摘 要： 羊毛是重要的畜牧產(chǎn)品，由毛囊發(fā)育而來。毛囊是皮膚組織衍生的微器官，由毛囊干細胞、毛乳頭、毛母質(zhì)、外根鞘和內(nèi)根鞘等20多種細胞組成，結(jié)構(gòu)及細胞間通訊復(fù)雜。因此，提高羊毛產(chǎn)量和品質(zhì)的前提是充分了解各種細胞相互作用下的毛囊發(fā)育特征。目前，細胞培養(yǎng)技術(shù)主要分為2D細胞培養(yǎng)和3D細胞培養(yǎng)。傳統(tǒng)的2D細胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)毛囊相關(guān)細胞時，與體內(nèi)生長狀況差距較大，毛發(fā)誘導(dǎo)能力逐漸喪失。3D細胞培養(yǎng)是將細胞在模擬組織和器官特異性的3D結(jié)構(gòu)中進行培養(yǎng)，通過模擬天然環(huán)境，允許細胞聚集成為一定的形態(tài)，并且促進細胞-細胞的交流、細胞-細胞外基質(zhì)的交流，從而恢復(fù)一定的在體功能，彌補了傳統(tǒng)2D細胞培養(yǎng)的缺陷。本文簡單介紹了3D細胞培養(yǎng)模型及種類、構(gòu)建方法及在毛囊發(fā)育和生命科學(xué)相關(guān)研究中的應(yīng)用，并展望了3D細胞培養(yǎng)技術(shù)在毛囊發(fā)育研究和其它領(lǐng)域的發(fā)展前景。

關(guān)鍵詞： 3D細胞培養(yǎng)；毛囊；細胞外基質(zhì)

中圖分類號：S852.2"""" 文獻標(biāo)志碼：A""""" 文章編號： 0366-6964（2025）01-0015-11

收稿日期：2024-06-24

基金項目：國家自然科學(xué)基金（022304370026）

作者簡介：孔 辰（1999-），男，河南周口人，碩士，主要從事動物遺傳與育種研究，E-mail：15836923037@163.com

*通信作者：蔡 蓓，主要從事羊的遺傳育種及毛囊發(fā)育生物學(xué)研究，E-mail：caibei1115@163.com

3D Cell Culture Technology and Its Application in Wool Follicle Development Study

KONG" Chen， TIAN" Yun， GAO" Hongrui， CAI" Bei*

（Key Laboratory of Ruminant Molecular and Cellular Breeding of Ningxia Hui Autonomous Region， College

of Animal Science and Technology， Ningxia University， Yinchuan 75002 China）

Abstract： "Wool is an important livestock product that develops from wool follicles. wool follicles is a micro-organ derived from the skin tissue， which consists of more than 20 types of cells， including hair follicle stem cells， dermal papillae， hair matrices， outer root sheaths and inner heel sheaths， with complex structure and intercellular communication.

Therefore， in order to improve wool yield and quality， comprehensive understanding of the developmental characteristics of hair follicles under various cell interactions was needed in advance.

Currently， cell culture techniques are mainly categorized into 2D cell culture and 3D cell culture. Conventional 2D cell culture techniques for culturing wool follicle-associated cells are characterized by a large gap with in vivo growth conditions and a gradual loss of hair-inducing ability. 3D cell culture is the cultivation of cells in 3D structures that mimic the specificity of tissues and organs. By mimicking the natural environment， it allows cells to aggregate into a certain morphology and facilitates cell-cell communication， as well as cell-extracellular matrix communication， thus restoring a certain in vivo function， which makes up for the shortcomings of traditional 2D cell culture. This paper briefly introduces 3D cell culture models and types， construction methods， applications in various cell and wool follicle development studies， and looks forward to the development of 3D cell culture technology in hair follicle development studies and other fields.

