摘 要： 旨在解析CUL2基因的結(jié)構(gòu)變異是否影響基因表達及其與香豬皺皮嚴重程度之間的聯(lián)系。本研究取200頭6月齡皺皮香豬和普通香豬的皮膚和血樣，采用PCR方法檢測基因組中CUL2-I3-sv300位點的多態(tài)性分布，利用UCSC等在線軟件分析該結(jié)構(gòu)變異包含的功能元件，預(yù)測CUL2基因與其它基因間的互作網(wǎng)絡(luò)，并應(yīng)用RT-qPCR和Western blot技術(shù)檢測CUL2以及皮膚膠原蛋白生成相關(guān)基因的表達量變化。結(jié)果表明，豬群中結(jié)構(gòu)變異CUL2-I3-sv300表現(xiàn)出豐富的多態(tài)性，普通香豬中檢測到缺失突變基因型MM、雜合型WM和野生型WW，而皺皮香豬中未檢測到WW基因型；且皺皮香豬的M等位基因頻率顯著增加（Plt;0.05）。生物信息學分析提示，結(jié)構(gòu)變異CUL2-I3-sv300中含有一個短散在元件（short interspersed nuclear element， SINE）、3個內(nèi)含子剪切抑制子（intronic splicing silencers， ISS）和4個RNA結(jié)合蛋白位點（RNA binding protein sites， RBPs）等功能元件；預(yù)測CUL2可直接調(diào)控HIF-1α，進一步調(diào)控VEGFA、MMP-1、MMP-9，最終影響皮膚膠原蛋白的生成。經(jīng)皮膚樣品檢測，MM型皺皮CUL2的mRNA表達量明顯高于其它基因型；且MM型皺皮CUL2的蛋白表達量高于MM型普通皮膚的相應(yīng)值。同時，MM型皺皮的MMP-1、MMP-9表達量高于普通皮膚，HIF-1α、VEGFA 、COL1A1、COL3A1、COL6A3基因表達量卻低于普通皮膚。推測缺失型結(jié)構(gòu)變異因丟失了SINE等功能元件，可促進皺皮CUL2等的表達，抑制膠原蛋白生成，進而加重香豬體側(cè)皮膚褶皺的嚴重程度。

關(guān)鍵詞： 皺皮香豬；CUL2基因；膠原蛋白；皮膚褶皺；生物信息學分析

中圖分類號：S828.2"""" 文獻標志碼：A""""" 文章編號： 0366-6964（2025）01-0136-11

收稿日期：2024-07-09

基金項目：國家自然科學基金（31960641）；貴州省科技創(chuàng)新人才團隊項目黔科合平臺人才（［2019］5615）

作者簡介：周顯珊（1996-），女，貴州貴陽人，碩士生，主要從事動物生物化學與分子生物學研究，E-mail： 343485021@qq.com

*通信作者：冉雪琴，主要從事動物生物化學與分子生物學研究，E-mail： xqran@gzu.edu.cn；王嘉福，主要從事動物生物化學與分子生物學研究，E-mail： jfwang@gzu.edu.cn

Differential Expression Study of Structural Variation in the Ubiquitin Ligase 2 Gene

of Xiang Pigs with Wrinkled Skin

ZHOU" Xianshan HUANG" Shihui NIU" Xi2， RAN" Xueqin "WANG" Jiafu

（1.College of Animal Science， Guizhou University， Guiyang 550025，" China;

