摘 要： 卵母細(xì)胞的冷凍保存是人類和動(dòng)物輔助生殖中長期儲(chǔ)存遺傳資源的重要策略之一。然而，由于卵母細(xì)胞的表面積/體積比小、細(xì)胞滲透性差，在冷凍過程中極易受到冰晶形成、滲透性休克、氧化應(yīng)激和冷凍保護(hù)劑毒性等損傷，嚴(yán)重降低其解凍后的發(fā)育能力。與其他動(dòng)物相比，豬卵母細(xì)胞中豐富的脂滴含量降低了其低溫耐受性，冷凍保存難度更大。盡管可以從玻璃化未成熟卵母細(xì)胞中獲得活仔豬，但與新鮮卵母細(xì)胞相比，玻璃化冷凍卵母細(xì)胞的發(fā)育能力還有待進(jìn)一步提升。本文主要從玻璃化冷凍豬卵母細(xì)胞的損傷類型、受損機(jī)制、緩解冷凍損傷的策略等方面進(jìn)行綜述，為進(jìn)一步建立和完善豬卵母細(xì)胞玻璃化冷凍保存方案提供參考。

關(guān)鍵詞： 豬；卵母細(xì)胞；玻璃化冷凍；冷凍損傷

中圖分類號：S814.6"""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）01-0036-09

收稿日期：2024-05-28

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021YFD1200301）

作者簡介：孫雅雯（1999-），女，山東泰安人，碩士生，主要從事動(dòng)物繁殖研究，E-mail：sunyw0917@163.com

*通信作者：龐云渭，主要從事動(dòng)物繁殖研究，E-mail：pangyunwei@caas.cn；王 棟，主要從事動(dòng)物繁殖研究，E-mail：dwangcn2002@vip.sina.com

Strategies for Alleviating Cryoinjury of Porcine Vitrified-Oocytes

SUN" Yawen， CHEN" Siying， LI" Kang， LENG" Xuan， WANG" Dong*， PANG" Yunwei*

（Institute of Animal Sciences， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193，" China）

Abstract： "Cryopreservation of oocytes is one of the important strategies for long-term storage of genetic resources in both humans and animal-assisted reproduction. However， due to the low surface-volume ratio and poor cell permeability， oocytes are more susceptible to cryoinjuries during vitrification， including ice crystals formation， osmotic shock， oxidative stress， and cryoprotectants toxicity， which seriously decreases their developmental ability after thawing. In contrast to other animals， porcine oocyte cryopreservation is more challenging owing to its abundant lipid droplets and poor hypothermia tolerance. Although live piglets have been produced from vitrified immature oocytes， the developmental competence of vitrified-oocytes remains to be further promoted compared with fresh oocytes. This paper mainly reviews the injury types， the mechanisms of damage， as well as the alleviating strategies of porcine vitrified-oocytes. It will provide further reference for establishing and improving the vitrification protocol of porcine oocytes.

Key words： porcine; oocytes; vitrification; cryoinjury

*Corresponding authors：" PANG Yunwei， E-mail： pangyunwei@caas.cn;WANG Dong， E-mail： dwangcn2002@vip.sina.com

卵母細(xì)胞冷凍保存技術(shù)是胚胎生物工程的重要組成部分。通過冷凍保存卵母細(xì)胞，不僅可以在不受時(shí)間和空間限制的條件下長期保存珍稀瀕危物種的遺傳資源，還可建立雌性動(dòng)物基因庫，為體外受精、體細(xì)胞核移植、胚胎移植等技術(shù)研究提供豐富的卵母細(xì)胞資源^［1］。隨著低溫生物學(xué)的不斷發(fā)展，卵母細(xì)胞的冷凍損傷機(jī)理不斷被闡明，冷凍保存體系逐步被優(yōu)化，卵母細(xì)胞解凍后發(fā)育能力不斷提高。

