摘 要：為調(diào)查山東省肉鴨糞污腐熟劑菌群的情況，本研究從德州、日照、菏澤、泰安等地區(qū)肉鴨養(yǎng)殖場收集8種在用肉鴨糞污腐熟劑，利用平板劃線法將肉鴨糞污腐熟劑接種至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、YPD瓊脂培養(yǎng)基、高氏合成一號瓊脂培養(yǎng)基和MRS瓊脂培養(yǎng)基上分離純化，通過16S rDNA 序列分析鑒定菌株。結(jié)果顯示：8種在用肉鴨糞污腐熟劑中，62.5%為復(fù)合菌劑，菌群組合多為芽孢桿菌、假單胞菌和乳桿菌，菌種數(shù)量一般為106～107 CFU/g；37.5%為單一菌種，以枯草芽孢桿菌為主，菌種數(shù)量大約為1011 CFU/g。本研究通過調(diào)查了解山東省部分地區(qū)肉鴨糞污腐熟劑中菌群結(jié)構(gòu)，為肉鴨糞腐熟劑菌群構(gòu)建提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：肉鴨糞污腐熟劑；微生物；菌群結(jié)構(gòu)

中圖分類號：X713 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1673-1085（2025）01-0015-07

近年來，肉鴨因其肉質(zhì)好、飼養(yǎng)周期短、養(yǎng)殖成本低等特點(diǎn)，逐漸成為水禽養(yǎng)殖發(fā)展的重點(diǎn)對象。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020年我國肉鴨出欄量約49億只，養(yǎng)鴨量約占世界總量的74%[1]。肉鴨養(yǎng)殖規(guī)模迅速發(fā)展的同時，也產(chǎn)生了很多問題，其中最難以解決的就是糞污污染[2]。肉鴨糞污特性與其他畜禽有所不同，其水分含量高、固形物少、腥臭味大，難以固液分離。目前，對農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽糞污資源化處理7種典型模式[3]比較分析，主要模式是采用異位生物發(fā)酵床技術(shù)[4-5]將畜禽養(yǎng)殖與糞污處理分開，利用微生物發(fā)酵進(jìn)行畜禽糞污處理[6-7]。

異位發(fā)酵床技術(shù)的核心是微生物[8]，通過微生物的生長代謝活動將糞便中的物質(zhì)降解、轉(zhuǎn)化為簡單有機(jī)質(zhì)，實(shí)現(xiàn)畜禽糞便的減量化、穩(wěn)定化和無害化處理，達(dá)到無污染、零排放的目的[9，31-33]。微生物菌劑是將篩選、馴化的目標(biāo)微生物經(jīng)工業(yè)化生產(chǎn)擴(kuò)繁后，再經(jīng)過吸附、干燥等工藝加工制成，其中包括細(xì)菌、真菌與放線菌等[10]。微生物復(fù)合菌劑是以合理的比例混合兩種或多種微生物[11]，并驗(yàn)證通過這些菌株的協(xié)同作用均可加快高溫好氧堆肥，使堆肥快速進(jìn)入腐熟階段[12]。根據(jù)市場肉鴨糞污腐熟劑菌劑成分說明以及菌劑生長條件，本研究采用營養(yǎng)瓊脂、YPD瓊脂、高氏合成一號瓊脂和MRS瓊脂培養(yǎng)基等對8種不同腐熟劑分離與鑒定。

本研究通過四種培養(yǎng)基結(jié)合分子生物學(xué)鑒定法[13-15]對部分地區(qū)養(yǎng)鴨場正在使用的糞污腐熟劑做菌群結(jié)構(gòu)分析，通過利用不同培養(yǎng)基分離純化菌種，了解肉鴨糞污腐熟劑的菌群組合，對于微生物菌劑質(zhì)量的提高、推進(jìn)肉鴨糞污微生物腐熟劑行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

1" 材料與方法

1.1" 材料

1.1.1" 鴨糞污腐熟劑" 實(shí)驗(yàn)室樣品取自德州、日照、菏澤、泰安等不同地區(qū)的8家不同養(yǎng)鴨場在用肉鴨糞污腐熟劑，分固體和液體兩種劑型，樣品采集后于4 ℃冰箱中保存。

