摘要：分子標(biāo)記是DNA水平遺傳變異的直接反映，被廣泛應(yīng)用于分子育種、物種多樣性分析及親緣關(guān)系鑒定、雜種優(yōu)勢(shì)分析等研究。以高通量植物樣本采集、高通量提取植物基因組DNA以及高通量快速檢測(cè)技術(shù)這三大關(guān)鍵環(huán)節(jié)為主，全面梳理分子標(biāo)記檢測(cè)的完整流程，并深入剖析當(dāng)前各個(gè)環(huán)節(jié)的現(xiàn)狀與挑戰(zhàn)。同時(shí)，對(duì)植物分子標(biāo)記的高通量快速檢測(cè)過程進(jìn)行了歸納與展望，旨在為未來檢測(cè)流程的優(yōu)化與創(chuàng)新提供有力的理論支撐，推動(dòng)相關(guān)技術(shù)的不斷進(jìn)步與完善。

關(guān)鍵詞：分子標(biāo)記；高通量；SNP；KASP

Research Progress on High-Throughput Rapid Detection

Technology for Plant Molecular Markers

WANG Pan

（Shanghai ZKW Molecular Breeding Technology Co.，Ltd.，Shanghai 200030）

全球種業(yè)的發(fā)展經(jīng)歷了原始育種、雜交育種、分子育種3個(gè)時(shí)代，正在邁向更為前沿的4.0智能育種時(shí)代[1-3]。從當(dāng)前的育種形勢(shì)可以看出，一些大型的跨國(guó)種子公司和國(guó)外規(guī)模較大的實(shí)驗(yàn)室已較早地進(jìn)入種業(yè)4.0時(shí)代。相較之下，我國(guó)種業(yè)尚處在從雜交選育為主導(dǎo)，逐步融入分子技術(shù)輔助選育的2.0到3.0過渡階段[4]。在分子標(biāo)記的輔助下，育種工作者可實(shí)現(xiàn)高密度遺傳圖譜的構(gòu)建、QTL定位與主效基因的挖掘、物種進(jìn)化分析及親緣關(guān)系鑒定、作物種群劃分、雜種優(yōu)勢(shì)分析及分子育種等研究。

遺傳標(biāo)記是在遺傳分析上能反映遺傳多樣性并用作標(biāo)記的基因，能表述出生物的某一獨(dú)特特征，更能將生物性狀具象化。從技術(shù)水平上看，遺傳標(biāo)記可被細(xì)致地劃分為形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生物化學(xué)標(biāo)記以及分子標(biāo)記等類型[5]。分子標(biāo)記自出現(xiàn)以來，具有數(shù)量多、檢測(cè)周期短、可高通量檢測(cè)和對(duì)環(huán)境影響小等諸多優(yōu)勢(shì)[6]。這些特點(diǎn)使得分子標(biāo)記在育種工作中得到了迅猛的發(fā)展，為遺傳研究帶來了革命性的變革。分子標(biāo)記短時(shí)間內(nèi)迅猛發(fā)展，類型可達(dá)數(shù)十種，根據(jù)檢測(cè)原理和染色體特性的不同，分子標(biāo)記可進(jìn)一步細(xì)分為多種類型，例如基于限制性內(nèi)切酶和PCR技術(shù)的分子標(biāo)記有RFLP、AFLP和CAPS；基于PCR技術(shù)和分子電泳的分子標(biāo)記則有RAPD、SSR、ISSR和SRAP等；而基于高通量測(cè)序或芯片雜交的分子標(biāo)記技術(shù)則包括SNP，這些分子標(biāo)記為遺傳分析和育種工作提供了強(qiáng)有力的工具

支持[7]。

分子標(biāo)記的深入開發(fā)與日益廣泛的應(yīng)用也對(duì)其高通量快速檢測(cè)技術(shù)提出了更高需求。高通量檢測(cè)技術(shù)是能同時(shí)對(duì)多個(gè)樣本或多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)的先進(jìn)技術(shù)與方法，以其高檢測(cè)量、低成本、高效率的顯著優(yōu)勢(shì)，成為檢驗(yàn)檢測(cè)方法研發(fā)與標(biāo)準(zhǔn)制定的重要發(fā)展趨勢(shì)，更是國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究的熱點(diǎn)與焦點(diǎn)[8]。植物分子標(biāo)記的高通量快速檢測(cè)技術(shù)可大致分為3個(gè)主要步驟：植物樣本獲取，植物DNA提取，植物樣本檢測(cè)。本文以高通量植物樣本采集、高通量提取植物基因組DNA及高通量快速檢測(cè)技術(shù)3個(gè)方面對(duì)分子標(biāo)記檢測(cè)的整個(gè)過程進(jìn)行綜合描述，并對(duì)植物分子標(biāo)記的高通量快速檢測(cè)過程做出總結(jié)與展望，以期對(duì)未來檢測(cè)流程的改良優(yōu)化及創(chuàng)新提供理論參考。