與牛、羊等反芻動(dòng)物相比，豬卵母細(xì)胞的脂質(zhì)含量更加豐富，對低溫耐受性更差^［2］。1992年，Rubinsky等^［3］首次采用玻璃化冷凍法冷凍保存豬生發(fā)泡（germinal vesicle，GV）期卵母細(xì)胞，但解凍后卵母細(xì)胞存活率僅為24.5%。在此后的幾十年里，通過對冷凍保護(hù)劑、冷凍載體以及解凍程序的不斷優(yōu)化，豬玻璃化冷凍卵母細(xì)胞解凍后存活率顯著提高，但直到2014年才有玻璃化冷凍卵母細(xì)胞獲得活仔豬的報(bào)道^［4］。目前，豬GV期和第二次減數(shù)分裂中期（metaphase II，MII）卵母細(xì)胞玻璃化冷凍-解凍后存活率可分別達(dá)60%～70%和80%～90%，但與新鮮卵母細(xì)胞相比，玻璃化冷凍GV期（孤雌激活：0.41%～12%；體外受精：0.79%～13.5%）、MII期卵母細(xì)胞（孤雌激活：3.1%～32.5%；體外受精：2%～9.2%）解凍后發(fā)育到囊胚階段的能力依然很低，嚴(yán)重阻礙了該項(xiàng)技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。因此，本文從玻璃化冷凍豬卵母細(xì)胞的損傷類型、受損機(jī)制、緩解冷凍損傷的策略等方面進(jìn)行綜述，為探尋有效的豬卵母細(xì)胞低溫保存方法提供新思路。

1 玻璃化冷凍豬卵母細(xì)胞的損傷類型

卵母細(xì)胞玻璃化冷凍是指將卵母細(xì)胞在含有高濃度冷凍保護(hù)劑的冷凍液中短暫處理，快速置換出卵母細(xì)胞中的水分，迅速將卵母細(xì)胞置于冷凍載體上直接投入液氮的一種超速冷凍方法。相比于程序化冷凍法，玻璃化冷凍法具有降溫速度快、操作簡單、不需尋找最佳冷卻和升溫速率等優(yōu)點(diǎn)^［5-6］。然而，冷凍和解凍過程中的溫度和滲透壓變化、冷凍保護(hù)劑毒性等均會(huì)對卵母細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)、生理生化及分子水平造成損傷（圖1），降低其解凍后發(fā)育能力。

1.1 細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷

卵母細(xì)胞的表面積與體積比較小，細(xì)胞膜滲透性差，在玻璃化冷凍過程中不易充分脫水，造成細(xì)胞皺縮、透明帶破裂脫落、卵周隙增大、線粒體分布異常等不同程度的損傷，降低玻璃化冷凍效率^{［ 7］}。研究發(fā)現(xiàn)，玻璃化冷凍不僅會(huì)造成豬卵丘-卵母細(xì)胞間的微絨毛斷裂或消失，破壞間隙連接，影響卵丘-卵母細(xì)胞間的通訊^［8］，還會(huì)破壞微絲聚合肌動(dòng)蛋白與游離肌動(dòng)蛋白的動(dòng)態(tài)平衡，且在解凍后無法恢復(fù)^［9］。Lpez等^［9］發(fā)現(xiàn)，豬GV期玻璃化冷凍卵母細(xì)胞解凍后進(jìn)行體外受精，早期胚胎肌動(dòng)蛋白微絲正常分布率顯著低于對照組（67% vs. 29%）。多數(shù)經(jīng)玻璃化冷凍保存的豬MII期卵母細(xì)胞，附著于其染色體的紡錘體微管蛋白會(huì)部分或完全分解，導(dǎo)致紡錘體紊亂、著絲粒松動(dòng)、染色體中斷，阻礙減數(shù)分裂后期姐妹染色單體向相反兩極的正確分離，最終導(dǎo)致非整倍體的形成^{［7，10］}。此外，許多研究發(fā)現(xiàn)，豬玻璃化冷凍GV期卵母細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量空泡，有的空泡會(huì)與線粒體形成線粒體-空泡復(fù)合體，造成線粒體嵴模糊，電子密度降低^［10-12］。玻璃化冷凍還會(huì)造成豬GV期卵母細(xì)胞中的大脂滴破碎成許多形狀不規(guī)則的小脂滴，破壞其與線粒體的相互作用^{［10，13］}。