2.Institute of

Agricultural Bioengineering， Guizhou University， Guiyang 550025，" China）

Abstract： "The present study aimed to explore whether the structural variation in CUL2 affected the gene expression and wrinkle severity on skin of Xiang pigs. The 200 skins and blood samples were collected from Xiang pigs with wrinkled skin and common Xiang pigs in 6 months old. The polymorphic distribution of the CUL2-I3-sv300 site was examined using PCR method. Based on the prediction of potential functional elements within the structural variation region， and the interaction between CUL2 gene and other related genes by softwares online such as UCSC， the expression levels of CUL2 and those collagen formation-related genes were determined using RT-qPCR and Western blot methods. The results showed that the structural variation CUL2-I3-sv300 exhibited abundant polymorphism within the pig populations. Genotypes of the mutant （MM），the heterozygous （WM） and the wild （WW） were detected from skins of the common Xiang pigs， while type WW was not detected from the Xiang pig with wrinkled skin. Furthermore， the allele M was significantly more abundant in Xiang pigs with wrinkled skin compared with that in the common Xiang pigs （Plt;0.05）. Based on the bioinformatics analysis， several elements were screened from the structural variation region including a short interspersed nuclear element （SINE）， three intronic splicing silencers （ISS） and four RNA binding protein sites （RBPs）. And CUL2 might regulate HIF-1α， indirectly change VEGFA， MMP- and MMP-9， and eventually affect the formation of skin collagen. After detection by using both of the wrinkled skin and common skin， the mRNA and protein levels of CUL2 expression were higher in the wrinkled skin with MM genotypes than that with other genotypes in wrinkled and common skins. Moreover， the expression of CUL2， MMP-1 and MMP-9 were up-regulated， while mRNA levels of HIF-1α， VEGFA， COL1A COL3A1 and COL6A3 genes were down-regulated in Xiang pig with wrinkled skin compared with samples from the common Xiang pig.It is suggested that the loss of those functional elements in the structural variation region might promote the expression of CUL2 while inhibit collagen formation， thereby aggravating the severity of skin wrinkles on Xiang pig body.

Key words： Xiang pigs with wrinkled skin; CUL2 gene; collagen; wrinkled skin; bioinformatics analysis

*Corresponding authors：" RAN Xueqin， E-mail： xqran@gzu.edu.cn; WANG Jiafu， E-mail： jfwang@gzu.edu.cn

皮膚是覆蓋動物身體表面的復(fù)雜器官，皮膚衰老受內(nèi)在或外在因素的影響，臨床表現(xiàn)之一是出現(xiàn)皮膚褶皺^［1-2］。人類皮膚在內(nèi)在因素的作用下，細胞增殖能力下降，細胞衰老的進程加快，導致皮膚的結(jié)構(gòu)和生理功能紊亂，形成深而密的皮膚褶皺；在紫外線等外在因素刺激下，活性氧聚集，造成皮膚細胞受損，基質(zhì)金屬蛋白酶表達增加，真皮細胞外基質(zhì)降解，膠原蛋白數(shù)量減少或斷裂，皮膚松弛出現(xiàn)皺紋^［3-4］。已有研究在皮膚的遺傳變異方面取得了進展。例如，Lamin A/C基因的單核苷酸變異導致人的早衰癥（hutchinson-gilford，HGPS）；FOXN1發(fā)生缺失變異導致巴曼貓全身皮膚密布褶皺；ELN 基因的易位或缺失會引起人的皮膚松弛^［5-8］?；蚪Y(jié)構(gòu)變異對皮膚褶皺等復(fù)雜表型的貢獻占總遺傳變異的83.6%，同時基因表達異常等也在皮膚衰老中發(fā)揮重要作用^［9-12］。皮膚褶皺屬于多基因控制的數(shù)量性狀^［13］。

香豬是一類小型地方豬品種。部分中國地方豬，如二花臉和梅山豬等，額頭上有明顯的褶皺，是中國地方豬的品種特征之一；經(jīng)全基因組關(guān)聯(lián)分析，GRM4的G等位基因有利于增加二花臉豬的面部褶皺；NFKB1具有較強的選擇信號，可能是小梅山豬出現(xiàn)頭面部褶皺的原因^［14-15］。與其它中國地方豬種一樣，香豬也有特征性的面部褶皺，但有少數(shù)個體的體側(cè)和臀部出現(xiàn)了深且密的褶皺，這種特殊的全身性皮膚褶皺表型可遺傳，群體自然發(fā)生率約為1%～3%^［16］。

