摘 要： 基因編輯技術(shù)是修飾特定基因的新型分子工具，可在基因序列中有效引入新的突變，為分析基因功能和與表型相關(guān)的DNA序列提供了有效的手段。自發(fā)現(xiàn)以來，基因編輯技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用在各種動物、植物及其他生物中，為基因治療及精準(zhǔn)作物育種等領(lǐng)域提供了重要技術(shù)支撐。本文旨在回顧近年來基因編輯工具的發(fā)展，闡述了經(jīng)典編輯工具、堿基編輯工具和其他新編輯工具的進(jìn)展，以期為相關(guān)領(lǐng)域科研人員進(jìn)一步了解、優(yōu)化編輯系統(tǒng)提供參考。

關(guān)鍵詞： 基因編輯；ZFN編輯；TALENs編輯；CRISPR-Cas；堿基編輯

中文關(guān)鍵詞

中圖分類號：S813.1"""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）01-0001-14

收稿日期：2024-06-27

基金項目：科技創(chuàng)新2030—重大項目（2023ZD04048；2023ZD0404801）

作者簡介：包斌武（1998-），男，甘肅天水人，博士生，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail： b013019@126.com

*通信作者：李俊雅，主要從事肉牛育種技術(shù)研究和新品種培育，E-mail： lijunya@caas.cn；高 雪，主要從事肉牛分子育種及基因組學(xué)研究，E-mail： gaoxue@caas.cn

BAO" Binwu 又稱基因組編輯（genome edting）或基因組工程（genome engineering），是一種能對目標(biāo)基因進(jìn)行定點(diǎn)“編輯”，實(shí)現(xiàn)特定DNA片段修飾的基因工程技術(shù)^［1］?；蚓庉嫾夹g(shù)的核心是利用一種特殊的核酸酶，也稱“上帝的手術(shù)刀”，在基因組特定位置產(chǎn)生位點(diǎn)特異性雙鏈斷裂（double strand break， DSB）。這種斷裂會激活細(xì)胞內(nèi)的兩種主要修復(fù)機(jī)制：非同源末端連接（non-homologous end joining， NHEJ）和同源重組（homology directed repair， HDR）。NHEJ是一種不依賴模板的修復(fù)方式，它直接連接斷裂的兩端，但可能會引入一些插入或缺失的突變，導(dǎo)致基因失活或改變。HDR是一種依賴模板的修復(fù)方式，它利用一個同源的DNA片段作為參照，來修復(fù)或替換斷裂的區(qū)域，實(shí)現(xiàn)精確的基因編輯。

1979年，Scherer和Davis^［2］通過同源重組的方法首次實(shí)現(xiàn)了外源基因的插入，標(biāo)志著基因組編輯技術(shù)的正式形成。隨后，研究人員開發(fā)出工程核酸酶，如鋅指核酸酶（zinc finger nuclease， ZFN）和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶（transcription activator like effector nucleases， TALENs）來提高基因編輯的特異性。2012年，Jinek等^［3］在體外重現(xiàn)了基因剪刀CRISPR-Cas9，證明CRISPR-Cas能夠在指定位點(diǎn)切割DNA。2013年，Mali等^［4］率先證實(shí)CRISPR-Cas系統(tǒng)同樣能夠在真核細(xì)胞中起作用，這標(biāo)志著基因編輯技術(shù)進(jìn)入了新時代。由于其易編程性、高特異性和多功能性，CRISPR-Cas系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)后迅速成為主導(dǎo)的基因編輯工具。在此基礎(chǔ)上，研究人員于2016和2019年先后開發(fā)出堿基編輯（base editing， BE）^［5］與先導(dǎo)編輯工具（prime editing， PE）^［6］，實(shí)現(xiàn)了基因精準(zhǔn)編輯。而Profluent公司在近期推出的第一個完全由AI生成的基因編輯器-OpenCRISPR- 則預(yù)示著基因編輯工具的發(fā)展進(jìn)入人工智能新時代^［7］（圖1）。

隨著科研不斷深入，需要更精準(zhǔn)、更高效、更全面和更智能的編輯工具來實(shí)現(xiàn)基因編輯?，F(xiàn)有編輯工具的優(yōu)化和新工具的開發(fā)是當(dāng)下研究的熱點(diǎn)，本文旨在回顧幾種傳統(tǒng)的基因編輯工具以及新型基因編輯工具的最新發(fā)展技術(shù)，以期對基因編輯工具的開發(fā)優(yōu)化提供參考。

