摘 要： 旨在利用721只固始雞F2代雞群，鑒定影響肌內(nèi)脂肪沉積的候選基因G3BP1的SNPs位點(diǎn)，用于肉質(zhì)性狀的分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)，并利用固始雞肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞深入探究其功能。本研究首先鑒定了G3BP1基因上的SNPs位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)3個(gè)突變位點(diǎn)處于強(qiáng)連鎖不平衡狀態(tài)，尤其是13588667Ggt;A位點(diǎn)的不同基因型與固始雞F 2資源群的皮脂、皮脂率和肌內(nèi)脂肪等肉質(zhì)性狀顯著相關(guān)（Plt;0.05）。因此，G3BP1基因13588667Ggt;A位點(diǎn)可以作為影響肌內(nèi)脂肪沉積的一個(gè)重要的分子標(biāo)記。此外，本研究利用qRT-PCR、CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)、甘油三酯含量測(cè)定和油紅O染色等方法，評(píng)價(jià)了G3BP1基因?qū)淌茧u肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞增殖與分化的影響。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)G3BP1后，肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞中增殖標(biāo)志基因CDK1、CCNB2、PCNA和CCND1表達(dá)水平均極顯著上升（Plt;0.001），并顯著促進(jìn)了細(xì)胞周期進(jìn)程。過(guò)表達(dá)G3BP1后也顯著促進(jìn)了肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因LPL的表達(dá)（Plt;0.05），極顯著促進(jìn)了CEBPA的表達(dá)（Plt;0.001），肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴生成和甘油三酯含量也極顯著增加（Plt;0.01）。本研究明確了G3BP1在促進(jìn)肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞增殖與脂肪細(xì)胞生成中的作用，并鑒定了影響肌內(nèi)脂肪沉積的分子標(biāo)記，為我國(guó)優(yōu)質(zhì)肉雞培育提供重要的理論依據(jù)和應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞： 固始雞；肌內(nèi)脂肪；G3BP1；分子標(biāo)記

中圖分類(lèi)號(hào)：S831.2"""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"""" 文章編號(hào)： 0366-6964（2025）01-0159-09

收稿日期：2024-08-09

基金項(xiàng)目：雞生長(zhǎng)性狀精準(zhǔn)評(píng)價(jià)與高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)核心種質(zhì)創(chuàng)制 （SN01-2022-05）；重要農(nóng)業(yè)動(dòng)植物優(yōu)異性狀共性調(diào)控元件挖掘與基因資源設(shè)計(jì) （2023YFF1001100）；中國(guó)博士后科學(xué)基金面上項(xiàng)目 （GZC20233467）

作者簡(jiǎn)介：李遠(yuǎn)方（1991-），女，河南平頂山人，博士，主要從事畜禽資源分子評(píng)價(jià)的研究，E-mail： yuanfangli1991@163.com

*通信作者：劉翹銘，主要從事生物信息學(xué)研究，E-mail： cslqm@hit.edu.com；李國(guó)喜，主要從事家禽遺傳育種的研究，E-mail： liguoxi0914@126.com；李 智，主要從事畜禽資源分子評(píng)價(jià)的研究，E-mail： 18530085133@163.com

LI" Yuanfang 肌內(nèi)脂肪與肉的風(fēng)味、多汁性、嫩度等肉質(zhì)性狀密切相關(guān)^［1-2］。IMF主要存在于肌纖維之間的脂肪細(xì)胞中，IMF的形成受到營(yíng)養(yǎng)、激素和遺傳等多種因素的調(diào)控，其中遺傳因素起關(guān)鍵作用^［3-5］。隨著消費(fèi)者對(duì)高品質(zhì)肉類(lèi)需求的增加，研究雞肉IMF的形成機(jī)制和遺傳調(diào)控變得尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ、CEBPA、FABP4和LPL等基因在IMF形成過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用^［6-8］，這些基因通過(guò)促進(jìn)脂肪細(xì)胞的生成、分化和脂質(zhì)積累，增加IMF含量。然而，這些已知基因并不能完全解釋我國(guó)地方品種雞IMF相關(guān)的遺傳變異，因此，亟待解析影響我國(guó)地方品種雞IMF形成的機(jī)制，尋找有效的IMF性狀相關(guān)的分子標(biāo)記。