泛素化連接酶2（cullin 2， CUL2）由CUL2基因編碼，是泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system，UPS）的成員之一，參與蛋白的泛素化過程。泛素化在蛋白質(zhì)的定位、代謝、功能、調(diào)節(jié)和降解等過程中起作用^［17］。研究表明CUL2參與人膠原蛋白的降解^［18-20］。迄今為止，香豬全身性褶皺的原因仍不清楚^［13］。本實驗室前期對皺皮香豬進行基因組重測序，發(fā)現(xiàn)CUL2基因的內(nèi)含子3中有一個結(jié)構(gòu)變異CUL2-I3-sv300，皺皮香豬中該結(jié)構(gòu)變異的檢出率為75%，明顯高于普通香豬（25%），提示皺皮香豬的CUL2基因中擁有更高頻率的變異。本試驗進一步研究CUL2基因中的結(jié)構(gòu)變異與基因表達差異和香豬皮膚褶皺間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

50頭6月齡皺皮香豬和150頭6月齡普通香豬的血液和皮膚樣品采自貴州從江粵黔香豬開發(fā)有限公司。血液與皮膚樣本置于-80 ℃保存。血液樣品用于基因型分析，皮膚樣品用于基因的mRNA和蛋白表達研究。

1.1.2 主要試劑

基因組DNA提取試劑盒、DL2000 DNA Marker、膠回收試劑盒、96孔板、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液5×、PVDF膜（0.45 μm）、TRNzol試劑購自天根生化科技北京有限公司；小鼠單克隆抗體CUL2購自Santa Cruz公司（SC-166506）；山羊抗小鼠lgG（HRP）二抗購自武漢塞維爾生物科技有限公司（GB23301）；pGEM-T載體、Go Script Revert Transcription System為Promega公司產(chǎn)品；BCA蛋白濃度測定試劑盒和SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Minute^TM皮膚組織總蛋白提取試劑盒購自英文特生物技術(shù)北京有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品基因組提取

根據(jù)試劑盒操作方法提取組織和血液樣本的基因組DNA，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，基因組質(zhì)量良好，分裝成100 μL的小份量，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計

從NCBI GenBank 下載豬的CUL2基因參考序列（Scrofa11.1），取結(jié)構(gòu)變異上、下游各200 bp的堿基序列，利用Primer5設(shè)計引物（表1）。引物由生工生物工程上海股份有限公司合成。

1.2.3 CUL2結(jié)構(gòu)變異PCR擴增

以皺皮香豬、普通香豬的基因組作為模板進行PCR擴增。PCR體系（20 μL）：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，ddH 2O 8 μL，上、下游引物（10 μmol·L^-1）各0.5 μL，基因組模板1 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃保存。取10 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，于紫外燈下切取含目的條帶的膠塊，由生工生物工程上海股份有限公司測序。

1.2.4" CUL2結(jié)構(gòu)變異的群體分型

將缺失類型定義為突變的M等位基因，與參考基因一樣的定義為野生的W等位基因，等位基因頻率=純合子基因型頻率+（雜合子基因型頻率/2），計算各豬群3種基因型和等位基因頻率；應(yīng)用SPSS軟件對組間差異進行進卡方檢驗，分析差異顯著性。

1.2.5 CUL2結(jié)構(gòu)變異的生物信息學分析

用在線軟件UCSC分析結(jié)構(gòu)變異CUL2-I3-sv300區(qū)域中是否含有重復(fù)元件；以軟件SpliceAid分析內(nèi)含子剪切抑制子；采用Web Circ RNA分析結(jié)構(gòu)變異序列能否成環(huán)，RBP suite分析結(jié)構(gòu)變異中的RBP結(jié)合位點；采用STRING分析CUL2與相關(guān)蛋白之間的網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系（表2）。