1.2 生理生化損傷

玻璃化冷凍過程中，冷凍保護(hù)劑暴露、滲透應(yīng)激以及氧化代謝增加等過程會(huì)產(chǎn)生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），造成卵母細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化、DNA損傷和蛋白質(zhì)氧化^［14-15］，這是導(dǎo)致玻璃化冷凍卵母細(xì)胞發(fā)育受損的主要因素之一。研究人員發(fā)現(xiàn)，玻璃化冷凍-解凍卵母細(xì)胞谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平降低，H2O2水平增加，表明玻璃化冷凍損害了卵母細(xì)胞的抗氧化防御能力^［16］。冷凍保護(hù)劑暴露會(huì)促使卵母細(xì)胞中大量Ca²⁺從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放到細(xì)胞質(zhì)，沉積于線粒體中，造成線粒體Ca²⁺過載，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔持續(xù)開放，導(dǎo)致線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）下降和ATP耗竭，加劇ROS產(chǎn)生，并伴隨細(xì)胞色素C和促凋亡因子的不斷釋放，最終導(dǎo)致卵母細(xì)胞凋亡。Dai等^［17-19］研究發(fā)現(xiàn)，玻璃化冷凍豬卵母細(xì)胞解凍后，線粒體膜電位和ATP含量降低，ROS水平升高，細(xì)胞凋亡相關(guān)基因caspase 3、caspase 8、caspase 9和pan caspase表達(dá)異常。過量ROS還會(huì)破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的氧化還原穩(wěn)態(tài)，增加蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊率，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激^［20-21］。最新研究報(bào)道，玻璃化冷凍顯著下調(diào)豬卵母細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工相關(guān)因子EDEM2、BAG1、CALR的表達(dá)，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能異常^［21］。而通過在體外成熟過程中添加抗氧化劑或與新鮮卵母細(xì)胞共培養(yǎng)，可部分恢復(fù)玻璃化冷凍對卵母細(xì)胞造成的非致死性損傷^［22-23］。

1.3 分子水平損傷

卵母細(xì)胞的表觀修飾水平和轉(zhuǎn)錄組譜對玻璃化冷凍誘導(dǎo)的應(yīng)激非常敏感。有證據(jù)表明，玻璃化冷凍-解凍過程會(huì)造成卵母細(xì)胞DNA甲基化和組蛋白修飾水平異常，損害解凍后卵母細(xì)胞的發(fā)育能力^［24-25］。Cheng等^［26］研究發(fā)現(xiàn)，玻璃化冷凍降低了卵母細(xì)胞DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）表達(dá)，破壞了囊胚印跡基因H19、Peg3和Snrpn的DNA甲基化修飾，導(dǎo)致基因組穩(wěn)定性受損，最終誘發(fā)細(xì)胞死亡。與新鮮組卵母細(xì)胞相比，玻璃化冷凍卵母細(xì)胞的整體甲基化水平和表觀遺傳重編程基因DNMT1、DNMT3B、HDAC1和SUV39H1的mRNA水平均顯著下調(diào)^［27-28］。玻璃化冷凍還會(huì)改變豬卵母細(xì)胞的H4乙酰化和H3K9甲基化水平，降低其發(fā)育能力^［29］。Chen等^［30］研究發(fā)現(xiàn)，玻璃化冷凍卵母細(xì)胞和早期卵裂胚胎的H3K9me3修飾水平顯著低于對照組，但H3K9的乙酰化水平在早期卵裂胚胎中顯著升高，并且印跡基因PEG10、XIST和KCNQ1O1T在囊胚中的表達(dá)上調(diào)，這些表觀修飾異?？赡苁遣ＡЩ鋬雎涯讣?xì)胞發(fā)育能力受損的重要標(biāo)志^［31］。

玻璃化冷凍造成的卵母細(xì)胞損傷還與基因表達(dá)異常有關(guān)。Jia等^［32］對豬玻璃化冷凍-解凍GV期卵母細(xì)胞及其周圍卵丘細(xì)胞進(jìn)行RNA測序分析，發(fā)現(xiàn)玻璃化冷凍顯著降低了調(diào)控Wnt和MAPK信號通路的WIPI2基因的表達(dá)，這可能是冷凍引起卵母細(xì)胞質(zhì)量受損的因素之一。此外，玻璃化冷凍還降低了卵母細(xì)胞中參與早期胚胎發(fā)育的Mater基因、參與微管結(jié)構(gòu)定位的Hook1基因和紡錘體組裝檢查點(diǎn)相關(guān)基因Mps1和Mad1等的表達(dá)^［33］。