Key words： 3D cell culture; wool follicles; extracellular matrix

*Corresponding author：" CAI Bei，E-mail：caibei1115@163.com

羊毛是羊養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中的重要經(jīng)濟產(chǎn)品，其發(fā)源于皮膚組織衍生的微器官——毛囊。毛囊是由上皮和間充質(zhì)細胞相互作用形成的微器官，包含多種細胞種類和活性成分，具有復(fù)雜、精細的結(jié)構(gòu)^［1］。目前，毛囊發(fā)育研究中常采用普通的2D技術(shù)培養(yǎng)毛囊相關(guān)細胞。在傳統(tǒng)2D培養(yǎng)中，毛囊相關(guān)細胞僅在單層細胞培養(yǎng)物表面生長，由于細胞承受了高度不自然的幾何和機械約束，其轉(zhuǎn)錄表達譜因受環(huán)境干擾而發(fā)生顯著改變，喪失誘導(dǎo)能力^［2］。與之相比，在三維層面培養(yǎng)細胞（three dimensional cell culture，3D），為細胞創(chuàng)造了類似于體內(nèi)的微環(huán)境，使其恢復(fù)自然情況下的部分特征^［2］。例如，在3D條件下培養(yǎng)的毛乳頭細胞（dermal papilla cells，DPCs），其完整的真皮轉(zhuǎn)錄組特征得到部分恢復(fù)，表現(xiàn)出自然條件下皮膚誘導(dǎo)毛囊發(fā)生的能力^［3］。因此，在毛囊形態(tài)發(fā)生發(fā)育研究中使用3D細胞培養(yǎng)技術(shù)，能夠促進各種細胞的相互作用及信號分子的調(diào)控機制，進而揭示羊毛發(fā)育生長的機理，調(diào)控羊毛的生長發(fā)育。本文介紹了3D培養(yǎng)技術(shù)，概述了3D培養(yǎng)技術(shù)在研究毛囊形態(tài)發(fā)生和周期生長中的應(yīng)用概況，為3D細胞培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于毛囊生長發(fā)育研究提供依據(jù)。

1 3D細胞培養(yǎng)模型研究進展

3D細胞培養(yǎng)被定義為在具有模擬組織和器官特異性的3D結(jié)構(gòu)中培養(yǎng)細胞^［4］，允許細胞在三維空間生長并與周圍的細胞環(huán)境相互作用。該技術(shù)的開發(fā)彌補了2D培養(yǎng)技術(shù)中細胞與細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）難以互作的缺陷。

1.1 3D細胞培養(yǎng)模型

3D細胞培養(yǎng)技術(shù)開發(fā)和應(yīng)用的一個重要的基礎(chǔ)是ECM^［5］。ECM主要是由各種細胞外分泌蛋白（如膠原蛋白、彈性蛋白、層黏連蛋白和糖胺聚糖等）以及細胞結(jié)合因子（如CD44和整合素等）組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)^［6］，其不僅為細胞的生長提供重要的結(jié)構(gòu)支撐，并且參與調(diào)控許多細胞的生長過程，通過協(xié)調(diào)細胞的生長、存活、遷移、分化、穩(wěn)態(tài)、黏附從而指導(dǎo)組織的形態(tài)發(fā)生^［7-9］。Berger等^［10］構(gòu)建了用于研究體內(nèi)腫瘤微環(huán)境的高通量微流控3D仿生系統(tǒng)，利用海藻酸鹽或海藻酸鹽-海藻酸鹽硫酸鹽水凝膠作為ECM模擬物，為乳腺腫瘤細胞提供類似于體內(nèi)的腫瘤微環(huán)境，成功模擬體內(nèi)環(huán)境，形成了大型乳腺腫瘤細胞來源的囊泡。3D細胞培養(yǎng)技術(shù)通過體外重建ECM，為組織細胞模擬體內(nèi)環(huán)境，從而誘導(dǎo)細胞形成類似于體內(nèi)組織結(jié)構(gòu)的3D組織。

3D細胞培養(yǎng)技術(shù)允許細胞復(fù)雜形態(tài)的發(fā)展，因此基因表達情況更接近體內(nèi)^［11］，且具有組織特異性^［12］，能更真實的代表體內(nèi)組織，從而獲得與體內(nèi)相關(guān)的生理數(shù)據(jù)。3D細胞培養(yǎng)與2D的差異主要體現(xiàn)在細胞形態(tài)、遷移以及基因表達（表1）。間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）是一種體細胞，來源于骨髓、臍帶、脂肪等組織，具有巨大的細胞治療潛力^［13］，但其分裂次數(shù)有限，一旦達到最大分裂次數(shù)，就會經(jīng)歷復(fù)制性衰老，導(dǎo)致細胞凋亡^［14］。Krasnova等^［15］利用懸滴法構(gòu)建了3D-MSC球體，衰老的MSC通過3D培養(yǎng)后失去衰老標(biāo)志物，具有早期MSC表型。Hasan等^［16］利用聚二甲基硅氧烷創(chuàng)建了包含神經(jīng)元自組裝層的3D培養(yǎng)物，這種3D結(jié)構(gòu)具有自發(fā)的神經(jīng)活動，類似于發(fā)育皮層中的活動，且與2D培養(yǎng)物相比，3D培養(yǎng)物對藥物的反應(yīng)更接近體內(nèi)數(shù)據(jù)。因此，3D培養(yǎng)技術(shù)作為體內(nèi)和體外連接的橋梁，具有強大的優(yōu)勢，既可在體外模擬體內(nèi)微環(huán)境，還能直接觀測細胞的生長狀態(tài)，為揭示細胞發(fā)育成組織和器官的分子機制提供一定的研究方法。