1.2.6 樣品總RNA提取及cDNA合成

根據(jù)TRNzol試劑盒說明書提取樣本總RNA，1.5%甲醛瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的質(zhì)量，如28S rRNA的亮度約為18S rRNA的2倍，表明總RNA質(zhì)量良好。以總RNA為模板，應(yīng)用Go Script Revert Transcription System逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。cDNA反應(yīng)體系為20 μL：2 μL總RNA，4 μL RNase-free H 2O，10 μL Go script Enzyme Mix，4 μL Oligo（dT）。

1.2.7 基因RT-qPCR檢測

以cDNA為模板進行PCR擴增，1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離目的片段，膠回收后連接pGEM-T Vector，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，用氨芐青霉素-LB固體培養(yǎng)基篩選，陽性單菌落擴大培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒，由生工生物工程上海股份有限公司測序。將內(nèi)參基因和目的基因的重組質(zhì)粒分別做5個10倍梯度稀釋為模板，進行RT-qPCR，檢測定量引物對的擴增效率。采用實時熒光定量PCR方法檢測基因的表達量，以GAPDH為內(nèi)參，設(shè)3個生物學樣本重復(fù)，每個樣本進行3個技術(shù)重復(fù)，用2^-ΔΔCt法計算基因的相對表達量，應(yīng)用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行T檢驗和方差分析。qPCR檢測體系20 μL：模板2 μL，上、下游引物各0.5 μL，SYBR Premix Ex Taq^TM（2×）10 μL，ddH 2O 7 μL；反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃ 3 min；變性95℃ 5 s，退火60℃ 20 s，延伸72℃ 20 s，30個循環(huán)。

據(jù)NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中CUL2、HIF-1α、VEGFA、MMP-9、MMP-1、COL1A1、COL3A1、COL6A3基因序列，采用Primer Premier 5.0 設(shè)計定量引物（表1）。應(yīng)用NCBI中的Primer Blast分析引物特異性，DNAstar分析引物對的二級結(jié)構(gòu)。

1.2.8 皮膚總蛋白提取

取MM、WM、WW三種基因型的皮膚樣本，去除被毛和皮下脂肪，使用Minute^TM皮膚組織總蛋白提取試劑盒提取蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白的濃度，與5×蛋白上樣緩沖液按4∶1比例混勻，沸水浴10 min，短暫離心取上清-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.9 蛋白表達量檢測

配制5%的濃縮膠和8%分離膠，每孔加入20 μL 1.5 μg·μL^-1的總蛋白樣品，SDS-PAGE電泳分離，采用半干轉(zhuǎn)印將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，加入一抗、二抗檢測目的蛋白，顯影拍照。

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)構(gòu)變異CUL2-I3-sv300群體基因分型

以皺皮香豬和普通香豬的基因組DNA為模板，經(jīng)特異性引物PCR-CUL2-F/R進行擴增，得到289 bp和589 bp兩種條帶（圖1），經(jīng)Sanger測序，與 Scrofa11.1參考基因比對，589 bp片段與CUL2參考序列（NC_010452.4∶57700667～57829388）的相似性為100%，處于CUL2基因（Chr10∶57700667～57829388）的第3個內(nèi)含子中（圖2）。較短的289 bp片段是589 bp缺失了300 bp后的片段，此300 bp即為結(jié)構(gòu)變異CUL2-I3sv300。將589 bp定義為野生的W等位基因，289 bp定義為突變的M等位基因。由此建立了CUL2-I3-sv300結(jié)構(gòu)變異的PCR檢測方法。

2.2 結(jié)構(gòu)變異基因型和等位基因頻率分析

采用建立的CUL2-I3-sv300結(jié)構(gòu)變異PCR檢測方法，鑒定兩個豬群有3種基因型：MM、WW和WM型，皺皮香豬的 M等位基因頻率顯著高于普通香豬（Plt;0.05）（表3）。