1 高通量植物樣本采集

植物樣本的類型豐富，包括葉片、芽、根、種子等。相對(duì)來說，葉片采集更便捷，且用葉片提取的DNA純度更高，所以通常采集植物新鮮葉片來提取DNA以便后續(xù)檢測(cè)。植物葉片采集通常采用兩種方式，分別是人工取樣和智能采集系統(tǒng)。

1.1 人工取樣 無論是實(shí)驗(yàn)室作物還是大田作物，傳統(tǒng)人工取樣仍舊是育種工作者的首要選擇。人工取樣靈活性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、具有可控性，但是速度慢，耗費(fèi)更多時(shí)間和精力，人工成本相對(duì)較高，且由于人為因素的干擾，樣本可靠性和一致性有待提高。

1.2 智能采集系統(tǒng) 2017年法國(guó)ALCI公司研發(fā)出高通量植物樣品智能采集系統(tǒng)SAS，利用自動(dòng)化機(jī)械臂采集植物葉片，轉(zhuǎn)移至多孔板中，技術(shù)采樣通量是人工采樣的5倍。美國(guó)Brooks公司研發(fā)的手持式植物葉圓片采樣及編碼系統(tǒng)PlantTrak Hx，可用于實(shí)驗(yàn)室或野外，采樣量每臺(tái)可達(dá)1188個(gè)，適用于玉米、棉花、大豆等幾乎所有植株葉片。這些智能采集系統(tǒng)相較于人工取樣來說，雖省工省時(shí)，提高了樣本采集一致性，但同時(shí)，也存在必須單個(gè)取樣并轉(zhuǎn)移，且轉(zhuǎn)移過程中會(huì)出現(xiàn)樣本污染的情況。因此為實(shí)現(xiàn)更加便捷、快速的高通量檢測(cè)，研發(fā)一種低成本、高通量、高效率的葉片采集裝置是非常必要的。

2 高通量提取植物基因組DNA

隨著植物分子標(biāo)記及檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)大規(guī)模植物DNA提取的需求急劇上升，因而開發(fā)出高通量快速DNA抽提的方法尤為重要。在眾多提取方法中，十二烷基硫酸鈉（SDS）法、TPS法、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法、磁珠法及堿煮法均展現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景。這些方法在原理上殊途同歸，均涵蓋細(xì)胞裂解破碎、DNA釋放、雜質(zhì)去除及DNA純化等核心步驟[9]，確保了高效、準(zhǔn)確地獲取純凈的植物DNA。

單志等[9]結(jié)合了傳統(tǒng)SDS法提取DNA的穩(wěn)健性與Silica吸附柱純化DNA的高效性，成功創(chuàng)設(shè)了一種改良版的SDS法，此法具備廣泛適用性，經(jīng)過實(shí)踐驗(yàn)證，該方法成功地從23種植物中提取出了高質(zhì)量的基因組DNA。侯澤菁等[10]在對(duì)多種提取方法進(jìn)行系統(tǒng)分析的基礎(chǔ)上，亦對(duì)SDS法進(jìn)行了優(yōu)化與創(chuàng)新，成功打造了一種既低成本又高質(zhì)量的快速提取方法，此方法在保障DNA提取質(zhì)量的同時(shí)，還能有效簡(jiǎn)化操作流程、降低試驗(yàn)成本，為高通量樣本DNA的提取工作提供了強(qiáng)有力的支持。

