摘要：運動發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis）是一種唯一通過ED途徑兼性厭氧發(fā)酵葡萄糖的微生物食品安全級菌株（GRAS），具有許多獨特的生理特征與優(yōu)良的工業(yè)生產(chǎn)特性.基于合成生物學方法和代謝工程改造，綜述運動發(fā)酵單胞菌獨特的生理特性及其在食品、醫(yī)藥等不同領(lǐng)域的應用，重點介紹運動發(fā)酵單胞菌益生效應因子及其涉及的拮抗效應、群體感應等方面的研究進展及瓶頸.同時探討持續(xù)開發(fā)、完善高效精準的基因編輯技術(shù)、理性和非理性設(shè)計代謝途徑定向調(diào)控方法及高通量篩選手段，在運動發(fā)酵單胞菌益生特性的發(fā)現(xiàn)以及生物治療與固氮等方面的突破，推動合成生物學理論研究和實踐生產(chǎn)的發(fā)展.

關(guān)鍵詞：運動發(fā)酵單胞菌; 益生效應; 群體感應; 底盤細胞; 合成生物學

中圖分類號：Q939.97

文獻標志碼：A

文章編號：1001-8395（2025）01-0015-13

doi：10.3969/j.issn.1001-8395.2025.01.002

運動發(fā)酵單胞菌是一種革蘭氏陰性兼性厭氧細菌，可將葡萄糖、果糖和蔗糖作為碳源進行發(fā)酵.該菌微好氧生長，大多呈直桿狀，尾端呈圓形或卵圓形，有1～4根鞭毛，常成對存在，但很少集結(jié)成短鏈狀;兼性厭氧條件生長，在無氧條件下生長最佳，有氧條件下也可生存;正常發(fā)酵溫度為30～37 ℃，在60 ℃下5 min可滅活.運動發(fā)酵單胞菌高度耐酸，可在pH3.5～7.5環(huán)境下生長，而pH值5.0～5.5的環(huán)境適合該菌發(fā)酵產(chǎn)乙醇[1].相對于釀酒酵母，運動發(fā)酵單胞菌因其基因組小、乙醇發(fā)酵速率高和對糖表觀收率高、乙醇耐受性好，以及生物安全性等獨特的生理特性受到研究人員的重視[2-3].近年來，運動發(fā)酵單胞菌作為纖維素類生物質(zhì)生物煉制能源的細胞工廠受到重視，是美國能源部國家可再生能源實驗室（NREL）研究的主要底盤細胞之一.

除了用于纖維素乙醇及平臺化合物生產(chǎn)，運動發(fā)酵單胞菌具有益生元的特性和功能且副產(chǎn)物低等優(yōu)點，在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域也逐漸受到重視（圖1）.傳統(tǒng)上，南美洲人習慣喝一種運動發(fā)酵單胞菌制成的飲料“Aguamiel”，主要用于治療腎臟和代謝疾病.早期Lindner[4]報道顯示，這種新鮮濃縮的龍舌蘭汁在熱帶地區(qū)相當于西方國家的益生菌飲料;并進一步報告了運動發(fā)酵單胞菌成功應用于治療牛的幾種疾病以及人類的化膿性癤和傷口.運動發(fā)酵單胞菌還可作為食品發(fā)酵烘焙領(lǐng)域中釀酒酵母的替代菌株，在釀酒酵母不耐型患者群體中具有潛在的應用價值[5].自20世紀初分離獲得該菌以來，研究人員已在生態(tài)學、生理生化、分子生物學、發(fā)酵動力學、基因組、轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)組學等方面做了大量的研究[6-11].研究報道表明，運動發(fā)酵單胞菌對許多細菌、絲狀真菌均具有明顯的拮抗作用，可有效治療慢性小腸結(jié)腸炎、慢性膀胱炎以及婦科感染引起的炎癥等細菌性疾病[1].

盡管目前研究人員針對運動發(fā)酵單胞菌已開展了一系列包括生理、遺傳及代謝工程改造方面的研究，特別是拓寬了其底物利用范圍及產(chǎn)物生成種類，但是與模式微生物菌株相比，運動發(fā)酵單胞菌

在益生特性及其效應因子的挖掘與定量、生物元件組裝、代謝路徑構(gòu)建與時空調(diào)控以及基因組編輯與優(yōu)化等領(lǐng)域才剛剛起步.本文綜述了運動發(fā)酵單胞菌作為一種生物安全性益生菌實現(xiàn)工業(yè)產(chǎn)品生產(chǎn)的獨特生理特性，重點介紹了其在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應用，總結(jié)了運動發(fā)酵單胞菌益生效應因子及其涉及的拮抗效應、合成與分泌等代謝機制的研究進展，同時探討了運動發(fā)酵單胞菌在遺傳學方法、基因編輯技術(shù)與工具等方面的進展及瓶頸，以及進一步開發(fā)運動發(fā)酵單胞菌成為優(yōu)良的細胞工廠，推動基于運動發(fā)酵單胞菌底盤細胞的合成生物學理論研究在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應用.