2.3 結(jié)構(gòu)變異區(qū)域功能元件分析

對結(jié)構(gòu)變異CUL2-I3-sv300區(qū)域進行功能元件分析，檢測到一個tRNA家族的短散在元件（short interspersed nuclear element， SINE），長258 bp；篩選出3個內(nèi)含子剪切抑制子（intronic splicing silencer， ISS）（表4）；預(yù)測CUL2-I3-sv300 可形成環(huán)狀RNA；從結(jié)構(gòu)變異中檢測到4個經(jīng)試驗驗證的RBPs（表5），即：脆性X染色體精神發(fā)育遲緩蛋白（fragile X mental retardation protein， FMRP）、胰島素樣生長因子2 mRNA結(jié)合蛋白2（insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 2， IGF2BP2）、LIN28B蛋白（LIN28B protein）和LIN28A蛋白（LIN28A protein）。缺失型結(jié)構(gòu)變異可能導致這些功能元件和RBPs位點的丟失。

2.4 基因型對CUL2表達量的影響

2.4.1 香豬不同基因型皮膚中的CUL2 mRNA和蛋白的表達

以內(nèi)參基因和目的基因的重組質(zhì)粒倍比稀釋液為模板，證實內(nèi)參基因與目的基因的擴增效率相近，于100%±10%范圍內(nèi)，設(shè)計的引物對可以用于基因定量檢測。采用RT-qPCR和Western blot方法，檢測皺皮MM和WM型、普通皮膚3種基因型CUL2的mRNA和蛋白表達量，得出皺皮的mRNA和蛋白表達量為 MMgt;WM，普通皮膚的mRNA和蛋白水平也呈現(xiàn)出相似的規(guī)律：MMgt;WMgt;WW。同時MM型皺皮的CUL2的mRNA和蛋白表達量較高，分別為MM型普通皮膚的1.06、1.21倍（圖3、圖4）。

2.4.2 不同基因型皮膚中膠原蛋白相關(guān)基因的表達量變化

結(jié)合已有研究，采用STRING軟件篩選CUL2參與膠原蛋白生成的互作網(wǎng)絡(luò)，篩選出可能與CUL2形成互作關(guān)系的蛋白因子7個：CUL2通過HIF-1α調(diào)節(jié)VEGFA、MMP-9的表達，進一步與MMP-1、COL1A1、COL3A1、COL6A3構(gòu)成互作網(wǎng)絡(luò)（圖5）。在此基礎(chǔ)上，采用RT-qPCR檢測皺皮和普通皮膚組織中HIF-1α、VEGFA、MMP-1、MMP-9、COL1A1、COL3A1、COL6A3的mRNA表達，結(jié)果表明皺皮HIF-1α、COL1A1、COL3A1、COL6A3的mRNA表達量為MM型lt;WM型；而VEGFA、MMP-1、MMP-9的mRNA表達量與之相反，MM型gt;WM型；普通皮膚3種基因型中HIF-1α、COL1A1、COL3A1、COL6A3的mRNA表達量最高的是WW型，最低的是MM型；VEGFA、MMP-1、MMP-9表達量趨勢完全相反：MM型gt;WM型gt;WW型。同時比較組間MM型皮膚的表達量，皺皮的MMP-1、MMP-9表達量較高，約為MM型普通皮膚的1.04、1.02倍。皺皮的HIF-1α、VEGFA 、COL1A1、COL3A1、COL6A3的表達量較低，分別為MM型普通皮膚的0.86、0.95、0.85、0.86、0.72倍（圖6）。