固始雞是我國(guó)肉蛋兼用型品種雞，原產(chǎn)于河南省固始縣，其具有肉質(zhì)細(xì)嫩、風(fēng)味獨(dú)特和營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn)，素有“中國(guó)土雞之王”的美譽(yù)^［9-10］，但是目前對(duì)其IMF形成機(jī)制的了解相對(duì)缺乏。本課題組前期" 利用固始雞F 2資源群體，通過(guò)GWAS分析發(fā)現(xiàn)Ras-GTPase激活蛋白 （SH3域） 結(jié)合蛋白1 （Ras-GTPase-activating protein SH3 domain binding protein" G3BP1） 是影響IMF性狀的候選基因，且在固始雞胸肌組織中表達(dá)量非常豐富^［11-12］。G3BP1是一種RNA結(jié)合蛋白^［13］，在真核生物進(jìn)化過(guò)程中高度保守，同時(shí)具有多種生物學(xué)功能^［14-16］。已有大量研究表明，G3BP1參與癌癥反應(yīng)^［17-19］以及機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)^［20-21］。此外，G3BP1還被發(fā)現(xiàn)與前脂肪細(xì)胞增殖相關(guān)。LV等^［22］的研究顯示，miR-129-5p通過(guò)靶向G3BP1并激活p38信號(hào)通路來(lái)抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖。然而，盡管已有證據(jù)表明了G3BP1在前脂肪細(xì)胞增殖中的作用，但其在畜禽領(lǐng)域中的關(guān)聯(lián)性尚未得到驗(yàn)證。因此，本研究較為系統(tǒng)地研究了G3BP1基因?qū)淌茧u肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞增殖和分化的影響，并在固始雞F 2資源群中篩選了該基因的遺傳變異位點(diǎn)，旨在開(kāi)發(fā)與雞IMF性狀相關(guān)的分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)用DNA血樣來(lái)自于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽中心實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的固始雞F 2資源群，構(gòu)建方法及飼養(yǎng)管理?xiàng)l件等細(xì)節(jié)參考文獻(xiàn)［23］。試驗(yàn)動(dòng)物為固始雞，取材于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽種質(zhì)資源場(chǎng)。

1.2 RNA提取、cDNA合成和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）

Trizol法提取雞原代前脂肪細(xì)胞總RNA，使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，日本）試劑盒進(jìn)行cDNA的合成。實(shí)時(shí)熒光定量以cDNA為模板，使用SYBR Green（TaKaRa，日本）染料進(jìn)行，反應(yīng)體系為20 μL：2×SYBR Green Mix 10 μL，cDNA模板 1 μg，上、下游引物各 0.2 μmol·L^- RNase Free dH 2O 補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，循環(huán) 40 次。雞的GAPDH基因作為內(nèi)參基因，每個(gè)樣品均進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)，用 2^{-△△CT［24］}方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，引物序列如表1所示。

1.3 原代肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞的分離和誘導(dǎo)分化

利用2～3周齡的固始雞胸肌組織分離原代肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞。無(wú)菌條件下，取2～3周齡的固始雞腹部脂肪組織，用1%鏈霉素/青霉素PBS溶液沖洗胸肌組織3次，再用眼科剪剪碎組織后用細(xì)胞消化液（組織塊∶消化液=1∶5）在37 ℃水浴鍋消化60 min，消化中間每5 min振蕩1次。待完全消化后，加入完全培養(yǎng)基終止消化，分別經(jīng)100、200和500目的篩網(wǎng)過(guò)濾后，500 g離心10 min，然后用紅細(xì)胞裂解液重懸并在溫室下孵育10 min，然后細(xì)胞沉淀用完全培養(yǎng)基反復(fù)重懸、離心2次后，將細(xì)胞懸液接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于 37℃、5% CO 2培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，2 h后換液得到肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞，利用油紅O染色法鑒定細(xì)胞的純度。