1.2 3D培養(yǎng)模型的類型及構(gòu)建方法

各類細胞在體內(nèi)所處的環(huán)境存在差異性，細胞周圍的ECM成分各不相同，目前沒有單一的3D培養(yǎng)技術(shù)可滿足所有的細胞培養(yǎng)需求。因此，每一種細胞進行3D培養(yǎng)均需根據(jù)細胞的理化性質(zhì)、ECM的組分、滿足細胞生存的生物支架材料和反應(yīng)器構(gòu)建最適宜的3D培養(yǎng)系統(tǒng)。目前，3D培養(yǎng)模型主要可以分為兩類，一類是基于支架或基質(zhì)材料構(gòu)建的有支架3D培養(yǎng)模型，另一類是無支架3D培養(yǎng)模型。

1.2.1 有支架的3D培養(yǎng)模型

基于支架技術(shù)的3D培養(yǎng)是利用天然或人工合成的聚合物模擬各種體內(nèi)ECM環(huán)境條件使細胞生長和增殖^［17］，其培養(yǎng)模式如圖1。這些支架對化學(xué)成分、孔隙度、機械特性有一定的要求，允許細胞存在異質(zhì)性^［18］，有利于細胞-細胞、細胞-ECM的交流^［19］，促進細胞增殖、遷移、分化、黏附，在體外形成類似于體內(nèi)結(jié)構(gòu)和功能的球狀體或類器官^［20］。天然的支架材料包括海藻酸鹽^［21］、瓊脂^［22］、明膠^［23］、層黏連蛋白^［24］、膠原蛋白^［25］、絲素蛋白^［26］等，這類材料與細胞的生物相容性好，通過提供體內(nèi)基質(zhì)分泌更多的生長因子和信號分子調(diào)節(jié)細胞行為^［27］。Long等^［28］利用海藻酸鹽和殼聚糖與大鼠肝細胞BRL-3A制備微膠囊細胞，以絲素蛋白凝膠作為支架材料形成凝膠-細胞微膠囊復(fù)合物，這種復(fù)合物在微重力環(huán)境培養(yǎng)下可增強細胞增殖，在組織構(gòu)建領(lǐng)域具有一定的潛力。Hu等^［29］利用基質(zhì)膠（Matrix Gel，MG）作為支架材料構(gòu)建了小鼠原代肝細胞長期3D類器官培養(yǎng)系統(tǒng)，該類器官可以從單個肝細胞建立，保留了關(guān)鍵功能、形態(tài)和基因表達特征。

天然的支架材料生物相容性雖然優(yōu)異，但存在一些局限性，如批次之間存在差異致使純度不一樣，可重復(fù)性差，且可能攜帶病原體，滅菌困難等。因此，研究人員開發(fā)出了熱解碳^［30］、聚乙烯醇^［31］、羥基磷灰石^［32］、聚己內(nèi)酯^［33］、聚乙二醇^［34］、聚-N-異丙基丙烯酰胺^［35］、聚氨酯^［36］等人工合成聚合物作為支架使用，這些材料在可控性方面要優(yōu)于天然材料，其參數(shù)受控可隨意調(diào)節(jié)，但同樣缺乏天然材料的生物相容性。Dosh等^［37］以海藻酸鹽、N-異丙基丙烯酰胺（l-pNIPAM）和l-pNIPAM-co-DMAc水凝膠3種材料作為支架，將人腸道細胞系Caco-2和HT29-MTX細胞分別懸浮在水凝膠內(nèi)或分層在水凝膠之上進行靜態(tài)或動態(tài)培養(yǎng)，結(jié)果表明，在動態(tài)分層培養(yǎng)下，l-pNIPAM水凝膠支架支持兩種細胞的生長且可以誘導(dǎo)形成腸絨毛狀結(jié)構(gòu)，為研究腸道疾病和藥物測試提供了可替代的體外模型。目前，有支架的3D培養(yǎng)系統(tǒng)所使用的材料是人工合成和天然材料組成的復(fù)合物，合成聚合物可以調(diào)整細胞的黏附性，增強細胞的鋪展、增殖、分化和遷移能力，彌補了天然聚合物的可控性不足以及人工合成材料缺乏生物相容性的缺點。