1.1.2" 實(shí)驗(yàn)設(shè)備和儀器" 高壓滅菌鍋YX-280B（合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司）、恒溫水浴鍋DRHH-S4（上海程捷儀器設(shè)備有限公司）、恒溫培養(yǎng)箱SPX-250B-Z（上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司）、超凈工作臺SW-CJ-2D（北京中興偉業(yè)世紀(jì)儀器有限公司）、離心機(jī)TG16（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）、電子調(diào)溫爐1 000W（江陰市保利科研器械有限公司）、分析天平FA2204（上海津平科學(xué)儀器有限公司）、pH計(jì)PHB-4（上海儀電分析儀器有限公司）、漩渦震蕩儀Vortex-2（上海滬析實(shí)業(yè)有限公司）、PCR儀、超微量分光光度計(jì)Nanodrop、振蕩器HY-5A（常州市金壇區(qū)環(huán)宇科學(xué)儀器廠）以及三角瓶、吸管、量筒、酒精燈、涂布棒、移液槍、培養(yǎng)皿、移液管、燒杯等常規(guī)器具。

1.1.3" 培養(yǎng)基" 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、放線菌培養(yǎng)用高氏合成一號培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）。

1.1.4" 主要試劑" 氫氧化鈉（NaOH）、革蘭氏染色液、95%酒精、氯化鈉（NaCl）。

1.2" 方法

1.2.1" 菌株的分離純化" 將8種不同肉鴨糞腐熟劑各自混勻，準(zhǔn)確稱取10.0 g加入 90 mL 帶有玻璃珠的無菌生理鹽水中，200 r/min振蕩30 min，得到10-1稀釋液[16]；移液槍吸取1 mL混懸液加入9 mL無菌生理鹽水，梯度稀釋至10-9。分別吸取10-3、10-4、10-5稀釋液各0.1 mL于高氏合成一號培養(yǎng)基上，分別各吸取0.1 mL的10-6、10-7、10-8、10-9稀釋液于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基，用涂布棒涂布均勻，MRS培養(yǎng)基涂完后覆蓋一層45 ℃左右的MRS培養(yǎng)基并置于厭氧袋內(nèi)，將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、高氏合成一號培養(yǎng)基倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)，YPD瓊脂培養(yǎng)基封口后置于28 ℃恒溫培養(yǎng)[17]。注意：移液管等所用器具需滅菌處理，操作時試管口和移液管應(yīng)在離火焰1～2 cm處[18]。

將培養(yǎng)基上形成的單菌落根據(jù)菌落形態(tài)不同采用平板劃線法純化。接種環(huán)無菌操作沾取少許待分離的樣品，在無菌平板表面連續(xù)劃線，微生物數(shù)量將隨著劃線次數(shù)的增加而減少，經(jīng)培養(yǎng)后，可在平板表面得到單菌落。有時這種單菌落并非都由單個細(xì)胞繁殖而來的，故必須反復(fù)分離多次才可得到純化菌種[19]。

1.2.2" 分離的單菌株菌落形態(tài)" 將純化后的菌種，接種到相對應(yīng)培養(yǎng)基上，待長出單菌落，通過肉眼或顯微鏡觀察對其大小、形狀、顏色、質(zhì)地、表面性狀等進(jìn)行描述。并參照《伯杰氏手冊》《微生物分類學(xué)》等進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2.3" 分離的單菌株菌體形態(tài)" 革蘭氏染色：將培養(yǎng)好的待測菌株，挑取菌體均勻涂于潔凈的載玻片上，并微火固定制成涂片，染色干燥后鏡檢。

放線菌的鑒定參考《鏈霉菌鑒定手冊》[20]和《放線菌研究應(yīng)用》[21]。挑取單菌落，制作涂片，染色鏡檢；因?yàn)榉啪€菌是一種特殊的細(xì)菌，具有分支狀的菌絲體，革蘭氏染色后能清晰地看到其形態(tài)特征。