2 玻璃化冷凍豬卵母細(xì)胞的受損機(jī)制

玻璃化冷凍卵母細(xì)胞的損傷機(jī)制主要有以下幾種（圖1）：1）高濃度冷凍保護(hù)劑引起細(xì)胞脫水導(dǎo)致的滲透損傷，即通常所說“溶液效應(yīng)”^［34］。在玻璃化冷凍過程中，高濃度的冷凍保護(hù)劑使卵母細(xì)胞內(nèi)外形成極大的滲透壓差，導(dǎo)致水分急速從細(xì)胞內(nèi)流出，引起胞質(zhì)溶液濃度上升，細(xì)胞發(fā)生皺縮。當(dāng)滲透速率過快時(shí)，卵母細(xì)胞發(fā)生滲透性休克^［35-36］。這一過程引起卵母細(xì)胞透明帶和膜蛋白變性，膜的通透性改變，細(xì)胞蛋白合成能力受損^［37］。Rusciano等^［38］研究表明，玻璃化冷凍會(huì)改變卵母細(xì)胞透明帶中脂質(zhì)、碳水化合物和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)從α-螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊形式，造成透明帶硬化，精子穿透能力下降，降低卵母細(xì)胞的發(fā)育能力。2）冰晶損傷，包括降溫過程中的冰晶損傷以及解凍過程中的冰晶重結(jié)晶損傷。在低溫條件下或冷卻速率過快時(shí)，細(xì)胞內(nèi)水分與細(xì)胞外冷凍保護(hù)劑無法充分置換，細(xì)胞內(nèi)水分不可避免地轉(zhuǎn)化為冰晶，冰晶形成的尖銳邊緣和生長過程中熱力學(xué)變化均會(huì)損傷卵母細(xì)胞的細(xì)胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等超微結(jié)構(gòu)，對細(xì)胞造成機(jī)械損傷^［36］。而在解凍過程中，溫度升高使細(xì)胞內(nèi)冰晶發(fā)生重結(jié)晶，即小冰晶融合為大冰晶，冰晶的進(jìn)一步生長會(huì)加劇水分流失，促進(jìn)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化，對細(xì)胞造成致命損傷^［39］。

豬卵母細(xì)胞因豐富的甘油三酯儲(chǔ)備，脂肪酸含量較牛、羊等反芻動(dòng)物更高，這種物種特異性使其對低溫更敏感，在玻璃化冷凍后更易遭受低溫?fù)p傷^［40］。低溫?fù)p傷是一種不可逆的損傷，主要發(fā)生在卵母細(xì)胞冷凍過程中的脂質(zhì)相變溫度下。豬GV期卵母細(xì)胞質(zhì)膜相變溫度為13～20 ℃，而MII期卵母細(xì)胞為10 ℃左右^［41］。在此溫度下，脂質(zhì)從液晶相轉(zhuǎn)變?yōu)槟z相，膜的正常功能受到影響，玻璃化冷凍效率顯著降低。

3 豬卵母細(xì)胞冷凍損傷的緩解策略

3.1 增強(qiáng)滲透調(diào)節(jié)策略

在低溫脅迫下，自然界中許多生物自身會(huì)分泌產(chǎn)生一些能被機(jī)體利用的小分子物質(zhì)，它們無毒且具有良好的生物相容性，通過平衡細(xì)胞內(nèi)外滲透壓，為機(jī)體提供冷凍保護(hù)^［42］。采用高效無毒、高滲透性和強(qiáng)抑制冰晶能力的新型冷凍保護(hù)劑，降低傳統(tǒng)冷凍保護(hù)劑的化學(xué)毒性，為提高卵母細(xì)胞玻璃化冷凍效率提供了新思路。