1.2.2 無支架的3D培養(yǎng)模型

無支架技術(shù)主要基于某些細胞具有的自聚集能力^［38］，通過使用特定的細胞板或具有低附著力的材料促使細胞發(fā)揮聚集能力，形成球狀聚集體，細胞球狀體的大小通過細胞接種量和液滴體積進行控制^［39］。無支架產(chǎn)生3D培養(yǎng)物的方法主要有超低附著（ultra low attachment，ULA）板或涂有親水性帶中性電荷的聚合物、顆粒培養(yǎng)法、懸掛掉落法、磁懸浮法、生物反應(yīng)器等（圖2），不同的方法產(chǎn)生不同的3D培養(yǎng)物。Malho等^［40］將4種細胞經(jīng)2D培養(yǎng)后制成細胞懸液接種在96孔ULA板里構(gòu)建了MCF7、MDA-MB-231、SKBR3和MCF12A四種乳腺細胞系的細胞多聚體（multicellular aggregates，MCA），結(jié)果發(fā)現(xiàn)MCF7和MDA-MB-231形成的MCA緊湊，呈現(xiàn)出較小的區(qū)域占比，具有更多的細胞黏連和凋亡/壞死核心，而MCF12A和SKBR3形成的MCA松散且更扁平，區(qū)域占比較大，增殖細胞和凋亡細胞分布更加隨機，其中，MCAF7 MCAs具有腺體乳腺分化特征。

顆粒培養(yǎng)法是最簡單的3D培養(yǎng)系統(tǒng)之一，其將細胞懸浮液經(jīng)離心濃縮到試管底部，再將形成的顆粒球懸浮在培養(yǎng)基中，主要是增大細胞間黏附，最大限度提高球狀體的形成^［41］。Grigull等^［42］將人骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）和非OA軟骨細胞形成的高細胞密度沉淀在聚苯乙烯、細菌纖維素水凝膠中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)這兩種細胞的基因表達變化模式在3種培養(yǎng)系統(tǒng)中的反應(yīng)是相似的，都保留了表達軟骨生成標(biāo)志基因COL2A1的潛力，但是沉淀培養(yǎng)COL2A1/COL1A1的比率更高，在ECM沉積物、去分化標(biāo)志物方面更加優(yōu)異，強調(diào)了顆粒培養(yǎng)在體外維持軟骨細胞生成軟骨有更大的潛力。

懸掛掉落法則是將細胞經(jīng)2D培養(yǎng)后，制成細胞懸液，將一定量的細胞接種在迷你托盤中的液滴培養(yǎng)基中，然后將托盤倒置，利用重力和表面張力使細胞在液滴中形成3D細胞聚集體^［43］?？梢酝ㄟ^液滴的大小和細胞懸液的濃度控制球狀體的大小。Gupta等^［44］將20 μL含有SiHa宮頸癌細胞的細胞培養(yǎng)基液滴移至培養(yǎng)皿的蓋子上，孵育4 d，建立了3D SiHa腫瘤球體，為藥物遞送提供了一個體外模型。

磁懸浮法是將細胞與磁性納米顆?；旌?，使細胞內(nèi)化，在外加磁場的作用下，磁力、重力、浮力達到平衡，細胞懸浮在培養(yǎng)基中，促進細胞的組裝和交流，從而使細胞形成聚集體^［45］。Adine等^［46］創(chuàng)建了一種磁性3D打印生物系統(tǒng)用于生成唾液腺（salivary gland， SG）類器官。將人牙髓干細胞與金、氧化鐵和聚-l-賴氨酸組成的磁性納米顆?；旌希寡浪韪杉毎呕?，利用溫和磁力構(gòu)建3D球狀體，之后用成纖維生長因子10完成了SG上皮的分化，概括了SG上皮形態(tài)發(fā)生和神經(jīng)發(fā)生的過程。