芽孢桿菌的鑒定參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[22]。

1.2.4" 分子生物學(xué)鑒定" 分子生物學(xué)鑒定采用16S rDNA序列分析，DNA提取步驟參考天根生化科技（北京）有限公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒。測序委托北京尤雅博生物技術(shù)有限公司。真菌的分子生物學(xué)鑒定采用18S rDNA序列分析，測序委托生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2.5" 腐熟劑有效菌含量測定" （1）稱取10.00 g的腐熟劑樣品，放入裝有90 mL帶有玻璃珠的無菌生理鹽水中，200 r/min振蕩30 min，得到10-1倍稀釋液；（2）根據(jù)需要進(jìn)行梯度稀釋，以獲得合適的菌濃度范圍；（3）取不同稀釋度的菌懸液，用移液器吸取100 μL均勻地涂布在培養(yǎng)基平板上。每個稀釋度涂布2～3個平板；（4）將平板置于適宜的溫度和條件下培養(yǎng)；（5）選擇菌落數(shù)在30～ 300之間的平板計(jì)數(shù)；（6）計(jì)算有效菌含量。計(jì)算公式：有效菌含量（CFU/g）=（菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)）÷樣品質(zhì)量。

2" 結(jié)果分析

2.1" 分離菌株的菌落形態(tài)

將分離菌株通過平板劃線法分別接種至對應(yīng)固體培養(yǎng)基上，待培養(yǎng)基上長出單菌落后，觀察、記錄菌落形態(tài)，結(jié)果見表1。

2.2" "分離菌株的菌體形態(tài)

分離菌株通過平板劃線分別接種至對應(yīng)固體培養(yǎng)基上，待長出單菌落后，采用革蘭氏染色法，顯微鏡觀察，結(jié)果見圖1。

2.3" 分離菌株的鑒定結(jié)果

通過對分離的菌株擴(kuò)增、序列檢測，測序結(jié)果通過NCBI的BLAST比對得出菌株鑒定結(jié)果，見表1。

2.4" 腐熟劑有效菌含量測定結(jié)果

觀察培養(yǎng)結(jié)束后的平板菌落生長情況。選擇菌落數(shù)在 30～300之間的平板計(jì)數(shù)。根據(jù)稀釋倍數(shù)和涂布體積，計(jì)算出每克腐熟劑樣品中的有效菌含量，結(jié)果見表1。

3" 討論

異位發(fā)酵床技術(shù)[23]作為一種可以有效解決畜禽糞污污染的技術(shù)，為我國畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展、畜禽糞污資源化利用提供了一個選擇。異位發(fā)酵床主要依靠微生物的新陳代謝發(fā)揮作用，其微生物群落組成非常復(fù)雜，包括各種細(xì)菌、真菌和放線菌等，它們不僅是發(fā)酵床物質(zhì)轉(zhuǎn)化的動力，而且對于實(shí)現(xiàn)發(fā)酵床功能、保證畜禽健康具有重要作用。而發(fā)酵床技術(shù)推廣面臨的難題之一是微生物菌種的選擇[24]。

本研究通過不同培養(yǎng)基采用傳統(tǒng)的平板劃線法和分子生物學(xué)鑒定法對市面上一些養(yǎng)鴨場正在使用的肉鴨糞污腐熟劑做了菌種結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示8種腐熟劑中，62.5%為復(fù)合微生物菌劑，37.5%為單一菌種，大部分采用了復(fù)合菌劑的形式。這也側(cè)面印證了何凌等[25]研究的復(fù)合菌種通過多種微生物共發(fā)酵以及協(xié)同作用使腐熟效果要遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于單一菌種的腐熟效果；因此，由多種微生物制備而成的復(fù)合菌劑與單一菌株構(gòu)成的微生物菌劑相比有著更大的優(yōu)勢，更符合市場的需求。復(fù)合菌劑菌種組合多為芽孢桿菌類、假單胞菌類和乳桿菌類，其中芽孢桿菌類主要以地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌為主，假單胞菌屬主要以脫氮假單胞菌為主，與周錦錦[26]研究發(fā)現(xiàn)的肉鴨糞腐熟劑中菌種多以纖維菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬為主的研究結(jié)果一致。很少一部分復(fù)合腐熟劑含有真菌類，例如從腐熟劑1中篩選出曲霉屬，與劉可[27]在促秸稈腐熟真菌篩選試驗(yàn)中曲霉屬對秸稈腐熟有較好效果的結(jié)論一致，陳立飛[28]的研究也表明微生物巢處理養(yǎng)豬糞污微生物群落結(jié)構(gòu)中曲霉屬在高溫期有較高豐度。單一菌種主要是枯草芽孢桿菌，有效菌含量達(dá)到了1011 CFU/g，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于復(fù)合微生物菌劑有效菌含量106～107 CFU/g，這也符合何秀紅、田鶴等[29-30]以牛羊屠宰剩余物為腐熟原料，通過添加不同濃度的芽孢桿菌增加微生物數(shù)量，使有利于腐熟發(fā)酵的微生物在短時間內(nèi)成為優(yōu)勢菌群，快速分解有機(jī)物從而達(dá)到提升腐熟效果。