1"運動發(fā)酵單胞菌的益生特性及應用

運動發(fā)酵單胞菌已被證實具有良好的益生元和益生菌特性與功能，在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有很大的應用潛力.在食品發(fā)酵領(lǐng)域中，釀酒酵母細胞壁成分被認為是引起炎癥性腸病或克羅恩病的抗原，為了避免酵母不耐癥患者食用含酵母的面包引起過敏型應激反應，亟需尋找一種可代替面包酵母的食品級安全菌株應用于面包發(fā)酵[12].運動發(fā)酵單胞菌具有許多獨特的生理特性和優(yōu)良的工業(yè)生產(chǎn)特性，如高糖吸收率[13]、高乙醇產(chǎn)量[14]及良好的環(huán)境適應性[15]，且在釀造和發(fā)酵工業(yè)中顯示出與酵母相當?shù)膬?yōu)勢[16].由于野生型運動發(fā)酵單胞菌無法利用麥芽糖進行小麥面粉發(fā)酵，起初研究人員將運動發(fā)酵單胞菌作為食品添加劑與其他可食用發(fā)酵微生物共發(fā)酵，評估了運動發(fā)酵單胞菌在面包發(fā)酵中的糖利用效率和發(fā)酵效果[17-19].針對野生型運動發(fā)酵單胞菌無法利用麥芽糖的問題為運動發(fā)酵單胞菌與異型發(fā)酵型乳酸菌（Lactobacillus sanfranciscensis）摩爾比1∶1比例混合發(fā)酵提供了另一個策略[20].Musatti等[18-20]通過代謝組學對運動發(fā)酵單胞菌發(fā)酵小麥面團時產(chǎn)生的揮發(fā)性組分進行了檢測分析，結(jié)果表明運動發(fā)酵單胞菌能產(chǎn)生乙醇、乙酸、4-羥基-2-丁酮等類似傳統(tǒng)發(fā)酵劑的揮發(fā)性化學物質(zhì)，但發(fā)酵中添加NaCl會降低面團發(fā)酵效率與性能.Oda等[17]分別報道了面粉中蔗糖添加質(zhì)量比1∶20時運動發(fā)酵單胞菌表現(xiàn)出良好的發(fā)酵性能，可以有效地發(fā)酵面團，產(chǎn)期率和保留率分別為80%和85%，顯著地提高了最大面團高度2.6倍，這為無酵母發(fā)酵產(chǎn)品開發(fā)提供了新的途徑.此外，我們前期研究工作中利用ARTP誘變獲得的一株運動發(fā)酵單胞菌D95突變菌株與安琪酵母進行面包發(fā)酵性能比較分析試驗，結(jié)果表明單一運動發(fā)酵單胞菌可以實現(xiàn)代替釀酒酵母發(fā)酵面包，運動發(fā)酵單胞菌發(fā)酵面包含水量比酵母面包提高了1.63%，面包組織松軟潤口，具有良好的口感與烘培品質(zhì)[21].這些研究進一步為運動發(fā)酵單胞菌在食品發(fā)酵烘培中的應用奠定了基礎(chǔ).雖然運動發(fā)酵單胞菌的呼吸鏈速率很高，比常見的模式微生物大腸桿菌和釀酒酵母要高，但其生物學功能尚未完全解析.

近年來，運動發(fā)酵單胞菌益生元和益生菌的特性與功能在人類健康中的應用也受到了越來越多的重視并取得了一定的突破[22]，表現(xiàn)出很大的應用潛力.運動發(fā)酵單胞菌最初是從墨西哥的龍舌蘭酒（pulque）中分離獲得的[1]，可利用自身攜帶的果聚糖蔗糖酶（sacB）生成果聚糖（levan）和果寡糖（FOS）[23].果聚糖是一種天然的高分子多聚合物，在食品和醫(yī)藥上具有多重功效，如抗腫瘤、降血壓或發(fā)揮益生元功能[24-25].此外，果聚糖作為FOS的前體，經(jīng)酸水解可轉(zhuǎn)化為1-酮糖（1-kestose），6-酮糖（6-kestose）及耐斯糖（nystose）等低聚果糖，刺激內(nèi)生雙歧桿菌生長[26-27].除此之外，果聚糖還展現(xiàn)出能夠黏附胃黏膜、清除DPPH自由基，減少炎癥介質(zhì)分泌等益生功效[28-30].FOS也是一種益生元，具有調(diào)控腸道微生物菌群組成與活性發(fā)生特定改變的功能而有益于宿主健康[31-32].而最近研究報道表明，利用sacB酶還可以生產(chǎn)另一種益生元蔗果三糖的功能性產(chǎn)品[33].運動發(fā)酵單胞菌與酵母共發(fā)酵產(chǎn)生低酒精度碳酸飲品的開菲爾酒（Kefir）也是一種功能性保健飲品，又稱“菌菇（tibicos）”，中國天山地區(qū)tibicos單分子測序的研究結(jié)果表明，運動發(fā)酵單胞菌是其中的一種主要益生菌[34].除了龍舌蘭酒、開菲爾酒外，運動發(fā)酵單胞菌還可應用于藍莓酒、蜂蜜酒等.利用運動發(fā)酵單胞菌D95發(fā)酵的藍莓酒含有豐富的萜烯類風味物質(zhì)（約占70%）和山梨醇（質(zhì)量濃度33.94 g/L）[35].研究人員利用山梨醇飼喂小鼠，顯著地提高小鼠血漿胰島素濃度，降低空腹血糖水平，并改善了小鼠腸道微生物群落結(jié)構(gòu)，其中雙歧桿菌（Bifidobacterium）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）、凸腹真桿菌（Eubacterium ventriosum）、分段絲狀細菌（Candidatus arthromitus）、瘤胃球菌（Ruminococcus torques）顯著降低，螺桿菌屬（Helicobacter）、泰勒菌（Tyzzerella）、另枝菌屬（Alistipes）、普雷沃氏菌屬-9（Prevotella 9）含量增加[36].此外，臨床實驗觀察了便秘患者連續(xù)15 d服用運動發(fā)酵單胞菌發(fā)酵液后腸道功能與脂質(zhì)狀況，結(jié)果表明運動發(fā)酵單胞菌展現(xiàn)出有效降低膽固醇和血脂，促進腸道蠕動的益生功效[37].研究人員通過大鼠模型試驗評估了Z. mobilis UFPEDA-202的益生菌特性與生物安全性，結(jié)果表明運動發(fā)酵單胞菌是無致病性的安全食用菌株，對小鼠免疫功能具有明顯的改善調(diào)節(jié)作用[38].最近一項研究報道也進一步表明，飼喂外源性Z. mobilis可以緩解右旋糖酐硫酸鈉（DSS）誘導的小鼠結(jié)腸炎癥狀，如體重減輕、疾病活動指數(shù)、結(jié)腸重量/長度比顯著降低和組織病理學改善[39].此外，運動發(fā)酵單胞菌攜帶L-天門冬酰胺酶基因，其合成的L-天冬酰胺酶對白血病細胞具有毒性和抑制作用[40].運動發(fā)酵單胞菌這些益生特性推動了開發(fā)其成為益生菌的商業(yè)化生產(chǎn)，標準化發(fā)酵的運動發(fā)酵單胞菌原料可用于制備藥用膠囊型益生菌[41-42].