生物反應(yīng)器有旋轉(zhuǎn)瓶和旋轉(zhuǎn)壁容器兩種系統(tǒng)。旋轉(zhuǎn)瓶系統(tǒng)是一個圓柱形玻璃器皿，內(nèi)有葉輪，通過電機驅(qū)動。將細胞置于有培養(yǎng)基的旋轉(zhuǎn)瓶中，通過葉輪轉(zhuǎn)動防止細胞黏附在底部。但該系統(tǒng)會產(chǎn)生流體剪切力從而對細胞產(chǎn)生一定的有害影響，需要調(diào)整好合適的轉(zhuǎn)速^［47］。旋轉(zhuǎn)壁容器是圓柱形玻璃容器在一個軸或多個軸上旋轉(zhuǎn)，細胞培養(yǎng)物可以和容器同步旋轉(zhuǎn)，在容器內(nèi)部模擬微重力并產(chǎn)生低剪切力，細胞懸浮相互聚集產(chǎn)生球狀體^［48］。Qian等^［49］基于標(biāo)準(zhǔn)12孔板設(shè)計了SpinΩ設(shè)備，并利用該設(shè)備建立了從人類誘導(dǎo)多能干細胞生成前腦、中腦、下丘腦三種類器官，為探究腦類疾病提供一種研究模型。

無支架3D培養(yǎng)技術(shù)主要是基于細胞本身具有聚集性的特點，通過各種方式約束其與培養(yǎng)板黏附，使細胞互相聚集黏附從而形成球狀體或類器官。

微流控是一種通過對流體流量高度控制操縱流體的技術(shù)，其具有高度可控的特點，依附支架或由細胞聚集形成的球狀體或類器官都可以通過設(shè)置參數(shù)精確控制微環(huán)境，如控制營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的流動以達到引入特定分子梯度的目的，從而滿足試驗的特定要求。Shin和Kim^［50］構(gòu)建了一種基于聚二甲硅氧烷的多孔膜制成的微流體腸道芯片和Transwell插入的混合芯片培養(yǎng)Caco-2或腸道類器官上皮細胞并誘導(dǎo)其3D形態(tài)發(fā)生，結(jié)果表明在5 d內(nèi)控制基底外側(cè)液體流動來去除或最低限度維持基底外側(cè)室區(qū)中的Wnt拮抗劑水平能夠?qū)崿F(xiàn)功能性腸道微結(jié)構(gòu)的體外重建。微流控技術(shù)的高度可控性，為體外模擬體內(nèi)微環(huán)境提供了可能性。微流控技術(shù)與3D細胞培養(yǎng)的結(jié)合無疑為研究細胞的生理特點、形態(tài)發(fā)生和器官發(fā)育提供了有力的技術(shù)支撐。

3D細胞培養(yǎng)技術(shù)并沒有統(tǒng)一的、程序化的步驟，其實現(xiàn)的方式是多種多樣的。除了依賴支架或細胞本身的聚集特點外，其與微流控技術(shù)結(jié)合制造微流控芯片或結(jié)合多種學(xué)科形成的3D生物打印技術(shù)等在生命科學(xué)研究中顯示出巨大的潛力。無支架和有支架的培養(yǎng)系統(tǒng)相差甚遠，兩者各有優(yōu)勢和局限（表2），研究中可根據(jù)目標(biāo)進行選擇。無支架培養(yǎng)系統(tǒng)更適合培養(yǎng)一些簡單的球狀體，其所需的材料以及操作方法與基于支架的培養(yǎng)系統(tǒng)相比更加簡便且一般實驗室即可進行操作。有支架培養(yǎng)系統(tǒng)，可以培養(yǎng)更加復(fù)雜的3D細胞模型，這些支架代替體內(nèi)的ECM起結(jié)構(gòu)支撐以及與細胞交流的作用，促進組織的生成，從而形成類器官。