在鴨糞污腐熟劑菌種復(fù)合上既要考慮微生物有效菌含量，通過增加微生物有效菌含量使其有利于腐熟發(fā)酵的微生物短時間內(nèi)成為優(yōu)勢菌群，也要針對鴨糞中主要成分的不同，篩選出具有特定降解功能的微生物菌株，通過微生物的協(xié)同作用使腐熟效果達(dá)到更佳。

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Investigation of the Fungal Community in Poultry Litter Fermentation Agent in Shandong Province

Zhao Xiaoyu1，Li Mingzhu 2，Xue Fei2，Tang Ruifa3，Liu Wenzhe4， Li Youzhi1，5，Tang Wenli 1，5

（1. Shandong Provincial Feed and Veterinary Drug Quality Inspection Center， Jinan" 250100，China;

2. Huo Wo De Yuan Environmental Technology（Jinan）Co.，Ltd.， Jinan" 250600，China;

3.Shandong Zhongxin Food Group Co.， LTD，Jinan" 250101，China;

4.Xintai Tianxin Agriculture and Animal Husbandry Development Co.，Ltd，Xintai" 271212，China;

5.Shandong Technology Innovation Center of Laying Hens， Jinan" 250102，China）

Abstract： This study aimed to investigate the microbial community structure of composting agents utilized in poultry manure management within Shandong Province. Eight different composting agents from biological duck farms located in Dezhou， Rizhao， Heze， Taian， and other regions were collected for analysis. These agents were inoculated onto nutrient agar， YPD agar， High One Synthesis Agar， and MRS agar using a plate streaking method for separation and purification. The bacterial strains were subsequently identified through 16S rDNA sequence analysis. Results indicated that among the eight composting agents available on the market in Shandong Province， 62.5% were composite formulations predominantly consisting of Bacillus sporothermodurans， Pseudomonas sp.， and Lactobacillus sp.， with strain counts typically ranging from 106 to 107 CFU/g; conversely， approximately 37.5% represented single-strain formulations primarily featuring Bacillus sporothermodurans at concentrations around 1011 CFU/g. This investigation elucidates the microbial community structure present in certain poultry manure composting agents within Shandong Province and provides a theoretical foundation for future development of these microbial communities.

Keywords： Poultry manure composting agents; microorganisms; microbial community structure

收稿日期：2024-10-14

基金項(xiàng)目：濟(jì)南市科技型中小企業(yè)創(chuàng)新能力提升工程；泰山產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新領(lǐng)軍人才工程專項(xiàng)（TSCX202211023）

第一作者：趙曉雨（1993—），畜牧師，從事飼料和獸藥產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)及標(biāo)準(zhǔn)修訂等工作，E-mail：zhao_xiaoyu2023@163.com并列第一作者，李明珠（1991—），主要從事有機(jī)固廢資源化利用研究，E-mail：1138574925@qq.com

通信作者：湯文利（1968—），研究員，從事飼料和獸藥產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)及標(biāo)準(zhǔn)制修訂等工作，E-mail：13905310419@163.com