張友昌等[11]深入比較了多種植物DNA提取方法，經(jīng)過精心優(yōu)化與改進(jìn)，在提取流程中引入了緩沖液預(yù)處理技術(shù)，并在TPS緩沖液中加入PVP40，這種新方法不僅支持批量取樣，還極大地簡(jiǎn)化了操作步驟，摒棄了氯仿和異戊醇的使用，從而實(shí)現(xiàn)了低成本、快速、高通量的棉花葉片DNA提取。藍(lán)碧秀等[12]對(duì)CTAB法進(jìn)行了改進(jìn)，能夠同時(shí)提取不同樣本的基因組DNA，簡(jiǎn)便、快捷、高通量，特別是在微量提取微胚乳玉米基因組DNA方面，充分滿足了以PCR為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)研究的需求，為相關(guān)領(lǐng)域的研究提供了有力支持。

磁珠法提取DNA主要有兩種類型：直接磁珠法和間接磁珠法。直接磁珠法是指磁珠直接與DNA結(jié)合，然后通過磁場(chǎng)將磁珠—DNA復(fù)合物從混合物中分離出來。間接磁珠法是指磁珠先與某種能夠與DNA結(jié)合的物質(zhì)（抗體或生物素等）結(jié)合，然后再通過這種物質(zhì)與DNA結(jié)合，最后通過磁場(chǎng)將磁珠—物質(zhì)—DNA的復(fù)合物從混合物中分離出來。周悅等[13]在磁珠法的基礎(chǔ)上，開發(fā)了一套半自動(dòng)DNA提取儀及不同作物基因組提取流程，具有簡(jiǎn)單、高效、準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)，且提取過程無毒，安全系數(shù)高。

堿煮法是通過高溫強(qiáng)堿溶液破除植物細(xì)胞壁、變性蛋白質(zhì)，促使DNA釋放。徐宗昌等[14]利用改良?jí)A裂解法，提取轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA，無需加熱煮沸，上清液可直接用于PCR反應(yīng)。朱先飛

等[15]則對(duì)堿煮法進(jìn)行了深入的改進(jìn)，創(chuàng)制出一種更為快速、高通量且低成本的油菜DNA提取方法，該方法無需研磨，流程更加簡(jiǎn)化，成本更為低廉，非常適合品種篩選和分子標(biāo)記輔助選擇等大規(guī)模應(yīng)用。俎峰等[16]則進(jìn)一步通過簡(jiǎn)化堿裂解法與高通量研磨器樣品混勻儀的結(jié)合，提供了一套集成化快速、高通量、低成本油菜DNA提取方案，該方法可在10h內(nèi)完成上萬份DNA樣品的提取，極大地提高了DNA獲取效率。

3 分子標(biāo)記的高通量快速檢測(cè)技術(shù)

3.1 CAPS標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)與dCAPS標(biāo)記檢測(cè)技術(shù) 酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)（CAPS，Cleaved amplified polymorphic sequence），又稱限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-RFLP），是PCR技術(shù)與RFLP技術(shù)相結(jié)合的方法[17]。其運(yùn)作原理在于，針對(duì)DNA片段在特定酶切位點(diǎn)的堿基變異情況設(shè)計(jì)PCR引物，采用專一性的限制性內(nèi)切酶，對(duì)PCR擴(kuò)增后的DNA片段進(jìn)行酶切處理。這一過程導(dǎo)致不同的電泳圖譜的產(chǎn)生，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本多態(tài)性的準(zhǔn)確鑒定。CAPS技術(shù)在應(yīng)用上存在固有的局限性，即只能有效檢測(cè)位于酶切位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性（SNP），而對(duì)于酶切位點(diǎn)之外的SNP則無能為力。為了彌補(bǔ)這一不足，研究人員進(jìn)行了深入改造，通過人為引入錯(cuò)配堿基構(gòu)建新的酶切位點(diǎn)，對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行特定的酶切處理，再通過凝膠電泳技術(shù)對(duì)這些多態(tài)性進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)，這一標(biāo)記技術(shù)被稱為衍生限制性內(nèi)切酶多態(tài)性標(biāo)記（稱為dCAPS，Derived cleaved amplified polymorphic sequences）[7]。

dCAPS技術(shù)的出現(xiàn)，不僅克服了CAPS技術(shù)的局限，而且在操作流程上顯得更為簡(jiǎn)便，對(duì)DNA模板的純度要求也相對(duì)較低，僅需借助常規(guī)的實(shí)驗(yàn)儀器即可順利完成。該技術(shù)的缺點(diǎn)是有概率形成一些非常用的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，增加了檢測(cè)成本。