3 討 論

采用特異性PCR證實CUL2第3內(nèi)含子中含有缺失型結(jié)構(gòu)變異CUL2-I3-sv300，該結(jié)構(gòu)變異在不同豬種群中表現(xiàn)出豐富的多態(tài)性，皺皮香豬中只檢測到MM和WM 2種基因型，而普通香豬中 3種基因型都有，且皺皮香豬的MM型頻率顯著高于普通香豬。據(jù)生物信息學分析，該結(jié)構(gòu)變異中檢測到一個258 bp的SINE重復(fù)元件、3個ISS和4個RBPs，推測SINE、ISS、RBPs等功能元件的缺失可能促進CUL2表達。研究表明，哺乳動物基因組中分布大量的SINEs，多數(shù)位于基因間隔區(qū)和基因內(nèi)含子中，數(shù)量可達104～106個；多數(shù)SINE的插入對基因是有害的，特別是插入到基因調(diào)控區(qū)的SINEs，可直接影響基因的轉(zhuǎn)錄效率、內(nèi)含子的可變剪切，甚至產(chǎn)生截短肽，影響蛋白的完整性和生理功能^［21-22］，基因Agouti和FSH-β（follicle stimulating hormone beta）內(nèi)含子中插入的SINE可抑制基因的轉(zhuǎn)錄活性，下調(diào)基因的表達^［23-24］。此外，選擇性剪切在調(diào)控真核生物的基因表達和蛋白質(zhì)多樣性方面起重要作用，ISS可能抑制內(nèi)含子的剪切從而抑制轉(zhuǎn)錄過程和蛋白表達^［25-27］，例如脊髓性肌萎縮（spinal muscular atrophy， SMA）由于修飾基因SMN2的內(nèi)含子剪切抑制子發(fā)生選擇性剪切，導致SMN2的mRNA和蛋白表達量降低^［28］。同時已有研究提示RBPs對基因的轉(zhuǎn)錄、內(nèi)含子剪切、mRNA穩(wěn)定性和翻譯等過程有直接的影響，核內(nèi)不均一性核糖核蛋白K（Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein K， HNRNPK）與RBPs結(jié)合直接抑制基因轉(zhuǎn)錄和翻譯過程^［29］。結(jié)構(gòu)變異區(qū)域預(yù)測出4個試驗驗證的RBPs，F(xiàn)MRP結(jié)合CGACUAG位點，IGF2BP2與AACCAUGAGGU結(jié)合，LIN28B和LIN28A與UGGUGUA結(jié)合，均可抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯^［30-32］。推測皺皮香豬MM型皮膚的CUL2缺失了結(jié)構(gòu)變異CUL2-I3-sv300后，促進CUL2的mRNA和蛋白表達，可能與變異區(qū)域上述3類功能元件的丟失以及解除了相應(yīng)的抑制作用有關(guān)。

CUL2是E3泛素連接酶復(fù)合體的組成成分，其羧基端與環(huán)指蛋白1相互作用，N-端與延長蛋白互作，進一步與腫瘤抑制因子VHL（von hippel-lindau）的底物相結(jié)合，形成CUL2-VHL復(fù)合物，促進HIF-1α的泛素化和降解^［33］。當HIF-1α的轉(zhuǎn)錄和翻譯受到抑制時，上調(diào)人基質(zhì)金屬蛋白酶-1（matrix metalloproteinase" MMP-1）的表達。MMP-1可特異性降解人膠原蛋白3A1（collagen type Ⅲ， alpha" COL3A1）和膠原蛋白1A1（collagen type I， alpha" COL1A1）^［34-38］；同時HIF-1α被抑制可下調(diào)人血管生成因子A（vascular endothelial growth factor A， VEGFA）的表達來促進人基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase 9， MMP-9）的轉(zhuǎn)錄翻譯。MMP-9可降解人膠原蛋白6A3（collagen type Ⅵ， alpha 3， COL6A3）^［39-42］。皮膚由表皮、真皮和皮下脂肪組織構(gòu)成，真皮組織中包含維持皮膚結(jié)構(gòu)的膠原蛋白Ⅰ、提供彈性的膠原蛋白Ⅲ和形成微纖維結(jié)構(gòu)的膠原蛋白Ⅵ^［43-45］，這些膠原蛋白共同維持皮膚飽滿充盈且表面平整。此外，細胞外基質(zhì)（extracellular matrix， ECM）主要由膠原蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白和其它糖蛋白組成，很大程度上影響皮膚的完整性和功能，其中膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ和膠原蛋白Ⅵ的降解直接導致皮膚褶皺的形成^［46-48］。