運動發(fā)酵單胞菌與其他微生物之間的拮抗作用的研究報道，該菌對多種革蘭氏陰性與陽性菌以及真菌具有廣譜的抗菌活性，其中包括金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、滕黃微球菌、黃曲霉菌等[43].大多數(shù)針對運動發(fā)酵單胞菌拮抗效應的研究報道都集中在人類疾病與炎癥治療方面，而僅一項研究表明運動發(fā)酵單胞菌對柑橘病原體黃單胞菌有抑制作用[44].一些研究表明，運動發(fā)酵單胞菌不僅可用于治療婦科疾病感染（如陰道炎），而且對引起腸道疾病感染的腸炎沙門氏菌、痢疾志賀氏菌和大腸桿菌等也具有明顯的拮抗活性，其發(fā)酵液可作為小腸結(jié)腸炎、膀胱炎的治療劑，起到緩解炎癥癥狀的作用[45-46].最近研究報道顯示，Z. mobilis可以改善小鼠腸道菌群，增加阿克曼氏粘桿菌（Ackermansia mucophilus）豐度，減少大腸桿菌積累，起到緩解結(jié)腸炎癥狀的作用[39].因此，運動發(fā)酵單胞菌對疾病感染的臨床應用表明，這種抗菌活性能夠在體內(nèi)發(fā)揮益生效果.運動發(fā)酵單胞菌能夠產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的事實也推動了對其在臨床治療潛力的研究.另外，運動發(fā)酵單胞菌拮抗效應也在釀酒發(fā)酵過程中發(fā)揮了積極作用.在棕櫚酒生產(chǎn)中，由于運動發(fā)酵單胞菌在整個釀酒發(fā)酵過程中占主導地位，腸桿菌在發(fā)酵初期就處于一個低水平的狀態(tài)，且隨著發(fā)酵的進行而持續(xù)減少[47].此外，病原性細菌單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、血清型傷寒沙門氏菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）、福氏志賀氏菌（Shigella flexneri）、索尼氏志賀氏菌（Shigella sonnei）以及金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）也被證明在生產(chǎn)龍舌蘭酒pulque過程中死亡[48].在所有這些情況下，抑制效應可能不僅是由于pH值降低、酒精積累上升等因素，運動發(fā)酵單胞菌產(chǎn)生的拮抗因子也發(fā)揮了一定的作用.發(fā)酵初期，運動發(fā)酵單胞菌數(shù)量增加45 d達到峰值，占總細胞數(shù)的60%;并伴隨著酵母豐度的上調(diào)而減少[1].這表明酵母活性可能對無糖條件下的運動發(fā)酵單胞菌具有拮抗作用，但具體機制仍有待闡明.

2"運動發(fā)酵單胞菌的拮抗因子及其群體感應

早期研究報道表明，運動發(fā)酵單胞菌可以抑制大腸桿菌交配伴侶的生長和結(jié)合能力，并在其治療應用潛力的研究與共培養(yǎng)過程中觀察到該菌可能產(chǎn)生一些未知的抗菌活性物質(zhì)[43].Lima等[45]推測Z. mobilis可能產(chǎn)生一種抗菌肽（Zymocins），但沒有對其進行純化和表征.此外，研究人員也通過一些實驗驗證過氧化氫、乳酸或抗生素是否與拮抗活性有關(guān)，然而這些研究均未取得成功.盡管自20世紀以來運動發(fā)酵單胞菌對治療疾病感染的拮抗效應已被證實，但仍未有證據(jù)表明運動發(fā)酵單胞菌能產(chǎn)生類似細菌素的多肽或化學物質(zhì).近期一項研究報道表明，運動發(fā)酵單胞菌的拮抗活性分子排除其細菌素樣肽的性質(zhì)，而是一種在好氧條件下通過呼吸鏈進行合成的耐熱低分子量（低于3 kDa）化合物，且對蛋白酶處理具有耐受性[47].其中丙酸鹽和醋酸鹽在運動發(fā)酵單胞菌抗菌活性中起核心作用.然而，運動發(fā)酵單胞菌基因組并不攜帶產(chǎn)丙酸鹽的琥珀酸、丙烯酸酯、1，2-丙二醇或檸檬酸途徑的完整基因，以及其編碼參與醋酸合成的脫氫酶基因仍需要被識別[49].另外，研究結(jié)果也未完全排除呼吸系統(tǒng)分解代謝中一些未知的低分子量抑制副產(chǎn)物的參與.