王亦學(xué)等[18]通過克隆得到谷子SiSAP8基因，經(jīng)多態(tài)性分析后，在第81位的SNP位點(diǎn)上成功開發(fā)了dCAPS標(biāo)記，這一研究為后期谷子功能鑒定及關(guān)聯(lián)分析提供了有力依據(jù)。在植物育種領(lǐng)域，dCAPS技術(shù)同樣展現(xiàn)出了其強(qiáng)大的潛力。郭嗣斌等[19]利用dCAPS分子標(biāo)記定位了一個(gè)穗長(zhǎng)主效QTL——PL9，通過篩選合適的標(biāo)記，成功地提高了水稻穗長(zhǎng)這一重要產(chǎn)量性狀的育種效率，為育種工作者節(jié)約了成本。楊廣闊等[20]通過雙重參考日本晴序列和93-11序列，針對(duì)一個(gè)涉及稻瘟病抗性材料P400突變基因所定位區(qū)間，結(jié)合dCAPS策略，展示了高效開發(fā)SNP-dCAPS標(biāo)記的實(shí)例，結(jié)果表明，建立的方法對(duì)利用93-11為親本，開展水稻功能基因分離等工作有積極的借鑒意義。綜上所述，dCAPS技術(shù)雖然存在一定的局限，但其在遺傳研究和作物育種領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響。

3.2 KASP基因分型技術(shù) 競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR（KASP，Kompetitive allele specific PCR），即KASP技術(shù)，最初由英國(guó)KBioscience公司研發(fā)，這種技術(shù)利用等位基因特異性寡核苷酸延伸和熒光共振能量轉(zhuǎn)移（ERET）來進(jìn)行基因分型[21]。KASP技術(shù)原理是針對(duì)于目標(biāo)序列的SNP位點(diǎn)，設(shè)計(jì)3條引物，其中2條特異性上游引物僅在引物末端有堿基差異且攜帶特殊接頭，第3條引物是通用的下游引物，最終根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)來確定基因型，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的基因分型。KASP技術(shù)的研發(fā)開創(chuàng)了一種高效、精準(zhǔn)的基因分型技術(shù)，通過在PCR過程中引入熒光信號(hào)，KASP技術(shù)大大簡(jiǎn)化了基因分型的操作流程，降低了成本，適用于各種通量的基因分型試驗(yàn)，并提高了分型的準(zhǔn)確性和靈敏度[22]。這項(xiàng)技術(shù)在分子育種、疾病診斷、人類遺傳學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景?？偟膩碚f，KASP技術(shù)的出現(xiàn)為基因分型提供了一種快速、可靠的解決方案，不僅可以幫助科研人員更深入地了解等位基因間的差異，還可以在醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域?yàn)榧膊≡\斷和作物改良提供有力支撐。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，KASP技術(shù)將在未來發(fā)揮更加重要的作用，推動(dòng)基因分型領(lǐng)域的持續(xù)發(fā)展。

鄧釗等[23]借助參考基因組及水稻測(cè)序數(shù)據(jù)庫進(jìn)行SNP變異位點(diǎn)分析，開發(fā)出3個(gè)KASP連鎖標(biāo)記，可用于水稻Bph43基因型鑒定。趙傳超等[24]成功開發(fā)了水稻稻瘟病抗性基因Pi2的KASP分子標(biāo)記，建立了水稻Pi2基因的KASP基因分型體系，對(duì)遺傳育種及品種改良研究有重要的應(yīng)用價(jià)值。Kang等[25]開發(fā)并驗(yàn)證了水稻條紋病毒抗性基因的KASP分子標(biāo)記，具有高通量、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)。Addison等[26]利用KASP技術(shù)分析了水稻香味基因BADH2的297個(gè)基因組位點(diǎn)，最終確定了9個(gè)SNP的KASP標(biāo)記，并成功鑒定水稻香味基因。通過該檢測(cè)技術(shù)，研究人員可精確進(jìn)行水稻基因分型，也可以更好地了解水稻基因的遺傳多樣性，加速了從實(shí)驗(yàn)室到田間的轉(zhuǎn)換過程，為育種改良奠定了基礎(chǔ)。這些研究為水稻育種研究提供了重要的技術(shù)支持，有助于培育出更優(yōu)良的水稻品種，推動(dòng)了水稻種質(zhì)資源的合理利用和保護(hù)。