1 經(jīng)典基因編輯工具

1.1 ZFN基因編輯技術(shù)

ZFN基因編輯技術(shù)誕生于1996年，是第一代基因組編輯技術(shù)，主要利用鋅指蛋白（zinc finger protein， ZFP）特異性識別特定堿基序列來實(shí)現(xiàn)基因編輯，由ZFP和Fok Ⅰ核酸內(nèi)切酶兩個關(guān)鍵部分組成^［8］。其中，由ZFP構(gòu)成的DNA識別域能識別特異位點(diǎn)并與之結(jié)合，而由Fok Ⅰ構(gòu)成的切割域能執(zhí)行剪切功能，兩者結(jié)合可使靶位點(diǎn)的雙鏈DNA斷裂（DSB）。ZFN技術(shù)功能的實(shí)現(xiàn)主要是基于ZFP發(fā)展起來的。1986年Diakun等^［9］首先在真核生物轉(zhuǎn)錄因子家族的DNA結(jié)合區(qū)域發(fā)現(xiàn)了Cys2-His2鋅指模塊，到1996年，Kim等^［10］首次人工連接了鋅指蛋白與核酸內(nèi)切酶。隨后，2002年Bibikova等^［11］首次在果蠅中設(shè)計了第一個序列特異性核酸酶，稱為鋅指核酸酶（ZFN）。2005年，Urnov等^［12］發(fā)現(xiàn)一對由4個鋅指連接而成的ZFN可識別24 bp的特異性序列，由此揭開了ZFN在基因組編輯中的應(yīng)用。近年來研究人員使用蛋白質(zhì)工程將Fok Ⅰ切割結(jié)構(gòu)域與鋅指蛋白的氨基和羧基末端融合，擴(kuò)大了ZFN的靶向能力^［13］并通過減弱Fok Ⅰ切割結(jié)構(gòu)域的切割活性改善了其特異性^［14］。2024年Katayama等^［15］通過生物分子建模工具（如AlphaFold）對鋅指核酸酶進(jìn)行工程改造，將基因組編輯的效率提高5%。

ZFN編輯技術(shù)雖開啟了基因編輯的先河，但仍存在一些技術(shù)上的局限性，例如Fok Ⅰ核酸內(nèi)切酶必須以二聚體的形式出現(xiàn)才能具備核酸酶活性，因此需要成對的鋅指蛋白將其引導(dǎo)到靶位點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)DSB的形成^［16］。此外，并非所有序列都可用于ZFP結(jié)合，因此位點(diǎn)選擇范圍具有局限性。除了技術(shù)上的問題，ZFN發(fā)展面臨更大的問題是專利上的封鎖。

1.2 TALEN基因編輯技術(shù)

繼ZFN之后，出現(xiàn)了另一種較為靈活和高效的基因靶向編輯技術(shù)，即TALEN技術(shù)。該技術(shù)發(fā)明于2011年，由AvrBs3蛋白衍生而來，其工作原理與ZFN類似，核心元件的結(jié)構(gòu)也類似，由DNA識別域轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)蛋白（transcription activator like effectors，TALEs）和DNA剪切域（Fok Ⅰ核酸內(nèi)切酶）組成。TALEs是研究人員在植物病原菌黃單胞菌屬中發(fā)現(xiàn)的一類新天然DNA結(jié)合蛋白^［17］，其包含33～35個氨基酸重復(fù)序列，位于中央DNA結(jié)合區(qū)（氨基酸12和13）的兩側(cè)。這種DNA結(jié)合區(qū)域，稱之為重復(fù)變量二殘基（repeat variable diresidue， RVD），能識別特異性DNA堿基位點(diǎn)。TALEs通過RVD識別域結(jié)合到特定的DNA序列上，再由Fok Ⅰ核酸內(nèi)切酶構(gòu)成的DNA剪切域?qū)Π谢蜻M(jìn)行剪切，最后利用細(xì)胞自帶的DNA修復(fù)系統(tǒng)完成基因編輯^［18］。近年來，Jain等^［19］發(fā)現(xiàn)TALE在異染色質(zhì)區(qū)域的識別效率比Cas9高5倍，TALENs比Cas9更有效地修飾了50%的異染色質(zhì)位點(diǎn)，表明在異染色質(zhì)區(qū)域TALENs是一種比Cas9更有效的基因編輯工具。

TALENs與ZFN的區(qū)別在于DNA識別域?qū)NA序列的識別模式。在ZFN中，每個鋅指蛋白識別一個DNA三堿基序列；在TALENs中，每兩個氨基酸組合對應(yīng)著一個特定的堿基。因此，通過人為的刪減、添加和自由組合不同的氨基酸組合，可以輕而易舉地構(gòu)造出結(jié)合特定DNA序列的蛋白，從而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶在基因組DNA上的精確定位。與ZFN技術(shù)相比，TALENs具有獨(dú)特的優(yōu)勢，設(shè)計更加簡單，特異性更高，但其缺點(diǎn)主要是具有一定的細(xì)胞毒性^［20］，并且TALEN比ZFN大得多，一個TALEN需要3 kb的cDNA編碼，而單個ZFN只需要1 kb。此外，由于TALENs序列的高度重復(fù)，限制了一些病毒載體中的包裝和遞送。