細菌之間主要通過被定義為自誘導劑（AI）的化學信號分子進行相互交流，而產(chǎn)生和釋放的小分子通常被認為是“話語”，可以到達其他細胞并引出“答案”，這個過程稱為群體感應（QS）[50-51].這些“話語”分子一般包括革蘭氏陰性菌的N-?；呓z氨酸內(nèi)酯（AHLs）和革蘭氏陽性菌的寡肽（Oligopeptides）[52].另外，許多細菌可以使用一種與寡肽和AHLs自誘導劑（具有物種特異性結(jié)構(gòu)和活性）相反的QS信號分子自誘導劑II（AI-2）[53-55].AI-2是由S-核糖素同型半胱氨酸酶（LuxS）和5’-甲基硫腺苷/S-腺苷同型半胱氨酸核苷酶（Pfs）介導的兩步合成反應產(chǎn)生的甲基循環(huán)副產(chǎn)物[56]，可以觸發(fā)革蘭氏陰性和陽性菌的QS反應，并被認為構(gòu)成一個跨物種特異性的細菌交流系統(tǒng)，甚至能影響自身不能產(chǎn)生自誘導劑的細菌.與Pfs和LuxS介導的兩步法不同，運動發(fā)酵單胞菌采用一步法水解方式分解S-腺苷-l-同型半胱氨酸（SAH）完成甲基循環(huán)，從而導致細胞無法產(chǎn)生AI-2[57-58].運動發(fā)酵單胞菌作為一個生物燃料工業(yè)生產(chǎn)的候選菌株，具有一系列Mo依賴性生物固氮系統(tǒng)，能夠在不影響乙醇的情況下進行有效地固氮[59-60].研究報道表明，雖然Z. mobilis細胞不能產(chǎn)生AI-2，但能對外源自誘導劑AI-2作出響應，其生長速度與基因表達譜均發(fā)生顯著性變化[52]，這可能是為了適應固氮的高能量需求.另外，AI-2依賴性QS的激活會直接影響運動發(fā)酵單胞菌葡萄糖攝取、生物固氮、相對乙醇產(chǎn)量及生物量積累等重要生物學過程，誘導Z. mobilis細胞的代謝通量更傾向于乙醇的產(chǎn)生而不是生物量的積累.這種獨特的糖代謝途徑可能和運動發(fā)酵單胞菌能量產(chǎn)生與生長部分耦聯(lián)現(xiàn)象相關(guān)，即其能量的產(chǎn)生率和利用率之間不完全關(guān)聯(lián).因此，運動發(fā)酵單胞菌可以利用氮氣作為氮源取代工業(yè)肥料，并伴隨葡萄糖-生物量的減少和葡萄糖-乙醇轉(zhuǎn)化率增加，預計可為纖維素乙醇生產(chǎn)節(jié)省超過100萬美元/年的經(jīng)濟效益[59].然而，目前關(guān)于運動發(fā)酵單胞菌生物固氮的調(diào)控機制知之甚少.我們前期研究工作在N2固定條件下對Z. mobilis進行了蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)乙?；母咄糠治霭l(fā)現(xiàn)，蛋白乙酰化在調(diào)控運動發(fā)酵單胞菌生物固氮代謝的各方面發(fā)揮重要作用[61].此外，運動發(fā)酵單胞菌作為釀酒酵母生產(chǎn)纖維素乙醇的潛在替代品，具有輔助因子平衡的優(yōu)勢，但其對木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物中副產(chǎn)物和抑制劑的耐受性較低，這也限制了其應用.最近一項研究報道通過Z. mobilis ZM4細胞中異源共表達大腸桿菌（Escherichia coli）Pfs/LuxS蛋白酶產(chǎn)生AI-2信號分子，以達到促進運動發(fā)酵單胞菌產(chǎn)生更多的生物膜，提升運動發(fā)酵單胞菌對乙酸脅迫的耐受性的效果[62].與之前研究報道相矛盾的是，該研究結(jié)果顯示內(nèi)源或外源性AI-2并不影響運動發(fā)酵單胞菌ZM4的生長、生物膜形成、運動性及抗逆性，但單獨表達Pfs蛋白酶卻可以顯著地提高生物膜形成與細菌運動性.這可能是由于Pfs利用低濃度SAH抑制了甲基化DNA積累.

3"運動發(fā)酵單胞菌底盤細胞構(gòu)建與合成

運動發(fā)酵單胞菌具有基因組小、遺傳操作工具基本完備、安全性高、環(huán)境脅迫耐受性強及副產(chǎn)物低等獨特的生理特征，除有利于其在食品、醫(yī)藥等生產(chǎn)領(lǐng)域中的應用外，已作為底盤細胞用于開發(fā)多種平臺化合物生產(chǎn)，有助于理解微生物底盤細胞代謝的精準調(diào)控.碳、氮元素是地球生物化學循環(huán)的重要組成部分，與地球的能源與環(huán)境息息相關(guān)，利用微生物進行碳、氮固定具有重要意義.運動發(fā)酵單胞菌具備一系列完整的Mo固氮酶系統(tǒng)，能夠在N2為唯一氮源進行固氮的前提下，通過合成生物學手段引入外源的固碳途徑，構(gòu)建出目前自然界尚不多見的微生物工程菌，將有可能實現(xiàn)氮氣和二氧化碳的共同利用.然而，固氮過程受復雜的調(diào)控作用，并進化出了自身獨特的氧保護機制，目前關(guān)于固氮過程的合成生物學取得了一定的研究進展，但仍處于理論探索階段.此外，碳，氮的固定過程都需要很高的能量消耗，盡管運動發(fā)酵單胞菌可以利用F型ATP合成酶（F0F1-type ATPase）通過質(zhì)子梯度產(chǎn)生ATP，但其較低的氧化磷酸化產(chǎn)能效率是一個富有挑戰(zhàn)性的難點.早期Amador-Noguez等[63]提出了運動發(fā)酵單胞菌的固氮調(diào)控機制，為固氮調(diào)控機制的深入研究奠定了理論基礎(chǔ).基于運動發(fā)酵單胞菌全基因組小、可操作遺傳體系成熟、安全性等優(yōu)勢，利用內(nèi)，外源性CRISPR-Cas基因編輯、熒光報告基因元件等遺傳轉(zhuǎn)化方法與技術(shù)，將其作為底盤細胞推動生物固氮系統(tǒng)中氧保護機制、固氮基因簇簡化、固氮催化元件及調(diào)控元件的挖掘與鑒定等固氮代謝機制的研究，是未來合成生物學值得拓展的研究方向，在利用二氧化碳和氮氣發(fā)酵生產(chǎn)目標化合物具有很大的應用潛力.