研究發(fā)現(xiàn)，甘氨酸和L-肉堿等都是理想的滲透性冷凍保護(hù)劑，能保護(hù)細(xì)胞膜完整性和穩(wěn)定亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)^［43-44］。甘氨酸是一種天然氨基酸，無毒且具有良好的滲透能力，在卵母細(xì)胞內(nèi)可通過特定的運(yùn)輸系統(tǒng)被吸收，防止細(xì)胞的滲透損傷和毒性損傷^［45］。Tang等^［43］在玻璃化冷凍液、解凍液和體外成熟液中分別添加6 mmol·L^-1甘氨酸，發(fā)現(xiàn)解凍后卵母細(xì)胞存活率和成熟率提高，早期凋亡率降低，皮質(zhì)顆粒和線粒體正常分布比例升高，ATP含量增加。在高滲環(huán)境下，L-肉堿通過主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)細(xì)胞體積，維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)態(tài)^［44］，也可作為滲透性冷凍保護(hù)劑，降低細(xì)胞的滲透損傷。細(xì)胞松弛素B是一種細(xì)胞滲透性肌動(dòng)蛋白聚合抑制劑，采用7.5 μg·L^-1細(xì)胞松弛素B預(yù)處理豬GV期卵母細(xì)胞30 min，可降低玻璃化冷凍引起的卵母細(xì)胞的細(xì)胞骨架異常分布比例，促進(jìn)皮質(zhì)顆粒-微絲遷移，解凍后卵母細(xì)胞存活率、成熟率和孤雌激活囊胚率顯著提高^［46］。水通道蛋白（aquaporin，AQP）是冷凍卵母細(xì)胞時(shí)胞內(nèi)水和胞外冷凍保護(hù)劑發(fā)生置換的關(guān)鍵蛋白，通過在豬卵母細(xì)胞中外源表達(dá)編碼人AQP3或斑馬魚Aqp3b-T85A突變體蛋白，卵母細(xì)胞對乙二醇的滲透性分別比對照組提高6.7倍和12倍，表明在豬卵母細(xì)胞中外源表達(dá)AQP3可能是減少玻璃化過程中冷凍保護(hù)劑誘導(dǎo)的滲透應(yīng)激的有用策略^［47］。

3.2 抑制冰晶形成策略

受自然界耐寒生物抗凍機(jī)制的啟發(fā)，一些新型仿生控冰材料的開發(fā)和應(yīng)用為建立高效卵母細(xì)胞冷凍保存策略提供了新思路?？箖龅鞍祝╝ntifreeze protein，AFP）是一類可抑制冰晶生長的蛋白質(zhì)，不僅能有效抑制冰晶的形成、生長和重結(jié)晶，還能降低溶液冰點(diǎn)，維持細(xì)胞膜穩(wěn)定^［48］。采用含500 ng·mL^-1 AFP Ⅲ的玻璃化冷凍液冷凍保存豬GV期卵母細(xì)胞，解凍后卵母細(xì)胞ROS水平降低，DNA損傷減輕，體外發(fā)育能力明顯改善^［49］。人造冰阻滯劑Supercool X-1000和羧化聚L-賴氨酸均具有類似抗凍蛋白的活性，可有效降低凍融過程中的冰晶重結(jié)晶，與傳統(tǒng)冷凍保護(hù)劑聯(lián)合應(yīng)用均能顯著提高解凍后卵母細(xì)胞的存活和發(fā)育能力^［50-52］。納米顆粒不僅可以改變保護(hù)液黏度，還能降低冰晶形成面積，采用添加0.05% 納米顆粒的玻璃化冷凍液冷凍保存豬GV期卵母細(xì)胞，解凍后卵母細(xì)胞存活率顯著提高^［53］。

此外，冰晶的形成和生長與冰晶成核溫度密切相關(guān)，控制冰晶成核也能有效降低冰晶損傷^［34］。結(jié)晶膽固醇是一種化學(xué)冰成核劑，冷凍液中添加結(jié)晶膽固醇可顯著升高溶液成核溫度，提高細(xì)胞解凍后存活率，增強(qiáng)細(xì)胞的蛋白合成與代謝能力^［54］。