1.3 CRISPR基因編輯技術(shù)

盡管ZFN、TALENs編輯技術(shù)已成為實(shí)現(xiàn)靶向基因組修飾的關(guān)鍵，但由于其設(shè)計/篩選過程復(fù)雜，脫靶率高，包裝遞送困難等限制，仍需發(fā)展易設(shè)計、脫靶率低且包裝遞送容易的新技術(shù)^［4］。CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats， CRISPR）技術(shù)的出現(xiàn)，開辟了基因編輯的新紀(jì)元，也為未來的生物醫(yī)藥研究和應(yīng)用提供了無限可能。CRISPR技術(shù)是一種利用RNA引導(dǎo)的DNA內(nèi)切酶在特定位置切割DNA，從而實(shí)現(xiàn)基因編輯的技術(shù)。它最早的研究始于20世紀(jì)90年代，當(dāng)時研究人員在一些細(xì)菌和古菌的基因組中發(fā)現(xiàn)了一些重復(fù)序列，這些序列之間由非重復(fù)的間隔序列分隔^［21］。這些重復(fù)序列和間隔序列的結(jié)構(gòu)特征，后來被稱為CRISPR。2005年，研究人員發(fā)現(xiàn)這些間隔序列與細(xì)菌感染的病毒DNA相匹配，揭示了CRISPR序列與細(xì)菌抵抗病毒感染之間的關(guān)系^［22-23］。2007年，Barrangou等^［24］首次演示了CRISPR系統(tǒng)可以作為細(xì)菌的一種獲得性免疫機(jī)制，防御外來遺傳物質(zhì)的侵入。經(jīng)過不懈努力，科研人員逐步揭示了其作用機(jī)制，并成功將其轉(zhuǎn)化為一種高編輯精度和高靈活性的編輯工具。

CRISPR-Cas系統(tǒng)的全稱為規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列以及CRISPR相關(guān)蛋白（CRISPR-associated protein， Cas）^［25］。該系統(tǒng)是在細(xì)菌和古細(xì)菌中廣泛存在的一種獲得性免疫系統(tǒng)，由Cas核酸酶和兩個單獨(dú)的RNA組分組成，一個是可編程的crRNA（CRISPR RNA）和一個固定的tracrRNA（反式激活crRNA）。Cas1-Cas2蛋白能夠?qū)⑷肭值氖删wDNA切割成小片段，然后將其作為間隔物整合到CRISPR陣列中。隨后，轉(zhuǎn)錄CRISPR陣列以產(chǎn)生crRNA和互補(bǔ)的tracrRNA，它們形成雙鏈RNA結(jié)構(gòu)，招募Cas蛋白進(jìn)行切割^{［3，26］}。在入侵DNA上的crRNA靶向序列附近，一個名為原間隔區(qū)鄰近基序（protospacer adjacent motif， PAM）的短序列在適應(yīng)和干擾階段起著至關(guān)重要的作用，CRISPR-Cas復(fù)合物在靶標(biāo)DNA結(jié)合過程中識別這些序列。PAM序列的缺失可能會改變Cas和靶DNA之間的親和力，因?yàn)樘囟ǖ腜AM序列識別有助于區(qū)分非自身靶序列和非靶序列^［27］。

CRISPR-Cas系統(tǒng)主要分為兩大類：一類是包括Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型的多蛋白效應(yīng)復(fù)合物，另一類是包括Ⅱ型、Ⅴ型、Ⅵ型的單個Cas蛋白復(fù)合物。與前者相比，二類系統(tǒng)（Ⅱ型Cas9、Ⅴ型Cas12a、Ⅵ型Cas13a和Cas13b系統(tǒng)）在基因組編輯應(yīng)用中具有更大的潛力。其中，與其他需要多種Cas蛋白的系統(tǒng)相比，Ⅱ型系統(tǒng)只有Cas9一種Cas蛋白。Cas9蛋白依賴于crRNA和tracrRNA融合和切割形成的sgRNA（單向?qū)NA），在RNA引導(dǎo)的DNA識別中發(fā)揮作用，使其用于基因組工程^［28-29］。Cas9包含與HNH和RuvC核酸內(nèi)切酶同源的結(jié)構(gòu)域，其中HNH結(jié)構(gòu)域切割互補(bǔ)DNA鏈，而RuvC樣結(jié)構(gòu)域切割非互補(bǔ)DNA鏈。2012年，Jinek等^［3］首次報道了CRISPR-Cas9系統(tǒng)可改造為可編程的RNA引導(dǎo)的DNA核酸內(nèi)切酶。隨后，Cong等^［28］利用改造后的CRISPR-Cas9系統(tǒng)首次在哺乳動物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了靶向基因編輯^［30］。此后，CRISPR-Cas9技術(shù)因其簡單、高效的特點(diǎn)迅速成為植物、動物、微生物基因敲除、基因敲入、大片段刪除等遺傳操作的首選技術(shù)。隨著研究深入，研究者們通過挖掘其他類型CRISPR系統(tǒng)，開發(fā)出一大批新的編輯工具（表1），使得CRISPR-Cas系統(tǒng)成為主導(dǎo)的基因編輯工具。

2 堿基編輯系統(tǒng)的發(fā)展

2.1 單堿基編輯系統(tǒng)

