- 個體差異大，如圖2所示。

2.3 胸肌黑色素含量與膚色相關(guān)性

本試驗將胸肌黑色素含量與胸皮、背皮、腿皮色差進行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明：胸肌黑色素含量與胸皮b值存在極顯著正相關(guān)（P＜0.0 r=0.37），與腿皮L值存在顯著正相關(guān)（P＜0.05，r=0.35），與胸皮L值、胸皮a值、背皮L值、背皮a值、背皮b值、腿皮a值、腿皮b值無顯著相關(guān)。胸皮黃度和腿皮亮度可以用于初步評估胸肌黑色素含量情況，胸皮越黃胸肌烏度越高，胸肌黑色素含量越高；腿皮越白胸肌烏度越高，胸肌黑色素含量越高，如圖3所示。

2.4 PMEL17基因表達量分析

利用實時熒光定量PCR方法檢測PMEL17基因在皮膚、胸肌、肝臟中的表達情況。其試驗結(jié)果如圖4所示，PMEL17基因在皮膚、胸肌、肝臟中均有表達，在皮膚的表達量最高，胸肌次之，在肝臟中表達量最低。皮膚中的表達量極顯著（P＜0.01）高于肝臟和胸肌，如圖4所示。

2.5 SNPs篩選結(jié)果

通過Sanger測序在沐川烏骨雞PMEL17基因發(fā)現(xiàn)5個突變位點，分別是：A-106G為有義突變，氨基酸從異亮氨酸變成甘氨酸、T-162C為有義突變，氨基酸從亮氨酸變成絲氨酸、G-332A、G-553A、G-662A為同義突變，編碼脯氨酸，如圖5所示。

2.6 SNPs位點與黑色素含量的關(guān)聯(lián)分析

對5個突變位點進行個體基因分型，計算每個位點的等位基因頻率和基因型頻率。利用相關(guān)性分析不同突變位點基因型與胸肌黑色素含量的關(guān)系。由表2可以看出，PMEL17基因的SNP.G-553A位點與胸肌黑色素含量顯著（P＜0.05）相關(guān)，其中GG型和AG型個體的黑色素含量存在顯著（P＜0.05）差異；AG型個體黑色素含量顯著（P＜0.05）高于GG型個體，AG型可以作為優(yōu)勢基因型。等位基因A的基因頻率為0.389，等位基因G基因頻率為0.61 G為胸肌黑色素含量的優(yōu)勢等位基因。其余突變位點不同基因型的胸肌黑色素含量無顯著差異。

2.7 SNPs位點連鎖不平衡分析

使用LD BlockShow進一步分析了PMEL17突變位點的連鎖不平衡，SNPs位點間連鎖性不強。其中，SNP.G-553A位點與SNP.T-162C位點間連鎖性最強（R2=0.51），其次是與SNP.G-106A位點（R2=0.37），與SNP.G-662A連鎖性最弱（R2=0.12），如圖6所示。

3 討 論

沐川烏骨雞烏度性狀選育研究多集中在烏膚性狀，烏度深淺是烏骨雞的主要選育標準，而黑色素含量對烏度深淺的影響至關(guān)重要。通過選擇與黑色素含量相關(guān)性較高的性狀實現(xiàn)黑色素的間接選育^［28］。喻世剛等^［29］發(fā)現(xiàn)，沐川烏骨雞黑羽的胸肌黑色素含量比白羽高，但黑羽群體的個體胸肌黑色素含量選育無法通過羽色進行。彭志軍等^［30］發(fā)現(xiàn)，可利用L值反映竹絲雞肌肉烏度，肉烏個體L值顯著低于肉紅個體，可通過胸肌亮度評估烏度和胸肌黑色素含量^［31］，但利用色差儀測量胸肌亮度需在胸部皮膚打孔，對雞應激性大。曾昌巧等^［32］研究發(fā)現(xiàn)，沐川烏骨雞越烏的部位L值越小。L值是對烏骨雞皮膚亮度的體現(xiàn)，L值越低其顏色越深^［33］。本研究發(fā)現(xiàn)，35日齡時沐川烏骨雞胸皮黃度和腿皮亮度與胸肌黑色素含量呈強正相關(guān)，胸皮越黃，胸肌黑色素含量越高，腿皮烏度越低，胸肌黑色素含量越高。黑色素含量隨著生長發(fā)育逐漸升高，具有組織特異性，背部、腿部和翅部的皮膚積累速度較快，而胸部和脛部皮膚的積累過程較為緩慢^［32］。35日齡時，沐川烏骨雞日齡較小，黑色素快速沉積，各組織間存在差異，因此，可利用胸皮黃度和腿皮亮度初步評估胸肌黑色素含量。