1.3 3D細胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用

近年來，3D細胞培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展迅速，在腫瘤細胞、干細胞等細胞中應(yīng)用廣泛。研究表明，利用3D培養(yǎng)技術(shù)產(chǎn)生的類腫瘤能夠重建腫瘤的重要特征，如腫瘤微環(huán)境、細胞間和細胞-ECM的相互作用等，進而深入研究癌癥的發(fā)生、進展、耐藥復(fù)發(fā)等機制^［51］。目前，3D細胞培養(yǎng)技術(shù)已成功用于乳腺癌^［52］、結(jié)腸癌^［53］、皮膚癌^［54］、巨噬細胞^［55］等腫瘤相關(guān)細胞的建模。這些模型的構(gòu)建對于藥物研發(fā)、評估藥物治療效果、開發(fā)個性化治療和免疫治療具有重要意義。干細胞是一類具有強大分化潛力的細胞。研究人員利用3D細胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)干細胞構(gòu)建了腦類器官^［56］、脂肪組織類器官^［57］、骨類器官^［58］、毛囊類器官^［59］等用于疾病模型、組織發(fā)育機制的研究或代替細胞和組織移植的來源^［60］。細胞外囊泡是干細胞通過旁分泌產(chǎn)生的脂質(zhì)雙層顆粒，是干細胞療法的替代品之一^［61］。利用3D細胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)干細胞對提高細胞外囊泡的產(chǎn)量、活性和含量具有促進作用，從而提高治療效果^［62］。3D細胞培養(yǎng)技術(shù)在畜牧領(lǐng)域的應(yīng)用主要體現(xiàn)在脂肪沉積、干細胞分化及體外消化器官研究等方面。Xiang等^［63］基于3D細胞培養(yǎng)技術(shù)開發(fā)的豬胚胎干細胞到豬胚細胞的兩步分化策略，實現(xiàn)了早期胚胎發(fā)生的體外建模，對畜禽的育種具有指導(dǎo)意義。Diez等^［64］利用脫細胞脂肪組織支架研究了奶牛皮下脂肪組織和內(nèi)臟脂肪組織的成脂能力，結(jié)果表明皮下脂肪組織的成脂能力高于內(nèi)臟脂肪組織，且這種差異是ECM微環(huán)境不同造成的。瘤胃是反芻動物的重要消化器官，瘤胃微生物群以短鏈脂肪酸的形式為反芻動物提供70%發(fā)酵所需的能量。Xu等^［65］以綿羊瘤胃上皮細胞建立的瘤胃上皮類器官不但能夠表達瘤胃細胞的特異性基因，而且可以攝取脂肪酸產(chǎn)生2D培養(yǎng)物，因此利用這種體外系統(tǒng)可以代替實驗動物的使用。綜上，3D細胞培養(yǎng)技術(shù)在研究細胞串?dāng)_、組織發(fā)育、疾病發(fā)生、藥物開發(fā)、藥效評估、再生醫(yī)學(xué)以及減少實驗動物的使用等方面極具發(fā)展?jié)摿Α?/p>

2 毛囊的生物學(xué)特征

2.1 毛囊的生成

毛囊的形成始于胎兒的皮膚發(fā)育階段，隨表皮的生成而發(fā)生，其發(fā)育涉及外胚層和中胚層的相互作用^［66］。首先，表皮細胞接受來自間充質(zhì)細胞（真皮細胞）的“第一真皮信號”，使上皮增厚形成毛發(fā)基板^［67］；然后，毛發(fā)基板向間充質(zhì)細胞發(fā)出“第一上皮信號”促進DPC在毛發(fā)基板下凝聚。在這個過程中，Wnt/β-catenin和EDA/EDAR/NF-κB信號傳導(dǎo)對于基板的命運至關(guān)重要，Zhang等^［68］表明真皮細胞中Wnt/β-catenin活性的模式化需要上皮細胞的β-catenin，且EDA/EDAR/NF-κB信號傳導(dǎo)可以完善Wnt/β-catenin活性的模式，并在基板發(fā)育的后期保持這種活性。當(dāng)毛發(fā)基板和DPC完成后，DPC向基板發(fā)出“第二真皮信號”使基板細胞增殖內(nèi)陷形成毛囊初始結(jié)構(gòu)^［69］。在這個過程中，基板細胞在完全形成的毛囊中可以產(chǎn)生至少8種不同的細胞類型，以及提供毛囊再生的原料——干細胞^［70］。毛囊形態(tài)發(fā)生取決于上皮（表皮干細胞）和毛發(fā)誘導(dǎo)間充質(zhì)（真皮細胞）的分子通信^［71］。

2.2 毛囊的周期性循環(huán)

毛囊是一個動態(tài)的微型器官，其形態(tài)結(jié)構(gòu)復(fù)雜且呈現(xiàn)周期性的退化和再生。在此過程中，根據(jù)毛囊的形態(tài)變化，將其分為生長期、退行期、休止期3個階段^［67］。在毛囊的生長期階段，DPC與毛囊干細胞（hair follicle stem cell，HFSC）相互作用，快速增殖，形態(tài)和體積變大。HFSC分化的毛基質(zhì)角質(zhì)形成細胞密集增殖，向皮下組織和毛囊頂部遷移，分化為毛干和內(nèi)根鞘細胞^［70］。研究發(fā)現(xiàn)，毛囊細胞在生長期階段具有高度異質(zhì)性，由20多種不同的亞群細胞組成^［69］。毛囊經(jīng)歷生長期成熟后進入退化期。在退化期階段，毛球部快速退化，球部基質(zhì)細胞、內(nèi)根鞘和外根鞘角質(zhì)形成細胞凋亡，毛干停止生長^［72］。最終，HFSC遷移到隆突外部的外根鞘層并恢復(fù)靜止?fàn)顟B(tài)，毛乳頭細胞凝聚并向上移動到隆起的下方區(qū)域，毛囊萎縮，進入休止期。休止期是毛囊生物活性最弱的時期，毛干在此期脫落，調(diào)控毛囊周期的相關(guān)的因子開始表達，為進入下一個生長期做準(zhǔn)備。Wnt和BMP是毛囊周期性生長的關(guān)鍵信號通路。研究發(fā)現(xiàn)，BMP2和BMP4在休止期的表達量高于生長期，促進毛囊生長期轉(zhuǎn)化為退行期，抑制休止期向生長期轉(zhuǎn)化^［73］。當(dāng)BMP拮抗劑抑制上皮細胞和真皮細胞之間的BMP信號時，Wnt信號通路激活，休止期向生長期轉(zhuǎn)變，毛囊再生過程啟動^［74］。