雖然CRISPR-Cas系統(tǒng)是目前使用最廣泛的基因編輯工具，但其仍存在一些不可忽視的問題，如效率低下，且存在非靶向切割，安全性較低等。因此，研究人員提出如何通過某種化學(xué)反應(yīng)，精準(zhǔn)實(shí)現(xiàn)DNA單鏈上的C/T間相互轉(zhuǎn)化，或者G/C之間的相互轉(zhuǎn)化，從而實(shí)現(xiàn)非DSB途徑的基因編輯。2016年4月，Komor等^［50］首次報道了一種單堿基編輯技術(shù)，該技術(shù)將spCas9與胞嘧啶脫氨酶融合，利用spCas9對DNA的精確定位能力將胞嘧啶脫氨酶導(dǎo)向靶序列，然后在胞嘧啶脫氨酶的催化下，將突變窗口內(nèi)的胞嘧啶C轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶T，后來也被稱為胞嘧啶堿基編輯器（cytosine base editor， CBE）。此后多個實(shí)驗(yàn)室也陸續(xù)發(fā)表了類似的工具，并在這些工具的基礎(chǔ)上進(jìn)行了深入的挖掘和優(yōu)化（表2）。2017年，Matsoukas^［51］和Landrum等^［52］又開發(fā)了新的單堿基編輯系統(tǒng)——腺嘌呤堿基編輯器（adenine base editor， ABE），實(shí)現(xiàn)A-G的轉(zhuǎn)換。通過對DNA正義鏈和反義鏈的編輯，這兩種DNA堿基編輯器可實(shí)現(xiàn)四種堿基轉(zhuǎn)換方式，分別為C-T、A-G、T-C以及G-A。2021年，中國科學(xué)院張學(xué)麗和畢昌浩構(gòu)建胞嘧啶脫氨酶-nCas9-Ung蛋白復(fù)合物，創(chuàng)造了一種新的糖基化酶堿基編輯器（guanine base editor， GBE），實(shí)現(xiàn)了C-A和C-G堿基間的轉(zhuǎn)換^［55］。下面分別對CBE、ABE和GBE進(jìn)行介紹。

2.1.1 CBE編輯系統(tǒng)

CBE系統(tǒng)主要由nCas9或dCas9和胞苷脫氨酶1（APOBEC1）組成，其中胞嘧啶的自發(fā)脫氨是C-G到T-A轉(zhuǎn)變的主要來源（圖2）。2016年，Komor等^［50］報道了BE1（rAPOBEC1-XTEN-dCas9），其原理是讓dCas9 N末端與APOBEC1形成融合蛋白，隨后gRNA將融合蛋白引導(dǎo)到靶位點(diǎn)，APOBEC1會使R環(huán)中單鏈DNA的C脫氨形成U，后續(xù)經(jīng)DNA復(fù)制完成C到T的轉(zhuǎn)換。該系統(tǒng)在不引入DNA雙鏈斷裂，也不需要重組修復(fù)模板的情況下，可實(shí)現(xiàn)更加安全、高效、精準(zhǔn)的單堿基編輯，而且其效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于DSB引起的HDR修復(fù)方式。

此外，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)雖然BE1系統(tǒng)的體外平均表觀編輯效率為44%，但在哺乳動物細(xì)胞中編輯效率僅有0.8%到7.7%^［50］。據(jù)推測，堿基編輯效率降低是由于尿嘧啶DNA糖基化酶（uracil DNA glycosylase， UDG）切除U形成缺失位點(diǎn)，以互補(bǔ)鏈上的G為模板補(bǔ)上C，使C到T的編輯效率降低。為提高編輯效率，將尿嘧啶DNA糖基化酶抑制劑（uracil DNA glycosylase inhibitor， UGI）融合到BE1的C末端，構(gòu)建了第二代堿基編輯器BE2（APOBEC-XTEN-dCas9-UGI），與BE1相比，增加

UGI使編輯效率提高大約3倍^［50］。隨后，將BE2系統(tǒng)中的dCas9用nCas9取代，使得非編輯鏈產(chǎn)生缺口，刺激細(xì)胞發(fā)生堿基錯配修復(fù)（mismatch repair， MMR），從而構(gòu)建出第三代堿基編輯器BE3（APOBEC-XTEN-dCas9（A840H）-UGI），相比于BE BE3的編輯效率提升2～6倍，并且在哺乳動物細(xì)胞中平均編輯效率可以達(dá)到37%^［50］。為了進(jìn)一步提升編輯效率，Koblan等^［53］于2018年通過增加核定位信號（nuclear localization signal， NLS），以及優(yōu)化密碼子的方法構(gòu)建了BE4max，將編輯效率在BE4的基礎(chǔ)上提高了3倍（表2）。