應(yīng)用STRING軟件預(yù)測CUL2可直接調(diào)控HIF-1α、VEGFA，并與兩種基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9、MMP-1互作，后者可特異性地降解COL1A1、COL3A1、COL6A3肽鏈；采用RT-qPCR和Western blot也證明，CUL2的mRNA和蛋白表達量較高的MM型皺皮中，HIF-1α的表達量下降，而MMP-9和MMP-1的表達量增加，提示MM型皺皮中上調(diào)的CUL2抑制了HIF-1α的表達，與Ji等^［43］的研究結(jié)果相近，下調(diào)VEGFA的表達，進而促進MMP-9和MMP-1的表達；同時，在MM型皺皮中的確檢測到COL1A1、COL3A1和COL6A3的表達量下降，可能是CUL2上調(diào)MMP-9和MMP-1的間接效應(yīng)。

4 結(jié) 論

豬群中CUL2基因的結(jié)構(gòu)變異CUL2-I3-sv300表現(xiàn)出豐富的多態(tài)性，皺皮香豬中MM型頻率較高；皺皮CUL2表達量增加的同時抑制了HIF-1α 的表達，從而下調(diào)VEGFA的表達水平，上調(diào)MMP-9和MMP-1的 mRNA表達水平，最終導致3類膠原蛋白COL1A1、COL3A1和COL6A3的mRNA表達量下降，影響真皮層的結(jié)構(gòu)。CUL2基因的結(jié)構(gòu)變異可能是促進皺皮香豬皮膚褶皺較為嚴重的原因。

參考文獻（References）：

［1］ ZHANG S B，DUAN E K.Fighting against skin aging：the way from bench to bedside［J］.Cell Transplant，2018，27（5）：729-738.

［2］ KIM J，LEE S G，LEE J，et al.Oral supplementation of low-molecular-weight collagen peptides reduces skin wrinkles and improves biophysical properties of skin：a randomized，double-blinded，placebo-controlled study［J］.J Med Food，2022，25（12）： 1146-1154.

［3］ ADDOR F A S.Beyond photoaging：additional factors involved in the process of skin aging［J］.Clin Cosmet Investig Dermatol， 2018，11：437-443.

［4］ POON F，KANG S，CHIEN A L.Mechanisms and treatments of photoaging［J］.Photodermatol Photoimmunol Photomed，2015， 31（2）： 65-74.

［5］ GONZALO S，KREIENKAMP R，ASKJAER P.Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome：a premature aging disease caused by LMNA gene mutations［J］.Ageing Res Rev，2017，33：18-29.

［6］ LAW M H，MEDLAND S E，ZHU G，et al.Genome-wide association shows that pigmentation genes play a role in skin aging［J］.J Invest Dermatol，2017，137（9）：1887-1894.

［7］ ABITBOL M，BOSS P，THOMAS A，et al.A deletion in FOXN1 is associated with a syndrome characterized by congenital hypotrichosis and short life expectancy in Birman cats［J］.PLoS One，2015，10（3）：e0120668.

［8］ DUQUE LASIO M L，KOZEL B A.Elastin-driven genetic diseases［J］.Matrix Biol，2018，71-72：144-160.

［9］ 徐婷婷，齊芬芳，黃世會，等.香豬MAP3K4基因結(jié)構(gòu)變異多態(tài)性和基因表達研究［J］.畜牧獸醫(yī)學報，2023，54（12）：5046-5055.

XU T T，QI F F，HUANG S H，et al.Study of the polymorphisms of structural variation and the expression of MAP3K4 gene in Xiang pig［J］.Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2023，54（12）：5046-5055.（in Chinese）

［10］ FLOOD K S，HOUSTON N A，SAVAGE K T，et al.Genetic basis for skin youthfulness［J］.Clin Dermatol，2019，37（4）：312-319.

［11］ CSEKES E，RA ACˇG KOV "L.Skin aging，cellular senescence and natural polyphenols［J］.Int J Mol Sci，202 56（1）：147-158