2.3 毛囊生物學(xué)研究進展

目前，毛囊生物學(xué)研究在毛囊干細胞、細胞間互作、體外毛囊培養(yǎng)、移植毛囊相關(guān)細胞誘導(dǎo)產(chǎn)生毛發(fā)、毛囊相關(guān)信號通路等方面均取得了一定的成果。HFSC對維持毛囊穩(wěn)態(tài)具有重要作用。Disabled 2（Dab2）是一種銜接蛋白，在HFSC中高表達。Roy等^［75］發(fā)現(xiàn)Dab2敲除小鼠由于HFSC活化紊亂表現(xiàn)出毛囊周期延遲。Yusupova等^［76］通過耗竭促Bax凋亡蛋白使HFSC增加，進而促進了毛囊再生。HFSC位于毛囊的隆突部，具有獨特的生態(tài)位，這種生態(tài)位對維持和調(diào)節(jié)HFSC的功能極其重要。DPCs位于隆突底部與HFSC直接接觸，調(diào)控HFSC的激活、增殖和分化。Zhou等^［77］將DPCs產(chǎn)生的外泌體注射入不同循環(huán)階段的毛囊中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射外泌體后的小鼠毛囊加速進入并延長了生長期。Yan等^［78］將HFSC與DPC共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)誘導(dǎo)了HFSCs的分化，且HFSCs表面附有DPC來源的外泌體，進一步對其和DPCs進行高通量測序，結(jié)果顯示有111個差異表達miRNAs，其中前34個差異表達miRNAs的預(yù)測靶基因通過參與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)HFSC的增殖和分化。Martino等^［79］發(fā)現(xiàn)真皮鞘細胞通過收縮產(chǎn)生機械力使得DPC和HFSC接近，促進毛囊進入休止期。Lee等^［80］使用人類多能干細胞構(gòu)建了帶有毛發(fā)的皮膚類器官培養(yǎng)方法，通過逐步調(diào)節(jié)TGF-β和FGF信號通路，在球型細胞聚集體中共同誘導(dǎo)顱上皮細胞和神經(jīng)嵴細胞，經(jīng)4～5個月的培養(yǎng)觀察到了帶有毛發(fā)的囊狀皮膚類器官。Yoon等^［81］使用Wnt激活劑對離體毛囊進行處理，發(fā)現(xiàn)其可以增加離體毛囊的毛發(fā)長度。毛囊是由多種細胞組成的微型器官，在單一細胞上的研究難以展現(xiàn)出毛囊的整體特征，因此，多細胞間互作在研究毛囊生物學(xué)研究中尤為重要。

不難看出，毛囊的形成和周期性生長是由多種細胞互相作用的結(jié)果。基于此，3D培養(yǎng)技術(shù)為體外研究體內(nèi)毛囊中關(guān)鍵細胞群的功能提供了一種新的模型，并表現(xiàn)出巨大潛力。