3.3 基于芯片的分子標(biāo)記檢測(cè)技術(shù) 在分子育種中，研究者往往需要借助高效的基因分型技術(shù)手段，對(duì)海量種質(zhì)資源進(jìn)行基因型檢測(cè)，從而完成更加高效、精準(zhǔn)的品種選育。1991年Affymetrix公司的Fordor首次利用光蝕刻技術(shù)制備了基于玻片的微陣列，使生物芯片成為可實(shí)際應(yīng)用的分子生物學(xué)技術(shù)，為高通量分子標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)開辟了新的道路。如今，芯片技術(shù)已經(jīng)得到了長(zhǎng)足的發(fā)展。其中DNA芯片是應(yīng)用最廣泛的一種。DNA芯片可用于SNP位點(diǎn)檢測(cè)，為基因定位提供了重要工具[27]。同時(shí)，芯片技術(shù)的不斷創(chuàng)新和發(fā)展進(jìn)步，進(jìn)一步提高了基因分型的效率和準(zhǔn)確性?；蛐酒煞譃楣滔嘈酒鸵合嘈酒?。固相芯片主要用于檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性（SNP）等標(biāo)記，而液相芯片因其高通量特性在大規(guī)模樣本處理中表現(xiàn)優(yōu)異，研究者可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康募白陨硇枨筮x擇合適的芯片類型，以達(dá)到預(yù)期效果。綜合來看，DNA芯片技術(shù)的發(fā)展在基因分型領(lǐng)域發(fā)揮著不可替代的作用。通過結(jié)合SNP檢測(cè)和分型技術(shù)，DNA芯片為基因定位和功能基因組學(xué)研究提供了重要工具和支撐。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，基因芯片的應(yīng)用范圍和效率將進(jìn)一步提升，為分子育種研究和其他領(lǐng)域的基因分型工作帶來更多的可能性和機(jī)遇。

3.3.1 固相芯片檢測(cè)技術(shù) 固相基因芯片市場(chǎng)中，應(yīng)用最多的檢測(cè)芯片主要來自兩大廠家，Illumina和Affymetrix。Illumina采用微球芯片生產(chǎn)工藝，通過微米級(jí)氧化硅微球固定寡核苷酸探針，每個(gè)微球耦合多條探針，可檢測(cè)1個(gè)SNP位點(diǎn)。探針設(shè)計(jì)中，Address序列識(shí)別微球身份，Probe序列與DNA片段雜交[28-29]。掃描儀可檢測(cè)紅綠熒光，區(qū)分堿基。該技術(shù)高通量、準(zhǔn)確可靠，但需要高標(biāo)準(zhǔn)的探針設(shè)計(jì)。在玉米和小麥遺傳研究中[30-31]，Illumina芯片技術(shù)可用于構(gòu)建連鎖圖譜和基因分型，為遺傳機(jī)制研究和分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)。

Affymetrix的基因芯片利用原位光刻合成技術(shù)，在基片上直接固定和合成探針。在基片上進(jìn)行羥基化處理，并使用光敏感的保護(hù)基團(tuán)保護(hù)羥基；光刻掩膜遮擋，只有受光照射部位的羥基脫保護(hù)，激活進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)；通過多輪反應(yīng)，逐步合成DNA探針長(zhǎng)鏈；探針鏈與基因組DNA雜交后顯色，激光進(jìn)行掃描完成SNP位點(diǎn)分析[7]。Affymetrix的Axiom芯片可實(shí)現(xiàn)基因組DNA的精準(zhǔn)檢測(cè)。

3.3.2 液相芯片檢測(cè)技術(shù) 液相芯片體系由許多均一大小的圓形微球構(gòu)成，每個(gè)微球固定不同的探針分子，懸浮于液相體系形成液相芯片系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)多種分子同時(shí)檢測(cè)，即xMAP技術(shù)[32]。1997年Luminex公司推出這項(xiàng)技術(shù)，使用不同比例紅色熒光染料標(biāo)記微球，編碼產(chǎn)生百種以上熒光編號(hào)，xTAG技術(shù)將特異探針與編碼微球結(jié)合，將不同探針通過編碼微球區(qū)分，待測(cè)樣本與探針—微球復(fù)合物雜交，通過流式細(xì)胞儀一次完成多種靶序列鑒定，該技術(shù)可應(yīng)用于不同植物，進(jìn)行種質(zhì)鑒定、遺傳研究、全基因組分析和育種研究[33-35]。