3.1"運動發(fā)酵單胞菌遺傳改造工具包

目前針對非模式菌運動發(fā)酵單胞菌已開發(fā)了多種基因組編輯的遺傳改造工具，分為隨機突變（物理誘變、化學誘變、轉(zhuǎn)座子突變及適應性進化）和理性設(shè)計.早期研究通過亞硝基胍（NTG）化學誘變劑成功獲得了運動發(fā)酵單胞菌高乙酸耐受菌株AcR與具有絮凝性狀的菌株ZM401[64-65].同時，Typas等[66]利用自殺型載體攜帶的微型轉(zhuǎn)座子對運動發(fā)酵單胞菌染色體進行定向突變，成功地獲得了穩(wěn)定的運動發(fā)酵單胞菌營養(yǎng)缺陷型菌株，隨后Tn5、Tn10、Tn951等轉(zhuǎn)座子及ISZm1068插入元件也相繼被開發(fā)應用[67-68].何明雄團隊[69]在前期工作中將ARTP介導的誘變方法應用于運動發(fā)酵單胞菌，篩選獲得了一株可耐受pH3.5的突變菌株P(guān)H1-29，該方法具有安全、有效等優(yōu)點.此外，適應性進化（ALE）作為提高馴化菌株性狀最有效的誘變方法之一，可以提高馴化菌株耐受能力或魯棒性，在運動發(fā)酵單胞菌中已被廣泛應用.在運動發(fā)酵單胞菌對乙酸和糠醛耐受性上，我們研究工作利用基因組改組技術(shù)通過ALE篩選獲得了耐受質(zhì)量分數(shù)7 g/L的乙酸和3 g/L的糠醛的突變菌株[70].最近，Das課題組[71]利用ALE技術(shù)篩選出了一株葡萄糖與木糖共利用效果最好的菌株AD50.

理性設(shè)計借助認知或系統(tǒng)生物學數(shù)據(jù)學習進行推測，利用穿梭質(zhì)粒過表達或基因編輯等技術(shù)手段將目標生物元件、設(shè)計理念及代謝通路導入底盤細胞或直接對底盤細胞進行遺傳改造.目前研究人員已在運動發(fā)酵單胞菌中構(gòu)建了一系列穿梭質(zhì)粒，并成功地表達目的基因，建立了成熟的相關(guān)質(zhì)粒構(gòu)建組裝方法，如Gibson和BioBrick組裝方法[3].運動發(fā)酵單胞菌最常使用的質(zhì)粒主要包括：一是在大腸桿菌-運動發(fā)酵單胞菌之間存在并復制繁殖的穿梭質(zhì)粒[72-73]，這種質(zhì)粒往往骨架太大，導致轉(zhuǎn)化效率偏低;二是基于革蘭氏陰性細菌宿主的廣譜性質(zhì)粒，這類質(zhì)粒包含宿主識別的復制子與mob基因，一般采用結(jié)合轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至運動發(fā)酵單胞菌中，如pBBR1MCS-2質(zhì)粒[74-75].何明雄團隊[76]利用Golden Gate方法通過限制內(nèi)切酶識別將含酶切序列的特異性接頭序列連接在啟動子Padh2、終止子序列Tpdc及綠色熒光報告基因gfp序列兩側(cè)，成功地構(gòu)建了綠色熒光蛋白表達的定向組裝與表達的“One-POT”多DNA片段無痕連接組裝方法，這為實現(xiàn)運動發(fā)酵單胞菌中多基因多途徑組裝奠定了基礎(chǔ).隨著質(zhì)粒及抗性基因的深入研究，質(zhì)粒大小越來越小，目前廣泛應用的pEZ15Asp穿梭質(zhì)粒骨架大小只有3 kb，含有大腸桿菌和運動發(fā)酵單胞菌體內(nèi)復制的復制子、壯觀霉素抗性篩選標記及BioBrick酶切位點[77]，這也有利于遺傳操作與構(gòu)建代謝通路.此外，同源重組作為運動發(fā)酵單胞菌中基因插入失活或基因替換的常用方法之一，已被應用于目的基因失活菌株的構(gòu)建，如ndh-1菌株、sacC-1菌株及限制修飾系統(tǒng)（R-M）失活菌株[78-81].同時，研究人員利用FLP重組酶或sacB篩選方法也成功消除了質(zhì)粒上引入的抗性基因[3，82-83].運動發(fā)酵單胞菌中除了常用的篩選標記壯觀霉素（Spectinomycin）、四環(huán)素（Tetracycline）、氯霉素（Chloromycetin）及卡那霉素（Kanamycin），運動發(fā)酵單胞菌ZM4的泛酸營養(yǎng)缺陷型標記的發(fā)現(xiàn)也有助于在運動發(fā)酵單胞菌中通過營養(yǎng)缺陷型標記篩選目標突變菌株[84].Kiley課題組[75]開發(fā)出基于同源重組和質(zhì)粒丟失的兩步無痕編輯技術(shù)，成功地敲除了乳酸脫氫酶基因ldh和纖維素合成酶操縱子bcsABC，并插入了鏈孢紅素操縱子，實現(xiàn)無抗性基因菌株的構(gòu)建.然而，這些方法步驟較為繁雜，時間周期長，而且編輯效率不高.