2.1.2 ABE編輯系統(tǒng)

繼CBE之后，Gaudelli等^［5］于2017年進(jìn)一步開發(fā)出腺嘌呤編輯器（ABE），與CBE類似，ABE的融合蛋白由nCas9（D10A）和人為改造的腺嘌呤脫氨酶組成，可以實(shí)現(xiàn)A-T到G-C堿基的轉(zhuǎn)換（圖3）。其工作原理是在sgRNA的引導(dǎo)下，融合蛋白結(jié)合到靶序列區(qū)，并將一定區(qū)域的腺嘌呤（A）脫氨形成肌苷（I），DNA修復(fù)或復(fù)制后，原來的A-T堿基對在靶位點(diǎn)被G-C堿基對取代，從而實(shí)現(xiàn)A到G的轉(zhuǎn)換^［5］。

2017年，Gaudelli等^［5］通過構(gòu)建TadA*-XTEN-nCas9-NLS構(gòu)建體，成功提出了第一代編輯效率很低的ABE堿基編輯器，即ABE1.2。隨后，經(jīng)過七輪進(jìn)化后成功構(gòu)建出ABE7.10，使得編輯效率平均為（53±3.7）%^［5］。為了進(jìn)一步提高ABE的編輯效率，研究者通過對ABE7.10進(jìn)行密碼子優(yōu)化以及增加NLS個數(shù)，構(gòu)建出ABEmax系統(tǒng)，編輯效率比ABE7.10提高1.5～2倍^［53］。隨后Gaudelli等^［54］又在ABE7.10的TadA中引入額外的突變，構(gòu)建了ABE8s，使得編輯效率比ABE7.10提高約4.2倍。

2.1.3 GBE編輯系統(tǒng)

GBE技術(shù)是在CBE的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的。CBE在將C轉(zhuǎn)變?yōu)閁后，體內(nèi)的UNG酶能將U堿基切除，形成無嘌呤無嘧啶的AP狀態(tài)（apurinic/apyrimidinic）。在AP狀態(tài)時，能夠觸發(fā)堿基切除修復(fù)機(jī)制，將U重新變回為C，但是也能被修復(fù)為其他3種堿基。于是，Zhao等^［55］在2021年通過將UNG與nCas9融合構(gòu)建出胞嘧啶脫氨酶-nCas9-UNG蛋白復(fù)合物，創(chuàng)造了一種新的糖基化酶堿基編輯器（GBE），實(shí)現(xiàn)C-A和C-G堿基更改。這一進(jìn)展導(dǎo)致了單個堿基基因可誘導(dǎo)嘧啶和嘌呤之間相互轉(zhuǎn)化的編輯系統(tǒng)^［55］。然而，研究發(fā)現(xiàn)GBE系統(tǒng)在不同編輯對象中的編輯方向不同。例如，在大腸桿菌中C變換成A是主要的編輯結(jié)果，而在HEK293T細(xì)胞中則是以C轉(zhuǎn)換成G為主要的編輯結(jié)果^［51］。可以看出在AP狀態(tài)下，細(xì)胞中存在著一種未知的修復(fù)機(jī)制使得AP態(tài)往不同的堿基進(jìn)行修復(fù)。因此這項技術(shù)仍需繼續(xù)完善。

2.1.4 先導(dǎo)編輯（PE）系統(tǒng)

雖然CBE和ABE能實(shí)現(xiàn)C到T和A到G的轉(zhuǎn)換，但是其他不同堿基之間的轉(zhuǎn)換仍然受限，于是2019年Anzalone等^［6］繼續(xù)開發(fā)出能適應(yīng)所有堿基轉(zhuǎn)換的技術(shù)-（prime editing， PE）。不同于單堿基編輯技術(shù)只能實(shí)現(xiàn)有限類型的堿基轉(zhuǎn)換，PE技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)所有12種堿基的互換，而且無需供體DNA即可實(shí)現(xiàn)短序列的精確插入和刪除。PE系統(tǒng)的基本原理是nCas9（H840A）與野生型Moloney鼠白血病病毒（M-MLV）逆轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV RT）形成融合蛋白，在pegRNA引導(dǎo)下融合蛋白結(jié)合到基因組特定序列，nCas9切開與pegRNA非互補(bǔ)鏈。pegRNA攜帶的單鏈DNA結(jié)合序列與被切開的非互補(bǔ)鏈按照堿基匹配規(guī)律結(jié)合，單鏈DNA暴露一個3′-OH，逆轉(zhuǎn)錄酶與之結(jié)合，按照堿基互補(bǔ)配對以RNA為模版合成DNA。隨后，合成后的DNA整合到基因組中，實(shí)現(xiàn)了靶向位點(diǎn)高效產(chǎn)生DNA的插入、刪除和單堿基替換完成基因編輯的過程^［6，56］（圖4）。PE是一種可以進(jìn)行活細(xì)胞基因組編輯的基因編輯器，可以糾正絕大多數(shù)致病的基因突變，自PE系統(tǒng)開發(fā)以來一直在不斷地改進(jìn)（表2），目前研究人員已通過優(yōu)化pegRNA、完善先導(dǎo)編輯器結(jié)構(gòu)、改進(jìn)細(xì)胞對PE編輯的反應(yīng)來提高編輯效率。