分離的肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞被接種到6孔板中，待細(xì)胞融合達(dá)到90%后，用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基代替完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，最后使用完全培養(yǎng)基直至10 d后完全分化。誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的配制如下：將6.3 μL油酸標(biāo)準(zhǔn)品與1 mL DMSO混合配制為油酸原液，取400 μL油酸原液與50 mL完全培養(yǎng)基混合配制成誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基。

1.4 CCK-8和細(xì)胞周期檢測(cè)

CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力，步驟參考Cell Counting Kit-8 （美侖，中國(guó)）說(shuō)明書(shū)。細(xì)胞周期檢測(cè)：收集細(xì)胞后先加入75%乙醇放置-20 ℃過(guò)夜，離心后PBS進(jìn)行水合，隨后加碘化丙啶染色液進(jìn)行孵育細(xì)胞，最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，計(jì)數(shù)2萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，結(jié)果用FlowJo7.6軟件分析。

1.5 油紅O染色和甘油三酯檢測(cè)

處理后的細(xì)胞移去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕清洗3次后，用4% 的甲醛固定液將細(xì)胞固定40 min，然后用PBS清洗3次，最后用0.5%的油紅O染色10 min進(jìn)行顯微鏡觀察。甘油三酯檢測(cè)采用甘油三酯檢測(cè)試劑盒測(cè)定（普利萊，中國(guó)），按照廠家技術(shù)說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0進(jìn)行獨(dú)立樣本t-test分析，每組3個(gè)生物學(xué)重復(fù) （n≥3）；Plt;0.05 表示差異顯著（用*表示），Plt;0.01 表示差異極顯著（用**表示），Plt;0.001 表示差異極顯著（用***表示），Pgt;0.05時(shí)表示無(wú)顯著性差異；結(jié)果使用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行作圖，數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤 （mean±SEM）”。

2 結(jié) 果

2.1 G3BP1基因突變位點(diǎn)的篩選

本研究前期通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析鑒定到與固始雞IMF沉積相關(guān)的候選基因G3BP 為了初步篩查G3BP1基因中的SNPs位點(diǎn)，首先利用300只固始雞F 2資源群的DNA混合樣品進(jìn)行了PCR產(chǎn)物測(cè)序，共篩選到8個(gè)突變位點(diǎn)，所在基因上的位置如圖1A所示。此外，為了進(jìn)一步鑒定G3BP1基因中的SNPs位點(diǎn)信息，又利用721只固始雞F 2資源群的DNA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)3個(gè)SNPs 位點(diǎn)在該群體中的突變頻率較高（超過(guò)10%），突變位點(diǎn)的測(cè)序圖譜如圖1B所示。

2.2 G3BP1基因突變位點(diǎn)多態(tài)性與連鎖不平衡分析

本研究對(duì)G3BP1基因的3個(gè)SNPs（13588667Ggt;A、13588768Cgt;A和13588930Cgt;T）進(jìn)行基因型頻率統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如表2所示，3個(gè)SNPs位點(diǎn)的雜合度均大于0. 說(shuō)明該群體具有良好的遺傳多樣性。利用HaploView軟件進(jìn)行連鎖不平衡分析，結(jié)果如圖2所示，3個(gè)SNPs位點(diǎn)具有強(qiáng)相關(guān)關(guān)系（r² gt;0.95）。