3.3 促進(jìn)脂質(zhì)重塑策略

脂質(zhì)重塑是指生物體內(nèi)脂質(zhì)的種類、數(shù)量和分布在不同生理狀態(tài)下發(fā)生的改變，這些變化會(huì)影響細(xì)胞的生理功能。豬卵母細(xì)胞含有大量的脂滴，在玻璃化冷凍過程中更易發(fā)生脂質(zhì)相變，導(dǎo)致細(xì)胞膜流動(dòng)性降低、通透性變差，且在解凍后無法恢復(fù)^{［13，55］}。研究發(fā)現(xiàn)，通過增加不飽和脂質(zhì)或脂肪酸的含量和比例，縮短脂肪酸鏈長度等脂質(zhì)重塑策略，可以在低溫下維持細(xì)胞膜流動(dòng)性，增強(qiáng)細(xì)胞的抗凍能力^［56-57］。與新鮮卵母細(xì)胞相比，玻璃化冷凍卵母細(xì)胞中特異性磷脂水平顯著下調(diào)，而在玻璃化液中補(bǔ)充聚乙二醇8000（polyethylene glycol 8000，PEG 8000）可增加卵母細(xì)胞的磷脂和鞘脂含量，表明PEG 8000可作為膜穩(wěn)定劑用于卵母細(xì)胞的冷凍保存^［58］。Aardema等^［59］比較了不飽和油酸或飽和硬脂酸與胚胎共孵育的玻璃化冷凍效果，發(fā)現(xiàn)與不飽和油酸共孵育的胚胎存活率和脂滴含量顯著提高。甲基-β-環(huán)糊精能有效調(diào)節(jié)細(xì)胞膜膽固醇含量，在冷凍前將豬GV期卵母細(xì)胞與5 mg·mL^-1的膽固醇-甲基-β-環(huán)糊精共孵育1 h，卵母細(xì)胞線粒體和透明帶的損傷程度降低，解凍后存活率和成熟率顯著提高^［60］。以上研究表明，通過脂質(zhì)重塑穩(wěn)定膜組成，改善膜流動(dòng)性，對增強(qiáng)卵母細(xì)胞的低溫耐受性具有重要意義。

此外，在豬卵母細(xì)胞體外成熟液中添加毛喉素、L-肉堿、小檗堿等脂質(zhì)調(diào)節(jié)劑，能有效降低卵母細(xì)胞脂質(zhì)含量，提高卵母細(xì)胞的低溫耐受性，卵母細(xì)胞解凍后存活率和發(fā)育率、抗應(yīng)激能力以及線粒體活性等均得到改善^［61-64］。

3.4 降低氧化損傷策略

目前，白藜蘆醇、褪黑素、α-生育酚、蝦青素等外源性抗氧化劑被廣泛用于卵母細(xì)胞玻璃化冷凍保存，通過直接或間接清除ROS來降低卵母細(xì)胞的氧化損傷^{［23，65-68］}。

多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，體外成熟液中添加白藜蘆醇顯著提高了豬玻璃化冷凍GV期卵母細(xì)胞解凍后的存活率、成熟率及早期胚胎發(fā)育率，且能增強(qiáng)卵母細(xì)胞線粒體的生物合成能力^{［23，65］}。在玻璃化冷凍液、解凍液和體外成熟液中分別添加2.5 μmol·L^-1蝦青素，解凍后卵母細(xì)胞存活率、孤雌激活和體細(xì)胞核移植囊胚發(fā)育率顯著提高^［68］。在豬玻璃化冷凍MII期卵母細(xì)胞解凍后的孵育液中添加線粒體靶向抗氧化劑Mito Q^［66］、α-生育酚^［67］或凋亡抑制劑Z-VAD-FMK^［69］，不僅能提高解凍后卵母細(xì)胞的發(fā)育能力，還能增強(qiáng)卵母細(xì)胞線粒體自噬能力，維持線粒體穩(wěn)態(tài)，降低早期凋亡細(xì)胞比例。此外，聯(lián)合應(yīng)用甘氨酸和褪黑素能同時(shí)減輕玻璃化冷凍和解凍引起的豬GV期卵母細(xì)胞的滲透和氧化應(yīng)激，進(jìn)一步增強(qiáng)其解凍后的發(fā)育能力^［43］。

3.5 工程化策略

玻璃化冷凍前的預(yù)處理時(shí)長、冷凍-解凍過程中冷凍保護(hù)劑的添加和脫除等均會(huì)對卵母細(xì)胞造成不可逆的損傷，影響其后續(xù)發(fā)育能力^{［34，36］}。各種先進(jìn)的工程化策略的蓬勃發(fā)展為抑制冰晶形成、提高冷凍保存效率提供了新的途徑。微流體技術(shù)是利用微米級的微通道精確控制和操縱亞微米結(jié)構(gòu)流體的技術(shù)，采用微流體裝置實(shí)現(xiàn)冷凍保護(hù)劑的添加和脫除，可大幅提高豬MII期卵母細(xì)胞玻璃化冷凍效率^［70-71］。還有研究發(fā)現(xiàn)，將微流控裝置與Cryotop載體搭配，可進(jìn)一步提升卵母細(xì)胞的冷凍保存效果，有效減少卵母細(xì)胞的早期凋亡率和胞內(nèi)ROS水平，降低線粒體損傷，提高卵母細(xì)胞的凍后質(zhì)量^［72］。