3 3D細胞培養(yǎng)技術(shù)在毛囊生物學(xué)研究中的應(yīng)用

目前，3D培養(yǎng)技術(shù)在毛囊的研究中的應(yīng)用逐漸廣泛。毛乳頭細胞是毛囊的信號中心，對于毛發(fā)再生和毛囊周期性生長具有重要作用，毛乳頭細胞發(fā)揮誘導(dǎo)能力需要一定的形態(tài)支持^［3］。Kang等^［82］將懸滴法培養(yǎng)的3D毛乳頭細胞球體與新生小鼠表皮細胞混合后觀察到了毛囊的形成。Higgins等^［83］使用ULA培養(yǎng)的毛乳頭細胞球形成了多細胞球體的毛乳頭細胞，完整的轉(zhuǎn)錄特征部分恢復(fù)，與胞外基質(zhì)合成有關(guān)的蛋白顯著高表達，且誘導(dǎo)能力再生。Tan等^［84］利用ULA培養(yǎng)的上皮角質(zhì)形成細胞（keratinocytes，KC）和DPCs生成了異質(zhì)型的KC-DP球體，該球體具有毛乳頭細胞的誘導(dǎo)能力及表達毛囊譜系基因的能力。Liu等^［85］利用MG包裹毛乳頭細胞構(gòu)建了MG 3-D培養(yǎng)模型并與上皮細胞共培養(yǎng)優(yōu)化為仿生系統(tǒng)以模擬體內(nèi)DPCs的微環(huán)境，結(jié)果表明，DPCs的誘導(dǎo)能力進一步恢復(fù)，可促進毛囊的重建和毛發(fā)的生長。這些系統(tǒng)的建立為毛囊組織工程的大規(guī)模應(yīng)用提供一個可能。

毛囊再生的另一種技術(shù)是3D生物打印技術(shù)，該技術(shù)結(jié)合3D培養(yǎng)技術(shù)可以構(gòu)建體內(nèi)毛囊所處的復(fù)雜微環(huán)境，以實現(xiàn)毛發(fā)的體外生長。Kang等^［86］將成纖維細胞、臍靜脈內(nèi)皮細胞、DPCs和表皮細胞分別封裝在明膠/海藻酸鹽混合物中并利用3D打印平臺打印不同層的復(fù)合物支架，結(jié)果表明，該支架有合適的細胞相容性，促進了DPCs的增殖，恢復(fù)了相關(guān)的毛囊誘導(dǎo)基因，DPCs與表皮細胞在體外成功組裝成未成熟的毛囊，為體外建立毛囊模型提供了一種方法。

毛囊是由多種細胞群構(gòu)成的微器官，不同細胞群互相串?dāng)_形成復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)，同時ECM調(diào)控著毛囊周期性生長。2D層次的培養(yǎng)無法展現(xiàn)毛囊的功能特征，因此，3D細胞培養(yǎng)技術(shù)的出現(xiàn)，為研究毛囊周期性生長提供了新的方法。3D培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用為研究毛囊提供了新平臺。

4 總結(jié)與展望

毛囊是哺乳動物皮膚的附屬微器官，由20余種細胞類型構(gòu)成，各種細胞形態(tài)、細胞-細胞、細胞與ECM之間的交流對于毛囊的發(fā)育和再生具有重要意義。3D培養(yǎng)技術(shù)允許細胞向任意方向生長，并通過模擬天然微環(huán)境，促使細胞恢復(fù)部分在體內(nèi)的生理特點。目前，通過多種3D細胞培養(yǎng)技術(shù)來構(gòu)建毛囊的體外模型，從單一的球狀體到3D打印形成的類器官，為重現(xiàn)毛囊各細胞類型在體內(nèi)的基因表達提供了可能，促進各類型細胞功能的挖掘；將3D細胞培養(yǎng)技術(shù)與3D打印技術(shù)和實現(xiàn)活細胞三維成像的共聚焦顯微鏡技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，將為深入研究毛囊周期性生長的機制提供更加有效的方式，為羊毛生長的人工調(diào)控提供新的思路；將干細胞生成的腦類器官作為人工智能系統(tǒng)的組件生成的類器官智能（organoid intelligence，OI）為闡明神經(jīng)生理學(xué)的機制和開發(fā)生物計算機提供了條件。這種3D細胞培養(yǎng)技術(shù)和人工智能系統(tǒng)結(jié)合生成的OI在生物醫(yī)學(xué)和計算機領(lǐng)域有極大的應(yīng)用潛力；在3D細胞培養(yǎng)技術(shù)的基礎(chǔ)上將細胞與刺激響應(yīng)的材料結(jié)合進一步升級為4D細胞培養(yǎng)技術(shù)，其增加的時間維度對體內(nèi)細胞生物學(xué)過程的模擬度更高，從而深入理解細胞生物學(xué)，為疾病研究、藥物篩選、組織工程等領(lǐng)域提供更有效的工具和方法。綜上，可以預(yù)見3D細胞培養(yǎng)技術(shù)在細胞生物學(xué)、組織工程、疾病建模、藥物開發(fā)和藥效評估等領(lǐng)域有著巨大的發(fā)展前景。

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