2.3 G3BP1基因變異位點(diǎn)與固始雞F2資源群主要肉質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)分析

選定強(qiáng)連鎖位點(diǎn)中具有代表性的13588667Ggt;A多態(tài)位點(diǎn)與肉質(zhì)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示，該位點(diǎn)不同基因型與雞的皮脂、皮脂率和肌內(nèi)脂肪顯著相關(guān)（Plt;0.05），AA基因型個(gè)體的皮脂、皮脂率和肌內(nèi)脂肪值均小于GG基因型和GA基因型（表3），GA基因型的皮脂、皮脂率均顯著高于GG基因型（Plt;0.05）。

2.4 G3BP1對(duì)雞肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞增殖的影響

首先用油紅O染色法鑒定細(xì)胞的純度，發(fā)現(xiàn)分離的肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞純度較高（圖3A），可用作后續(xù)試驗(yàn)。在肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞增殖期分別將過(guò)表達(dá)載體pcDNA3.1-G3BP1和對(duì)照空載pcDNA3.1轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)組的G3BP1表達(dá)水

平極顯著增加（Plt;0.001）（圖3B），表明G3BP1基因過(guò)表達(dá)成功。為了研究G3BP1在肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞增殖中的作用，通過(guò)在肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞增殖中過(guò)表達(dá)G3BP 檢測(cè)增殖標(biāo)志基因的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)增殖標(biāo)志基因CDK1、CCNB2、PCNA和CCND1表達(dá)量均極顯著升高（Plt;0.001）（圖3C）。通過(guò)CCK-8檢測(cè)G3BP1對(duì)細(xì)胞增殖活力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)G3BP1后24 h的細(xì)胞活力顯著升高（Plt;0.05）（圖3D）。此外，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)G3BP1后，G1/G0期細(xì)胞極顯著降低（Plt;0.01），S期細(xì)胞極顯著增多（Plt;0.01）（圖3E-G），說(shuō)明 G3BP1促進(jìn)了肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞的周期進(jìn)程。以上結(jié)果均表明G3BP1可以促進(jìn)肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞的增殖。

2.5 G3BP1對(duì)雞肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞分化的影響

為了檢測(cè)G3BP1基因?qū)?nèi)前脂肪細(xì)胞分化的影響，在肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞過(guò)表達(dá) G3BP1后，發(fā)現(xiàn)分化標(biāo)志基因LPL顯著升高（Plt;0.05），CEBPA極顯著升高（Plt;0.001），F(xiàn)ABP4、FABP5、FASN和PPARγ有升高趨勢(shì)，但是變化不顯著（圖4A）。過(guò)表達(dá)G3BP1后肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞中的甘油三酯（TG）含量極顯著上升（Plt;0.01）（圖4B）。此外，過(guò)表達(dá)G3BP1極顯著增加了肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞中的脂滴生成（Plt;0.01）（圖4C-E）。

3 討 論

肌內(nèi)脂肪含量的適度增加可以顯著提升肉類(lèi)的感官特性，已成為畜禽肉品質(zhì)改良的關(guān)鍵目標(biāo)之一^［25-27］。分子育種加速了動(dòng)物育種的速度，通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析能夠篩選出影響重要經(jīng)濟(jì)性狀的分子標(biāo)記，為分子育種提供理論基礎(chǔ)^［28］。利用IMF性狀相關(guān)基因的分子標(biāo)記進(jìn)行選育，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)IMF含量的精準(zhǔn)調(diào)控^［29］。本課題組前期通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析鑒定到與固始雞IMF沉積相關(guān)的候選基因G3BP1^［11-12］，為了鑒定相關(guān)的分子標(biāo)記，本研究檢測(cè)了G3BP1基因的遺傳變異位點(diǎn)，結(jié)果鑒定到3個(gè)SNPs位點(diǎn)存在強(qiáng)連鎖關(guān)系（r² gt;0.95），有研究表明，在遺傳學(xué)研究中，r2與關(guān)聯(lián)分析的效力密切相關(guān)，當(dāng)幾個(gè)SNPs處在連鎖不平衡狀態(tài)，那么這種變異可能會(huì)比單個(gè)位點(diǎn)更有價(jià)值和效能^［30-31］。在鑒定到的3個(gè)緊密連鎖的位點(diǎn)中，選取了位點(diǎn)13588667Ggt;A進(jìn)行深入研究?；跍y(cè)序數(shù)據(jù)，對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行了關(guān)聯(lián)性分析，結(jié)果表明該位點(diǎn)的不同基因型與雞的皮脂含量、皮脂率以及肌內(nèi)脂肪含量顯著相關(guān)（Plt;0.05），攜帶AA基因型的個(gè)體在皮脂、皮脂率和肌內(nèi)脂肪含量上均低于GG和GA基因型的個(gè)體，這表明GG和GA基因型是較為優(yōu)良的基因型。因此，該位點(diǎn)有望作為一個(gè)有效的分子標(biāo)記，可能實(shí)現(xiàn)對(duì)肌內(nèi)脂肪含量的精準(zhǔn)調(diào)控。