簇狀規(guī)律間隔短回文重復序列CRISPR系統(tǒng)廣泛存在于原核生物中，提供宿主抗病毒感染的適應性免疫[85].目前，研究人員已在運動發(fā)酵單胞菌中開發(fā)了多種基于CRISPR的基因編輯技術(shù)，極大推動了運動發(fā)酵單胞菌底盤細胞開發(fā).2017年，Cao等[86]將CRISPR-Cas9引入運動發(fā)酵單胞菌，構(gòu)建pSUZM2a-Cas9質(zhì)粒表達來自于化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的Cas9基因，并在T7啟動子帶動表達的單鏈RNA介導下成功地消除運動發(fā)酵單胞菌的內(nèi)源性質(zhì)粒.Shen等[87]利用鏈霉菌（Francisella novicida）中Cas12a（Cpf1）蛋白在運動發(fā)酵單胞菌ZM4中構(gòu)建了誘導表達Cpf1蛋白的基因編輯重組菌株，引導RNA在雙鏈DNA靶位點進行切割，實現(xiàn)運動發(fā)酵單胞菌中內(nèi)源性質(zhì)粒消除、基因缺失及堿基替換等基因編輯操作，為運動發(fā)酵單胞菌的功能基因組研究和菌株改良提供了一種普適性的基因組編輯工具.同時，該工具還被用于精準調(diào)控代謝工程，建立了運動發(fā)酵單胞菌ZM4中乳酸生物合成途徑.另外，研究人員利用一種可編程的基因沉默系統(tǒng)CRISPR干擾（CRISPRi），精確調(diào)控基因抑制的時機和程度，并探究了運動發(fā)酵單胞菌生長必需、糖酵解，以及異丁醇耐受性相關(guān)基因的功能，使基因功能研究更加便捷[88].由于外源性編輯酶的CRISPR-Cas系統(tǒng)對宿主細胞有一定的毒性副作用，開發(fā)內(nèi)源性CRISPR-Cas系統(tǒng)是有效解決這一障礙的方法.不同于異源表達外源Cas蛋白，內(nèi)源性CRISPR-Cas系統(tǒng)如I-F型CRISPR-Cas系統(tǒng)也同樣表現(xiàn)出優(yōu)異的基因編輯能力，可以有效地實現(xiàn)基因敲除、替換、原位核苷酸修飾等基因編輯方式，提高了運動發(fā)酵單胞菌中基因編輯效率，為構(gòu)建合成生物學底盤細胞提供有力的技術(shù)支撐[89].Geng等[90]利用內(nèi)源性I-F型CRISPR-Cas系統(tǒng)成功敲除了運動發(fā)酵單胞菌的4個內(nèi)源性質(zhì)粒，并進一步研究結(jié)果顯示突變菌株ZMNP比野生型表現(xiàn)出更好的脅迫耐受能力.此外，研究人員[91]在內(nèi)源性I-F型系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，開發(fā)了一種CRSPR-Cas3基因編輯方法，在原位引入Cas3突變體能夠引發(fā)雙鏈斷裂從而達到實現(xiàn)目標基因編輯.我們團隊與華中農(nóng)業(yè)大學彭楠課題組[92-93]合作研究發(fā)現(xiàn)，運動發(fā)酵單胞菌可以利用微同源介導的末端連接（MMEJ）途徑修復了I-F型CRISPR-Cas系統(tǒng)介導的DNA斷裂，在此基礎(chǔ)上開發(fā)了一種簡單且有效的聯(lián)合內(nèi)源性I-F系統(tǒng)和MMEJ修復方式的新型基因編輯工具.然而，近期何明雄團隊[94]在運動發(fā)酵單胞菌中利用CRISPR系統(tǒng)對基因進行編輯時發(fā)現(xiàn)存在基因逃逸現(xiàn)象，這也表明充分的驗證方法對于獲得目標陽性菌株至關(guān)重要.

利用CRISPR-Cas技術(shù)進行目標基因編輯后，質(zhì)粒的快速消除是不可或缺的一環(huán)，也是制約多輪基因編輯的一個重要瓶頸.傳統(tǒng)常用的質(zhì)粒消除策略基于編輯質(zhì)粒具有一定毒性副作用及質(zhì)粒之間不相溶性，通過無抗性培養(yǎng)基連續(xù)傳代培養(yǎng)，最終獲得質(zhì)粒消除的基因編輯菌株，但操作繁瑣、效率低且耗時長，制約了CRISPR-Cas系統(tǒng)的高效、快速及連續(xù)應用.為了解決這一問題，溫敏型復制子替換是策略之一，通過溫度升高抑制溫敏型復制子輔助編輯質(zhì)粒的消除[95].近期，何明雄團隊[96]開發(fā)了基于茶堿依賴型核糖開關(guān)D（RSD）的編輯質(zhì)粒消除策略，在37 ℃下進行液態(tài)和固態(tài)培養(yǎng)基交替培養(yǎng)可以高效消除編輯質(zhì)粒.反篩標記也能用來輔助編輯質(zhì)粒消除.運動發(fā)酵單胞菌中苯丙氨酸-tRNA合成酶的α亞基PheS，能夠氨酰化苯丙氨酸，而其突變體PheS*則氨?；卸颈奖彼犷愃莆颬-氯苯丙氨酸（4-CP）.由強啟動子Pgap驅(qū)動的PheS表達可以誘導運動發(fā)酵單胞菌對4-CP產(chǎn)生足夠的敏感性，借此能輔助運動發(fā)酵單胞菌基因編輯后質(zhì)粒的快速消除[97].此外，利用邏輯線路誘導調(diào)控編輯質(zhì)粒gRNA表達也是實現(xiàn)質(zhì)粒消除的可行性策略，且已被應用于枯草芽孢桿菌中[98]，但目前該誘導型啟動子系統(tǒng)存在不同程度的滲漏.因此，篩選適用于運動發(fā)酵單胞菌且更加嚴謹?shù)幕蛐碌恼T導型啟動子，以及構(gòu)建結(jié)合轉(zhuǎn)錄與翻譯水平多層面調(diào)控的邏輯路線，可能是更加有效地實現(xiàn)編輯質(zhì)?？焖傧牟呗?