Illumina的微球芯片、Affymetrix的原位合成芯片以及Luminex公司的液相芯片均可實(shí)現(xiàn)高通量快速檢測(cè)。微球芯片試驗(yàn)只需1次雜交，最快2d可得結(jié)果，效率高；原位合成芯片需2次雜交，工作流程較復(fù)雜，檢測(cè)周期較長(zhǎng)；液相芯片需要樣本處理、雜交、擴(kuò)增建庫等步驟，時(shí)間較長(zhǎng)。無論是固相芯片還是液相芯片，均適用于高通量基因分型，涵蓋幾萬至幾十萬檢測(cè)位點(diǎn)。

3.4 靶向測(cè)序基因型檢測(cè)技術(shù) 自1977年第一代測(cè)序技術(shù)問世以來，測(cè)序技術(shù)不斷發(fā)展，從Sanger測(cè)序發(fā)展至二代測(cè)序，再到如今的三代全長(zhǎng)測(cè)序，測(cè)序成本有所降低。然而，對(duì)于大規(guī)模育種計(jì)劃中成千上萬樣本的全基因組測(cè)序仍面臨高成本和數(shù)據(jù)處理挑戰(zhàn)。為了提高效率、降低成本，簡(jiǎn)化的基因組測(cè)序技術(shù)（GBS，Genotyping by sequence）逐漸受到關(guān)注。其中，經(jīng)典的GBS技術(shù)原理是利用限制性內(nèi)切酶等手段來降低基因組的復(fù)雜程度，再結(jié)合高通量測(cè)序，獲取標(biāo)記信息，實(shí)現(xiàn)基因分型[36]。在高質(zhì)量參考基因組和圖譜的基礎(chǔ)上，GBS技術(shù)能夠用較小的測(cè)序量獲取高密度全基因組覆蓋的分子標(biāo)記，因此得到廣泛應(yīng)用。冷益豐等[37]利用GBS技術(shù)，對(duì)大涼山360份玉米地方品種資源進(jìn)行親緣關(guān)系鑒定與遺傳分析，分成兩大類群，并對(duì)檢測(cè)到的418個(gè)基因進(jìn)行功能注釋，為大涼山地區(qū)玉米品種資源的改良及保護(hù)提供了理論基礎(chǔ)。

基于GBS技術(shù)的發(fā)展，研究者提出了靶向測(cè)序基因型檢測(cè)技術(shù)（GBTS，Genotyping by target sequencing），它針對(duì)特定靶向位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序和基因型檢測(cè)。這種靶向的簡(jiǎn)化基因組測(cè)序可對(duì)已知區(qū)域及位點(diǎn)測(cè)序，摒除冗余位點(diǎn)，減少了生信分析數(shù)據(jù)量，提高了分析效率。GBTS技術(shù)包括基于多重PCR的GenoPlexs技術(shù)和基于液相探針捕獲的GenoBaits技術(shù)。基于多重PCR的靶向測(cè)序技術(shù)結(jié)合了多重PCR和二代測(cè)序，首先擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域，通過PCR或酶連接引入接頭序列，構(gòu)建擴(kuò)增子文庫，再進(jìn)行測(cè)序和生物信息學(xué)分析，獲取目標(biāo)區(qū)域序列信息，實(shí)現(xiàn)基因檢測(cè)[38]。基于液相探針捕獲的技術(shù)是將目標(biāo)探針與靶向序列互補(bǔ)結(jié)合，基于分子雜交和二代測(cè)序，利用生物素探針捕獲目標(biāo)區(qū)域，然后通過鏈霉親和素和磁珠吸附技術(shù)完成捕獲和測(cè)序，實(shí)現(xiàn)基因型分析[39]。以上這些技術(shù)均具有高通量、準(zhǔn)確度高、成本低等優(yōu)點(diǎn)。石家莊博瑞迪公司利用GBST技術(shù)自主研發(fā)了水稻1K和40K、大豆40K、玉米45K、小麥16K和40K的液相芯片，展示了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用性[38]。Shen等[40]評(píng)估了372份西蘭花材料的遺傳多樣性、親緣關(guān)系、群體結(jié)構(gòu)和指紋圖譜，選擇了1067個(gè)SNPs通過靶測(cè)序（GBTS）進(jìn)行基因分型，100個(gè)SNP通過KASP進(jìn)行基因型分型，將372材料分為2個(gè)主要類群。這是首次對(duì)中國(guó)西蘭花的多樣性和種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行綜合研究，也是GBTS和KASP技術(shù)在西蘭花遺傳特征鑒定中的首次應(yīng)用，為中國(guó)西蘭花的育種研究提供了豐富信息。