研究人員將Cas9（H840A）變體C端與M-MLV RT融合的系統(tǒng)命名為PE1。研究發(fā)現(xiàn)PE1系統(tǒng)對點(diǎn)突變的編輯效率最高可達(dá)到5.5%，小片段插入刪除編輯效率在4%～17%之間。為提高編輯效率，在PE1的基礎(chǔ)上修改了M-MLV RT （D200N+L603W+T330P+T306K+W313F），改善了熱穩(wěn)定性、逆轉(zhuǎn)錄連續(xù)性以及DNA、RNA結(jié)合緊密性，將編輯效率提高了約3倍^［6］。隨后在PE2基礎(chǔ)上，研究人員在pegRNA下游50 bp附近，引入另一條與pegRNA方向相反的sgRNA，達(dá)到分別切割非互補(bǔ)鏈的目的，建立PE3系統(tǒng)，在PE2基礎(chǔ)上提高了編輯效率^［6］。2021年，Chen等^［57］在PE2/PE3系統(tǒng)中分別插入MMR抑制蛋白（MLH1dn），分別構(gòu)建出PE4/PE5系統(tǒng)，并通過改變RT密碼子使用、SpCas9突變、NLS序列以及nCas9和RT之間肽連接子的長度和組成優(yōu)化PE2蛋白，構(gòu)建出PEmax系統(tǒng)，進(jìn)一步提高了編輯效率。隨后，Yan等^［58］發(fā)現(xiàn)La（一種小的RNA結(jié)合蛋白）是先導(dǎo)編輯的強(qiáng)促進(jìn)因子。他們將La蛋白的N端結(jié)構(gòu)域融合到現(xiàn)有PEmax C端（PEmax-C），構(gòu)建出PE7系統(tǒng)，與PEmax相比，PE7顯著增強(qiáng)了編輯效率，并減少了脫靶效應(yīng)。Liang等^［59］在2024年將PE編輯技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，利用較小的Cas12a蛋白開發(fā)出4種環(huán)狀RNA介導(dǎo)的先導(dǎo)編輯器（CPE）系統(tǒng)，包括切口酶依賴性CPE（niCPE）、雙鏈核酸酶依賴性CPE（nuCPE）、可拆分切口酶依賴性CPE（sniCPE）和可拆分雙鏈核酸酶-依賴CPE（snuCPE）。與其他系統(tǒng)相比，CPE系統(tǒng)優(yōu)先識別富含T的基因組區(qū)域，并具有潛在的多重能力。

2.2 雙堿基編輯系統(tǒng)

單一堿基編輯器只能催化單一類型的堿基編輯，限制了其廣泛的應(yīng)用。因此，開發(fā)新的編輯器技術(shù)，可以同時有效地產(chǎn)生兩種不同的堿基突變，將大大豐富堿基編輯工具。2019年，Kaplanis等^［60］構(gòu)建出融合活化誘導(dǎo)的人胞嘧啶脫氨酶（稱為hAID）、腺嘌呤脫氨酶和nCas9的高活性編輯工具（Aamp;C-Bemax）。Aamp;C-BEmax可以有效地轉(zhuǎn)換同一等位基因內(nèi)靶序列上的Cgt;T和Agt;G。并且在HEK293T細(xì)胞中測試了28個內(nèi)源性靶標(biāo)，結(jié)果顯示編輯Aamp;C-BEmax的窗口從C3-C10擴(kuò)展到C2-C17，編輯活動在C7-C17是AID-BE4max的1.9～14倍。

2.3 線粒體堿基編輯

線粒體作為細(xì)胞的“能量中心”在細(xì)胞生命活動過程中扮演著重要角色，它還是細(xì)胞核外存儲遺傳信息的另一細(xì)胞器。2020年，Mok等^［61］利用一種能夠作用于雙鏈DNA的脫氨酶DddA開發(fā)出了線粒體單堿基編輯器，首次實(shí)現(xiàn)了線粒體基因C-T的堿基編輯。隨后，2022年Cho等^［62］使用DddA和TadA8e組合，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了線粒體基因組A-G的堿基編輯。然而發(fā)現(xiàn)DddA系統(tǒng)存在比較嚴(yán)重的脫靶效應(yīng)，特別是DddA與CTCF存在相互作用，會產(chǎn)生細(xì)胞核基因組的非特異性編輯。隨后，Yi等^［63］在2023年報道了一種名為mitoBEs的全新線粒體單堿基編輯工具，該工具不依賴于DddA系統(tǒng)，不僅能夠高效地實(shí)現(xiàn)A-G或C-T的單堿基編輯，還具有選擇性地編輯特定鏈的能力。適用于細(xì)胞核基因組的堿基編輯，對相關(guān)疾病治療提供了潛力巨大的新工具。