受食品加工應(yīng)用中高靜水壓（high hydrostatic pressure，HHP）技術(shù)的啟發(fā)，在體外環(huán)境下，采用亞致死劑量的HHP處理配子和胚胎以提高其存活能力，增強(qiáng)應(yīng)激耐受性，為哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織的冷凍保存提供了一種全新的技術(shù)策略^［73］。Du等^［74］用20 Mpa的HHP對豬MII期卵母細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，恢復(fù)130 min后對卵母細(xì)胞進(jìn)行玻璃化冷凍，發(fā)現(xiàn)HHP處理顯著提高了解凍后卵母細(xì)胞的孤雌發(fā)育能力。

各種緩解玻璃化冷凍卵母細(xì)胞損傷策略的優(yōu)、缺點(diǎn)如表1所示。

4 總結(jié)與展望

豬卵母細(xì)胞的玻璃化冷凍保存技術(shù)在過去幾十年取得了重要進(jìn)展，但由于豬卵母細(xì)胞對低溫極其敏感，目前尚未建立完善的冷凍保存方案。隨著拉曼光譜、透射電鏡以及蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、單細(xì)胞組學(xué)等新技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，深入解析豬卵母細(xì)胞的冷凍損傷機(jī)制，尋找損傷靶點(diǎn)，能夠?yàn)檫M(jìn)一步開發(fā)豬卵母細(xì)胞冷凍保存技術(shù)提供理論依據(jù)。此外，采用具有良好生物相容性的高效仿生控冰材料替代傳統(tǒng)冷凍保護(hù)劑，并結(jié)合新型工程化策略，如微流體技術(shù)、納米級冷凍保護(hù)劑封裝技術(shù)、胞內(nèi)冷凍保護(hù)劑遞送技術(shù)等，降低冷凍過程中的冰晶損傷和滲透應(yīng)激，對建立完善高效的豬卵母細(xì)胞玻璃化冷凍保存體系具有重要意義。

參考文獻(xiàn)（References）：

［1］ SOMFAI T.Vitrification of immature oocytes in pigs［J］.Anim Sci J，2024，95（1）：e13943.

［2］ MCEVOY T G，COULL G D，BROADBENT P J，et al.Fatty acid composition of lipids in immature cattle，pig and sheep oocytes with intact zona pellucida［J］.J Reprod Fertil，2000，118（1）：163-170.

［3］ RUBINSKY B，ARAV A，DEVRIES A L.The cryoprotective effect of antifreeze glycopeptides from Antarctic fishes［J］. Cryobiology， 1992，29（1）：69-79.

［4］ SOMFAI T，YOSHIOKA K，TANIHARA F，et al.Generation of live piglets from cryopreserved oocytes for the first time using a defined system for in vitro embryo production［J］.PLoS One，2014，9（5）：e97731.

［5］ AMINI M，BENSON J D.Technologies for vitrification based cryopreservation［J］.Bioengineering （Basel），2023，10（5）：508.

［6］ ZHU Y X，LIU H Y，ZHENG L，et al.Vitrification of mammalian oocytes：recent studies on mitochondrial dysfunction［J］. Biopreserv Biobank，2024，22（5）：428-440.

［7］ LIU R H，SUN Q Y，LI Y H，et al.Effects of cooling on meiotic spindle structure and chromosome alignment within in vitro matured porcine oocytes［J］.Mol Reprod Dev，2003，65（2）：212-218.

［8］ CASILLAS F，DUCOLOMB Y，LPEZ A，et al.Effect of porcine immature oocyte vitrification on oocyte-cumulus cell gap junctional intercellular communication［J］.Porcine Health Manag，2020，6（1）：37.

［9］ LPEZ A，DUCOLOMB Y，CASAS E，et al.Effects of porcine immature oocyte vitrification on actin microfilament distribution and chromatin integrity during early embryo development in vitro［J］.Front Cell Dev Biol，202 9：636765.

［10］ WU C H，RUI R，DAI J J，et al.Effects of cryopreservation on the developmental competence，ultrastructure and cytoskeletal structure of porcine oocytes［J］.Mol Reprod Dev，2006，73（11）：1454-1462.

［11］ 周 悅，盧俊求，吳亞輝，等.玻璃化冷凍對豬GV期卵母細(xì)胞成熟及發(fā)育能力的影響［J］.中國畜牧雜志，2015，51（5）：29-33.