黑色素沉積是成熟的黑色素細胞通過黑素小體將黑色素運輸?shù)浇琴|(zhì)化細胞中的過程^［34］。PMEL17作為黑色素小體成熟II期的原纖維結(jié)構(gòu)基礎之一^［35］，能保障黑色素的順利合成。PMEL17基因作為稀釋基因家族中的一員，該基因的缺失或突變會造成動物不同程度的色素減退^［36］和色素細胞凋亡^［37］。本研究探究PMEL17基因在組織間的表達，結(jié)果顯示該基因在皮膚組織表達最高，而在肝臟和胸肌幾乎不表達，這與潘家華等^［10］的研究結(jié)果一致。皮膚一直被作為色素沉積最多的部位^［38］，在本研究中PMEL17在皮膚組織的表達量顯著高于肝臟和胸肌，表明PMEL17的表達具有組織差異性，但差異機制還需要進一步研究。

隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，基于分子標記技術(shù)選育烏骨雞的手段應運而生。彭燦陽^［12］研究表明，PMEL17基因SNPs.1843Ggt;C、2812Cgt;T和2794Ggt;A可作為雪峰烏骨雞烏度選育的分子標記。Kerje等^［39］研究發(fā)現(xiàn)，顯性白等位基因與PMEL17基因外顯子10上的9 bp插入片段完全連鎖，導致羽毛白色表型。本試驗通過測序在PMEL17基因上挖掘到5個突變位點，發(fā)現(xiàn)SNP.G-553A 位點與胸肌黑色素含量有顯著相關(guān)性，表明PMEL17基因的多態(tài)性與胸肌黑色素性狀具有一定的關(guān)聯(lián)性，可作為胸肌黑色素含量的候選分子標記。

PMEL17主要參與黑色素前體的積累和沉積，促進黑色素前體的聚集和轉(zhuǎn)化，維持黑色素顆粒的結(jié)構(gòu)完整性，影響黑色素的生成和沉積，在一定程度抑制真黑色素的生成^［40］。敲除黑色羅非魚PMEL17后恢復野生型顏色，表明PMEL17是決定金色和黑色的基因^［41］。本研究發(fā)現(xiàn)，PMEL17基因序列上G-553A位點AG基因型個體胸肌黑色素含量顯著高于GG基因型個體胸肌黑色素含量，但該突變位點是否影響蛋白質(zhì)功能，還需要進一步深入研究。該位點中等位基因G基因頻率為0.61 對于黑色素性狀來說，AG基因型為優(yōu)勢基因型，與彭燦陽^［12］研究表明CC型為優(yōu)勢基因的結(jié)論不一致，這可能是因為本試驗所用雞的品種以及日齡不同所造成。本研究結(jié)果可為今后的育種工作提供一定的理論基礎，但仍需進一步在大群體進行驗證。

4 結(jié) 論

35日齡時沐川烏骨雞胸皮黃度b值和腿皮亮度L值可作為胸肌黑色素含量初步估測的指標；PMEL17基因與沐川烏骨雞胸肌黑色素沉積有一定關(guān)聯(lián)，顯著相關(guān)的SNP G-553A位點可作為胸肌黑色素沉積的分子標記，本研究豐富了地方烏骨雞品種的選育理論。

感謝佛山大學分析測試中心對本研究提供的設備支持。

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（編輯 郭云雁）