另外，限制修飾R-M系統(tǒng)是一種保護宿主細胞免于外來DNA入侵的免疫系統(tǒng)，可以破壞細菌體內(nèi)外源性DNA，改變細菌對外源性DNA的攝取能力.前期研究結(jié)果表明，運動發(fā)酵單胞菌中限制修飾R-M系統(tǒng)可以通過調(diào)控內(nèi)源R-M系統(tǒng)或外源性DNA甲基化狀態(tài)影響外源質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化率.運動發(fā)酵單胞菌中IV型R-M系統(tǒng)編碼甲基轉(zhuǎn)移酶和限制性內(nèi)切酶的基因mrr（ZMO0028）失活，可提高甲基化質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化效率60倍，而且不影響宿主細胞的生長率與生物量;而R-M系統(tǒng)I型負責識別非甲基化或錯誤甲基化修飾DNA的S亞基編碼基因ZMO1933失活雖然也可提高非甲基化質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化效率30倍，但會影響細胞生長[81].何明雄團隊[79]前期研究結(jié)果也顯示，在運動發(fā)酵單胞菌突變菌株Zm1933和Zmmrr中甲基化質(zhì)粒pBRR1MCS-tet電轉(zhuǎn)化率分別提高了2和17倍.另外，楊世輝團隊[89]研究發(fā)現(xiàn)，相對于野生型菌株，基因敲除的菌株ΔZMO0028中pEZ15Asp質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化率提高了90倍，同時ZMO0028基因敲除前提下所有基因編輯操作效率均得到了明顯的提升：單基因敲除效率達100%，10 kb以上的DNA片段編輯效率從12.5%提升至50%，這表明運動發(fā)酵單胞菌中限制修飾R-M系統(tǒng)不僅影響外源性DNA的轉(zhuǎn)化效率，而且影響CRISPR-Cas編輯工具的效率.此外，白鳳武團隊[83]在運動發(fā)酵單胞菌中雙敲除ZMO0028和ZMO1933基因，在不影響菌株生長、乙醇產(chǎn)量及絮凝性能的情況下大幅提高了甲基化和非甲基化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率.

3.2"運動發(fā)酵單胞菌底盤細胞工廠構(gòu)建

高通量快速篩選得到目的菌株是合成生物學細胞工廠邏輯設(shè)計研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[99].傳統(tǒng)篩選方法通常以目標代謝產(chǎn)物為主線，通量少、效率低及時間與人力成本高，而構(gòu)建高通量自動化篩選平臺技術(shù)不僅能夠提高篩選效率，還可以減少人為誤差與提高準確度.目前，基于Bioscreen C的高通量微量生長篩選系統(tǒng)已應用于運動發(fā)酵單胞菌，可以同時檢測200種不同篩選條件對菌株生長的影響[100].此外，基于高通量微生物液滴微控流平臺（MMC）的全自動傳代篩選技術(shù)也被用于遺傳改造后優(yōu)勢菌株的快速自動化馴化篩選[101].近年來，除了基于表型篩選技術(shù)，江南大學研究人員[102]利用赤蘚糖醇應答轉(zhuǎn)錄因子EryD開發(fā)了動態(tài)特異性響應的傳感器-調(diào)節(jié)器系統(tǒng)，構(gòu)建了基于赤蘚糖醇生物傳感的高通量篩選與鑒定方法.此外，趙惠民團隊[103]實現(xiàn)了利用釀酒酵母關(guān)鍵代謝產(chǎn)物丙二酰輔酶A傳感器FapR與相應的操縱子fap檢測細胞內(nèi)丙二酰輔酶A水平轉(zhuǎn)換為熒光信號的強度.然而，目前運動發(fā)酵單胞菌中仍缺乏這些基于生物傳感器的高通量篩選技術(shù)，因此建立相關(guān)方法可應用于運動發(fā)酵單胞菌突變體文庫的篩選、微生物生理代謝、發(fā)酵工藝優(yōu)化及適應性馴化研究，促進生物元件預測、邏輯路線設(shè)計、代謝工程改造以及細胞工廠構(gòu)建與性能評估.

原核生物通過多種精細代謝調(diào)控機制，包括基因、轉(zhuǎn)錄及翻譯與翻譯后水平的調(diào)控等，使其能更加良好地適應環(huán)境.傳統(tǒng)代謝工程中通常無需感知細胞內(nèi)外環(huán)境，直接采用特定強度的組成型啟動子元件和核糖體結(jié)合位點RBS對特定基因在轉(zhuǎn)錄與翻譯水平上進行調(diào)控，這類代謝調(diào)控一般稱為靜態(tài)調(diào)控[104].目前關(guān)于運動發(fā)酵單胞的菌靜態(tài)調(diào)控研究與應用相對較多，如常用的強啟動子gap、pdc、eno、adhB等通過過表達或抑制目的基因，調(diào)控目標代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量或增強抑制物耐受性[3，105].此外，Contreras等[106-107]利用生物信息學方法對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行生物元件挖掘與鑒定，發(fā)現(xiàn)了運動發(fā)酵單胞菌中存在與遺乙醇、乙酸及木糖脅迫相關(guān)的36個5’UTR，其中UTR_ZMO0347被證實在乙醇脅迫條件下具有調(diào)控下游基因hfq表達下調(diào)的功能，這為脅迫環(huán)境中運動發(fā)酵單胞菌應答調(diào)控網(wǎng)絡的研究提供了新思路，首次提出了運動發(fā)酵單胞菌中sRNA-sRNA及sRN-protein之間相互作用的調(diào)控網(wǎng)絡，并進一步解析了Zms4和Zms6兩個sRNA對乙醇生成的調(diào)控機制.然而，這些靜態(tài)調(diào)控過程可能會引起細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡的絮亂且無法對外界環(huán)境的改變做出應激響應.因此，研究人員開發(fā)了基于動態(tài)調(diào)控策略的系統(tǒng)，即通過感應相關(guān)信號分子的改變，動態(tài)調(diào)控代謝途徑中關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄表達，在發(fā)酵工業(yè)中得到了良好的應用.這些系統(tǒng)包括乳糖操縱子、色氨酸操縱子及λ噬菌體中T7轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)及PLPR-Clts857溫敏型啟動子等.曹志軍團隊[108]通過兩步法利用PLPR-Clts857溫敏型啟動子系統(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸，發(fā)酵前期在40 ℃打開noxE基因的表達閥，隨后在34 ℃關(guān)閉該啟動子抑制細胞生長，從而將丙酮酸產(chǎn)量提高到93.0 g/L.此外，陳國強團隊[109]研究開發(fā)了一種利用熱失活蛋白酶和冷失活REV敏感轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄翻譯水平上調(diào)控特定基因表達的系統(tǒng)，并引入專一性水解殘留或泄漏表達蛋白的水解酶模塊進一步加強該系統(tǒng)的嚴謹性，嚴格調(diào)控基因表達，使得該系統(tǒng)在基礎(chǔ)研究、生物醫(yī)學及工業(yè)領(lǐng)域應用具有巨大的潛力.除上述兩種動態(tài)調(diào)控系統(tǒng)之外，細胞自主誘導型調(diào)控系統(tǒng)也被關(guān)注與開發(fā)應用.中山大學劉建忠團隊[110]利用群體感應（QS）系統(tǒng)動態(tài)調(diào)控4-羥基苯乙酸代謝途徑，將產(chǎn)量提高至（17.39±0.26） g/L.Tsuge課題組[111]開發(fā)了乳酸脫氫酶基因ldhA厭氧誘導性啟動子調(diào)控碳代謝流的系統(tǒng)，有氧條件下碳流重定向至磷酸戊糖途徑（PPP）生成大量的NADPH，實現(xiàn)了1，5-戊二胺生產(chǎn)的有氧響應開關(guān)，顯著地提高了其生產(chǎn)速率，而在進入?yún)捬蹼A段后使得碳流重新轉(zhuǎn)向糖酵解途徑，繼續(xù)生產(chǎn)琥珀酸，使得單一菌株通過兩步分階段發(fā)酵生產(chǎn)不同代謝產(chǎn)物成為可能，降低了成本.目前關(guān)于運動發(fā)酵單胞菌動態(tài)調(diào)控系統(tǒng)的研究較少，已有成功應用的案列“四環(huán)素誘導型啟動子Ptet”.運動發(fā)酵單胞菌中首次將該誘導型啟動子應用于2，3-丁二醇的代謝調(diào)控，并隨后被應用于構(gòu)建雙熒光報告基因及異丁醇代謝途徑的調(diào)控[112-113].此外，Landick等[114]在運動發(fā)酵單胞菌中利用lacIq基因與PT7Al-O34啟動子通過誘導性調(diào)控丙酮酸脫羧酶Pdc基因的轉(zhuǎn)錄表達，實現(xiàn)了運動發(fā)酵單胞菌碳代謝流的定向控制.因此，通過構(gòu)建精準代謝調(diào)控，有利于更好地在時空序列上調(diào)控運動發(fā)酵單胞菌中靶向途徑的代謝通量，發(fā)揮底盤細胞工廠的優(yōu)勢性能.