前脂肪細(xì)胞的增殖與分化直接影響IMF的沉積，G3BP1可能在調(diào)控肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞的增殖與分化中起關(guān)鍵作用。細(xì)胞周期蛋白（如cyclins）和細(xì)胞周期依賴(lài)性激酶（CDKs）等的活性驅(qū)動(dòng)前脂肪細(xì)胞進(jìn)入增殖階段^［32-33］。本研究檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，G3BP1通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因（如CDK1、CCNB2、PCNA和CCND1）的表達(dá)，促進(jìn)前脂肪細(xì)胞的增殖，且流式細(xì)胞術(shù)和CCK-8檢測(cè)結(jié)果同樣證實(shí)了G3BP1在肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞增殖中的促進(jìn)作用。前脂肪細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程^［34］，涉及多個(gè)基因和信號(hào)通路的協(xié)同調(diào)控^［35-36］。脂肪細(xì)胞數(shù)量的增加受信號(hào)因子誘導(dǎo)，部分信號(hào)因子可驅(qū)動(dòng)間充質(zhì)干細(xì)胞向前脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化，進(jìn)而分化為脂肪細(xì)胞^［37-38］。本研究結(jié)果表明，G3BP1基因通過(guò)上調(diào)脂肪生成相關(guān)基因（如LPL和CEPBA）的表達(dá)，促進(jìn)前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化。此外，G3BP1基因還影響肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞甘油三酯的含量，促進(jìn)脂滴在細(xì)胞內(nèi)的形成和積累，這是成熟脂肪細(xì)胞的主要特征^［39］。G3BP1能夠促進(jìn)前脂肪細(xì)胞的增殖以及脂肪細(xì)胞的生成，這一機(jī)制在肥胖相關(guān)基因 （FTO） 的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中也得到證實(shí)，F(xiàn)TO通過(guò)調(diào)控WNT/β-catenin通路中的相關(guān)因子，進(jìn)一步增強(qiáng)了前脂肪細(xì)胞的增殖與脂肪細(xì)胞的生成^［40］。因此，本研究明確了G3BP1在肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞增殖和脂肪細(xì)胞生成中的作用。

4 結(jié) 論

本研究明確了G3BP1基因13588667Ggt;A位點(diǎn)不同基因型與固始雞的皮脂、皮脂率和肌內(nèi)脂肪顯著相關(guān)（Plt;0.05），該位點(diǎn)可以作為檢測(cè)肌內(nèi)脂肪的一個(gè)重要分子標(biāo)記，此外確定了G3BP1具有促進(jìn)肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞增殖與脂肪細(xì)胞生成的作用。本研究為我國(guó)優(yōu)質(zhì)肉雞培育提供了重要的理論依據(jù)和應(yīng)用價(jià)值。

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（編輯 郭云雁）