ZHOU Y，LU J Q，WU Y H，et al.Effects of vitrification on in vitro development ability of porcine oocytes at GV stage［J］.Chinese Journal of Animal Science，2015，51（5）：29-33.（in Chinese）

［12］ 張超凡，薛玉環(huán)，左芙蓉，等.玻璃化冷凍對小鼠卵母細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響［J］.畜牧與獸醫(yī)，2017，49（6）：72-76.

ZHANG C F，XUE Y H，ZUO F R，et al.Effects of vitrification on ultrastructure of mouse oocytes［J］.Animal Husbandry amp; Veterinary Medicine，2017，49（6）：72-76.（in Chinese）

［13］ OKOTRUB K A，OMELCHENKO A N，CHUYKO E A，et al.Irreversible lipid phase transition detected in a porcine oocyte at chilling［J］.Cryobiology，2024，114：104850.

［14］ MA Y M，GAO L，TIAN Y Q，et al.Advanced biomaterials in cell preservation：hypothermic preservation and cryopreservation［J］. Acta Biomater，202 131：97-116.

［15］ SOMFAI T，HARAGUCHI S，DANG-NGUYEN T Q，et al.Vitrification of porcine immature oocytes and zygotes results in different levels of DNA damage which reflects developmental competence to the blastocyst stage［J］.PLoS One，2023， 18（3）：e0282959.

［16］ MATEO-OTERO Y，YESTE M，DAMATO A，et al.Cryopreservation and oxidative stress in porcine oocytes［J］.Res Vet Sci，202 135：20-26.

［17］ DAI J J，WU C F，MUNERI C W，et al.Changes in mitochondrial function in porcine vitrified MII-stage oocytes and their impacts on apoptosis and developmental ability［J］.Cryobiology，2015，71（2）：291-298.

［18］ DAI J J，NIU Y F，WU C F，et al.Both death receptor and mitochondria mediated apoptotic pathways participated the occurrence of apoptosis in porcine vitrified MII stage oocytes［J］.Cryo Letters，2016，37（2）：129-136.

［19］ DAI J J，YANG J H，ZHANG S S，et al.Partial recovery of mitochondrial function of vitrified porcine MII stage oocytes during post-thaw incubation［J］.Cryo Letters，2018，39（1）：39-44.

［20］ CAO B J，QIN J P，PAN B，et al.Oxidative stress and oocyte cryopreservation：recent advances in mitigation strategies involving antioxidants［J］.Cells，2022，11（22）：3573.

［21］ JIA B Y，XIANG D C，YANG H，et al.Transcriptome analysis of porcine embryos derived from oocytes vitrified at the germinal vesicle stage［J］.Theriogenology，2024，218：99-110.

［22］ JIA B Y，XIANG D C，ZHANG B，et al.Quality of vitrified porcine immature oocytes is improved by coculture with fresh oocytes during in vitro maturation［J］.Mol Reprod Dev，2019，86（11）：1615-1627.

［23］ ITO J，SHIRASUNA K，KUWAYAMA T，et al.Resveratrol treatment increases mitochondrial biogenesis and improves viability of porcine germinal-vesicle stage vitrified-warmed oocytes［J］.Cryobiology，2020，93：37-43.

［24］ SCIORIO R，CAMPOS G，TRAMONTANO L，et al.Exploring the effect of cryopreservation in assisted reproductive technology and potential epigenetic risk［J］.Zygote，2023，31（5）：420-432.

［25］ SCIORIO R，MANNA C，F(xiàn)AUQUE P，et al.Can cryopreservation in assisted reproductive technology （ART） induce epigenetic changes to gametes and embryos？［J］.J Clin Med，2023，12（13）：4444.

［26］ CHENG K R，F(xiàn)U X W，ZHANG R N，et al.Effect of oocyte vitrification on deoxyribonucleic acid methylation of H19，Peg3，and Snrpn differentially methylated regions in mouse blastocysts［J］.Fertil Steril，2014，102（4）：1183-1190.e3.

［27］ MOULAVI F，SAADELDIN I M，SWELUM A A，et al.Oocyte vitrification induces loss of DNA methylation and histone acetylation in the resulting embryos derived using ICSI in dromedary camel［J］.Zygote，202 56（1）：45-62