4"展望

總而言之，基于安全、環(huán)境適應性強、有益生元功能特性以及副產(chǎn)物低等優(yōu)勢特點，運動發(fā)酵單胞菌不僅已在食品、醫(yī)藥及工業(yè)領(lǐng)域等取得了一系列相關(guān)成果.而相對于大腸桿菌、釀酒酵母等模式菌株，運動發(fā)酵單胞菌基因組小、代謝途徑單一及攜帶獨特的生物固氮能力，已開發(fā)出了一系列包括CRIPSR-Cas基因編輯系統(tǒng)在內(nèi)的遺傳工具包及系統(tǒng)與生物合成學研究方法，積累了大量的轉(zhuǎn)錄組、蛋白組及代謝組等生理生化及系統(tǒng)生物學信息，有望開發(fā)成一個高效且安全的商業(yè)化底盤細胞工廠，尤其是生產(chǎn)乳酸、果聚糖等益生元的高效細胞工廠;還能結(jié)合其拮抗效應拓展運動發(fā)酵單胞菌在生態(tài)農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中的研究與應用.此外，我們對于運動發(fā)酵單胞菌生物固氮及益生拮抗效應機制還了解較少，在基因轉(zhuǎn)錄時空表達網(wǎng)絡與動態(tài)調(diào)控機制等基礎(chǔ)研究、高通量基因編輯與代謝精準調(diào)控以及智能發(fā)酵工藝與模塊化控制等方面將是今后重點研究方向.研究內(nèi)容包括解析制約遺傳轉(zhuǎn)化效率的分子機制及解決方案與策略，結(jié)合系統(tǒng)生物信息學與人工智能學習等方法對多組學數(shù)據(jù)進行剖析，挖掘生物功能元件，優(yōu)化包括雙報告基因系統(tǒng)在內(nèi)的定量檢測體系，構(gòu)建生物元件、邏輯路線及代謝通量組裝與性能檢測等模型，建立防泄漏生物安全體系等，為最終構(gòu)建高效且安全的底盤細胞工廠的理性設(shè)計與應用提供指導與支撐.

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The Probiotic Antagonistic Effects of Zymomonas mobilis：

Current Advance and Perspectives

HE Mingxiong1，2，"ZHUANG Yong1，"CHEN Mao1，"LI Jianting1，"WU Bo1，

GONG Guiping1，"QIN Han1，"LIU Linpei1，"TAN Furong1

（1. Biomass Energy Technology Research Centre， Biogas Institute of Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Chengdu 610041， Sichuan;

2. Key Laboratory of Development and Application of Rural Renewable Energy， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Chengdu 610041， Sichuan）

Zymomonas mobilis， as a food-safe strain generally regarded as safe （GRAS）， uniquely ferments glucose via Entner-Doudoroff （ED） pathway under anaerobic conditions. It possesses many unique physiological characteristics and excellent industrial production properties. Based on synthetic biology methods and metabolic engineering， this paper reviewed the unique physiological characteristics of Zymomonas mobilis and its applications in different fields such as food and medicine. It focused on the research progress and bottlenecks of probiotic effectors in Zymomonas mobilis， including their involvement in antagonistic effects and quorum sensing. Additionally， it also discussed the continuous development and improvement of high-efficiency and precise gene editing technologies， rational and irrational design methods for directional regulation of the metabolic pathway and high-throughput screening methods. These advancements aim to promote breakthroughs in the probiotic characteristics of Zymomonas mobilis， as well as in its application areas such as biomedicine and nitrogen fixation， thereby driving the development for theory research and practical production of the synthetic biology.

Zymomonas mobilis; probiotic effects; quorum sensing; chassis cells; synthetic biology"（編輯"周"?。?/p>