3 轉(zhuǎn)座子類編輯工具

作為天然存在的移動遺傳元件，轉(zhuǎn)座子利用CRISPR效應(yīng)復(fù)合物與轉(zhuǎn)座酶蛋白結(jié)合進(jìn)行RNA引導(dǎo)的轉(zhuǎn)座，將長DNA序列插入特定的基因組位點(diǎn)而無需引起DSB，極大地提高了編輯的精確度，減少了脫靶效應(yīng)。

3.1 INTEGRATE

2019年6月，研究人員在霍亂弧菌中發(fā)現(xiàn)一種獨(dú)特的轉(zhuǎn)座元件后，開發(fā)了一種名為引導(dǎo)RNA輔助靶向的轉(zhuǎn)座元件插入（insertion of transposable elements by guide RNA-assisted targeting， INTEGRATE）的基因編輯工具。INTEGRATE將轉(zhuǎn)座酶的高效、無縫整合與CRISPR介導(dǎo)的靶向的可編程性相結(jié)合。此外，由于INTEGRATE不依賴于每個靶位點(diǎn)特異性的同源臂，因此可以使用具有多個靶向間隔區(qū)的CRISPR陣列快速生成多個同時插入同一細(xì)胞的基因組，實(shí)現(xiàn)多基因編輯。在這項技術(shù)中，序列特異性完全由向?qū)NA控制，表達(dá)載體以100%的效率有效地引導(dǎo)高精度插入，無需引入DNA斷裂，無需選擇標(biāo)記片段就可以插入到基因組中^［75-77］。

3.2 CRISPR相關(guān)轉(zhuǎn)座酶（CAST）

2019年6月，Strecker等^［78］從藍(lán)藻（Scytonema hofmanni CRISPR associated transposons，ShCAST）中獲得了一種CRISPR相關(guān)轉(zhuǎn)座酶，該酶由Tn7樣轉(zhuǎn)座酶亞基和V-K CRISPR效應(yīng)子（Cas12k）組成。ShCAST通過單向插入原間隔區(qū)下游60至66個堿基對的DNA片段來催化RNA引導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)座。該系統(tǒng)被稱為CAST，或CRISPR相關(guān)轉(zhuǎn)座酶，其優(yōu)點(diǎn)是可以將基因片段直接插入靶位點(diǎn)^［78］。其中Cas12k沒有核酸內(nèi)切酶活性，僅結(jié)合脫氧核糖核酸用于搜索特定的基因組中的序列位點(diǎn)。

3.3 TnpB

2021年，Karvelis等^［79］表明耐輻射奇球菌ISDra2（Deinococcus radioduran ISDra2）中的TnpB是一種RNA定向核酸酶。TnpB來自IS607轉(zhuǎn)座子家族，由源自轉(zhuǎn)座子右端元件的RNA引導(dǎo)，以切割5′-TTGAT轉(zhuǎn)座子相關(guān)基序旁邊的DNA，并證實(shí)TnpB是來自V型CRISPR系統(tǒng)的多種Cas12效應(yīng)蛋白的祖先內(nèi)切酶，將TnpB確立為基因組編輯新系統(tǒng)的原型。隨后，Wang等^［80］在2024年通過縮短TnpB的C端結(jié)構(gòu)域（CTD）對TnpB進(jìn)行優(yōu)化（lt;400 aa），并在哺乳動物細(xì)胞和小鼠中實(shí)現(xiàn)有效的基因編輯。與傳統(tǒng)的CRISPR-Cas系統(tǒng)相比，TnpB的大小僅為408個氨基酸殘基，遠(yuǎn)小于Cas12蛋白質(zhì)，而且在安全性和精確性方面也顯示出了優(yōu)勢^［81］。

4 其他類型的基因編輯工具

除了上述介紹到的基因編輯工具外，隨著研究的不斷深入，一些特殊的編輯工具也逐漸被發(fā)現(xiàn)。如利用內(nèi)源性ADAR對RNA進(jìn)行可編程編輯（leveraging endogenous ADAR for programmable editing of RNA，LEAPER）、水解型內(nèi)切核酶（hydrolytic endonucleolytic riozyme，HYER）、Fanzor蛋白等。特別是人工智能（AI），伴隨第一個完全由AI生成的基因編輯器-OpenCRISPR-1的出現(xiàn)，預(yù)示著基因編輯技術(shù)進(jìn)入了人工智能新時代。

4.1 LEAPER

2019年，Qu等^［82］報導(dǎo)了一種新型RNA編輯技術(shù)-LEAPER。與以CRISPR為基礎(chǔ)的DNA或者RNA編輯技術(shù)不同，LEAPER僅需要在細(xì)胞中表達(dá)特殊設(shè)計的RNA（ADAR-recruiting RNA，arRNA）即可招募細(xì)胞中內(nèi)源脫氨酶ADAR，實(shí)現(xiàn)靶向目標(biāo)RNA中腺苷A→肌苷I（鳥苷G）的編輯。隨后，團(tuán)隊對LEAPER進(jìn)行升級，LEAPER 2.0提供了一種新的共價閉合的環(huán)狀arRNA，稱為circ-arRNA，可實(shí)現(xiàn)更精確、更高效的RNA編輯，并具有廣泛的治療和基礎(chǔ)研究適用性^［82］。