4 結(jié)語與展望

分子標(biāo)記具有諸多優(yōu)勢(shì)且在作物遺傳育種中發(fā)揮著重要作用，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記的檢測(cè)將更加高效、高通量、成本更低，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)程序化與自動(dòng)化。

樣本采集作為分子標(biāo)記檢測(cè)流程的第1步，很大程度上制約著檢測(cè)流程和育種效率，尤其是目前仍以人工取樣為主的育種實(shí)驗(yàn)室及科研單位。人工取樣成本高、速度慢、效率低，而智能采集系統(tǒng)雖然節(jié)省人力資源，但是在對(duì)樣本進(jìn)行多次轉(zhuǎn)移的過程中容易出現(xiàn)污染，取樣質(zhì)量及效率上有待改進(jìn)以實(shí)現(xiàn)高通量精準(zhǔn)取樣。對(duì)此，研究者可針對(duì)這些缺陷進(jìn)行改良及創(chuàng)新，探索新的取樣方法。例如，在目前的基礎(chǔ)上對(duì)采樣裝置進(jìn)行創(chuàng)新，做到連續(xù)取樣甚至無限取樣，降低人力和時(shí)間成本，甚至在取樣時(shí)同時(shí)破碎樣本，省去轉(zhuǎn)移步驟，減少誤差和污染風(fēng)險(xiǎn)。此外，可結(jié)合堿煮法等DNA提取方法處理采集的樣本，或簡(jiǎn)化處理程序，在添加試劑提取高純度DNA樣本的基礎(chǔ)上，直接進(jìn)行PCR反應(yīng)，大幅降低時(shí)間和試劑成本。這些創(chuàng)新方法有助于提高樣本取樣和DNA提取過程的效率和質(zhì)量。

CAPS標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)、dCAPS標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)、KASP基因分型技術(shù)、基于芯片的分子標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)與靶向測(cè)序基因型檢測(cè)技術(shù)均可以對(duì)DNA樣本進(jìn)行高通量、高準(zhǔn)確性、高靈敏度、快速的多重檢測(cè)。但是，這些先進(jìn)技術(shù)存在價(jià)格昂貴、設(shè)計(jì)和操作復(fù)雜、擴(kuò)增產(chǎn)物難以定量、反應(yīng)容易受污染、無法現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)檢測(cè)、缺乏自動(dòng)化等問題，并且都依賴于較高素質(zhì)的專業(yè)操作人員與專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。因此，對(duì)這些技術(shù)進(jìn)行降低成本、簡(jiǎn)化使用流程、提高靈敏度和準(zhǔn)確性方面的優(yōu)化，可以使其在不同領(lǐng)域中被更廣泛地應(yīng)用。

未來分子標(biāo)記的高通量檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展方向涵蓋以下幾個(gè)關(guān)鍵方面。首先，結(jié)合CRISPR/Cas系統(tǒng)，能實(shí)現(xiàn)高靈敏度、高精度的多種基因修飾產(chǎn)物檢測(cè)，與LAMP、RPA等技術(shù)結(jié)合可快速準(zhǔn)確地檢測(cè)包括SNP分子標(biāo)記和基因編輯在內(nèi)的復(fù)雜序列信息[41]。其次，即時(shí)檢驗(yàn)技術(shù)（POCT）結(jié)合PCR和膠體金免疫層析技術(shù)可在田間實(shí)現(xiàn)即時(shí)檢測(cè)，幫助育種工作者實(shí)現(xiàn)快速篩查和基因型分析。另外，結(jié)合化學(xué)發(fā)光技術(shù)、ELISA和電化學(xué)技術(shù)等IVD診斷技術(shù)以及質(zhì)譜分析技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)高通量快速篩查和基因型精準(zhǔn)分析。在技術(shù)創(chuàng)新的基礎(chǔ)上，應(yīng)著力降低設(shè)備和試劑成本，綜合多種技術(shù)優(yōu)勢(shì)，研發(fā)更經(jīng)濟(jì)、高效、精準(zhǔn)的檢測(cè)技術(shù)，這些發(fā)展方向也有望為分子標(biāo)記的高通量檢測(cè)帶來新的突破，助力育種工作的發(fā)展和進(jìn)步。

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