4.2 Fanzor蛋白

2023年，Saito等^［83］在真核生物中發(fā)現(xiàn)了第一個可編程的RNA引導(dǎo)系統(tǒng)-Fanzor。他們從真菌、藻類和變形蟲物種以及北圓蛤中均分離出Fanzor蛋白，通過對Fanzor的生化特征分析發(fā)現(xiàn)其是一種切割DNA的核酸內(nèi)切酶，主要通過使用附近的非編碼RNA（即ωRNA）來靶向基因組中的特定位置^［83］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)anzor蛋白可對人類細(xì)胞基因組的特定位點(diǎn)進(jìn)行靶向的插入與缺失編輯。因此表明，F(xiàn)anzor蛋白有作為基因組編輯工具的潛力^［82］。此外，F(xiàn)anzor RNA引導(dǎo)內(nèi)切酶切割DNA時，會同時降解鄰近的DNA或RNA，與CRISPR-Cas系統(tǒng)相比，F(xiàn)anzor蛋白系統(tǒng)是一種更精準(zhǔn)，更高效的編輯工具^［83］。2024年，Xu等^［84］揭示了Fanzor結(jié)構(gòu)上的多樣性，并闡明了它通過構(gòu)象變化調(diào)控DNA切割的精確機(jī)制。

4.3 HYER

近期研究報道了一種具有精確操縱DNA的新型基因編輯工具——水解型內(nèi)切核酶（HYER）。HYER1是一種TRS引導(dǎo)的序列特異性DNA內(nèi)切酶，以一段暴露的單鏈RNA區(qū)域即目標(biāo)識別位點(diǎn)（TRS）來捕獲DNA底物靶標(biāo)，將DNA錨定在結(jié)構(gòu)域V所形成的催化核心中，同時以雙鎂離子機(jī)制催化DNA水解^［85］。HYER可特異性切割RNA和DNA底物，獨(dú)立于蛋白質(zhì)運(yùn)行，可以編輯細(xì)菌和人類細(xì)胞中的基因，有望成為繼CRISPR之后，新一代的基因編輯底盤工具^［85］。

4.4 AI蛋白語言模型

蛋白質(zhì)語言模型（protein language models，PLM）是一種由人工智能驅(qū)動的系統(tǒng)，其通過分析大量的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)，學(xué)習(xí)預(yù)測蛋白質(zhì)序列中被掩蓋的氨基酸，判定出周圍氨基酸，從而預(yù)測蛋白質(zhì)的行為和功能并優(yōu)化蛋白質(zhì)功能。2023年，研究人員利用AI輔助的大規(guī)模蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測鑒定出45個單鏈胞嘧啶脫氨酶（Sdd）和13個雙鏈胞嘧啶脫氨酶（Ddd）全新脫氨酶，并開發(fā)了新的可被單個腺相關(guān)病毒（AAV）遞送的Sdd6-CBE堿基編輯器，在小鼠細(xì)胞系中的編輯效率高達(dá)43.1%，以及Sdd7-CBE堿基編輯器，在大豆中的編輯效率高達(dá)22.1%^［86］。隨后，He等^［87］利用蛋白質(zhì)語言模型（PLMs）設(shè)計了一種針對胸腺嘧啶的增強(qiáng)UNG變體eTDG，并準(zhǔn)確預(yù)測超過80%的高適應(yīng)度變異。這使得TSBE3的開發(fā)成為可能，TSBE3是一種在細(xì)胞系、T細(xì)胞和小鼠胚胎中高效替換Tgt;G或C的工具。Profluent公司在2024年推出了第一個完全由AI生成的CRISPR-Cas基因編輯器-OpenCRISPR- 并且表現(xiàn)出與SpCas9相當(dāng)?shù)陌邢蚓庉嬓屎透叩奶禺愋?sup>［7^］，由此基因編輯工具的發(fā)展進(jìn)入人工智能新時代。

5 展 望

展望未來，開發(fā)更具特異性、免疫原性更低的遞送載體，減少脫靶效應(yīng)，提高編輯準(zhǔn)確性和精確度將成為基因編輯技術(shù)的研究重點(diǎn)。與純粹基于蛋白質(zhì)的編輯技術(shù)相比，核酸引導(dǎo)系統(tǒng)由于其簡單的可編程性和適應(yīng)性，可能仍將是基因組編輯的核心。此外，人工智能的興起使人們能夠準(zhǔn)確地模擬復(fù)雜的基因組編輯環(huán)境，預(yù)測靶向和脫靶編輯結(jié)果，從而加快實(shí)施安全治療方法的步伐。因此，基于AI人工智能的編輯系統(tǒng)有著廣泛的應(yīng)用場景和極高的可提升空間，是未來基因組編輯工具的重點(diǎn)研發(fā)對象。

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（編輯 郭云雁）